TRẦN THẢO HƯƠNG TRIỂN KHAI mô HÌNH gây độc tế bào GAN BẰNG ETHANOL TRÊN ĐỘNG vật THỰC NGHIỆM và áp DỤNG ĐÁNH GIÁ tác DỤNG của ME RỪNG

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI TRẦN THẢO HƯƠNG TRIỂN KHAI MƠ HÌNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO GAN BẰNG ETHANOL TRÊN ĐỘNG VẬT THỰC NGHIỆM VÀ ÁP DỤNG ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG CỦA ME RỪNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2019 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI TRẦN THẢO HƯƠNG MÃ SINH VIÊN: 1401310 TRIỂN KHAI MƠ HÌNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO GAN BẰNG ETHANOL TRÊN ĐỘNG VẬT THỰC NGHIỆM VÀ ÁP DỤNG ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG CỦA ME RỪNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: PGS TS Nguyễn Thùy Dương ThS Ngô Thanh Hoa Nơi thực hiện: Bộ môn Dược lực HÀ NỘI - 2019 LỜI CẢM ƠN Để hồn thành khóa luận, em xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc tới thầy cơ, gia đình bạn bè – người quan quan tâm, giúp đỡ, ủng hộ em thời gian qua Đầu tiên, tất lòng kính trọng, em xin gửi lời biết ơn sâu sắc tới PGS TS Nguyễn Thùy Dương ThS Ngô Thanh Hoa, người thầy trao hội cho em thực đề tài tận tình hướng dẫn bảo em Trong q trình thực hiện, theo sát, cho em thiếu sót, đưa thêm lời khuyên truyền cho em động lực để hoàn thành đề tài Tiếp theo, em xin gửi lời cảm ơn đến chị Nguyễn Thị Uyên – người cộng sự, người tiền bối đồng hành, giúp đỡ, động viên em suốt trình thực đề tài Những ngày tháng làm việc chị giúp em học hỏi thêm nhiều kiến thức rút kinh nghiệm quý báu Em xin chân thành cảm ơn đến tồn thể thầy cơ, anh chị kĩ thuật viên, anh chị, bạn nghiên cứu Bộ môn Dược lực giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi giúp em thực đề tài Em xin cảm ơn người thầy tận tâm dạy dỗ em năm tháng học tập mái trường Đại học Dược Hà Nội thân thương Thầy cô gương sáng lối sống, học tập cho hệ sinh viên chúng em Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn tới bạn bè bên cạnh, sẻ chia niềm vui, nỗi buồn đặc biệt cảm ơn gia đình ln ủng hộ, tin tưởng chỗ dựa tinh thần cho hoàn cảnh Hà Nội, tháng năm 2019 Sinh viên Trần Thảo Hương MỤC LỤC DANH MỤC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, BIỂU ĐỒ ĐẶT VẤN ĐỀ TỔNG QUAN 1.1 Bệnh gan rượu 1.1.1 Định nghĩa 1.1.2 Dịch tễ 1.1.3 Cơ chế bệnh sinh bệnh gan rượu 1.1.4 Các giai đoạn bệnh gan rượu 1.1.5 Điều trị bệnh gan rượu 1.2 Các mơ hình gây độc tế bào gan ethanol thực nghiệm 1.2.1 Mơ hình gây độc tế bào gan cấp ethanol 1.2.2 Mơ hình gây độc tế bào gan mạn ethanol 11 1.3 Thông tin dược liệu Me rừng 14 1.3.1 Đặc điểm thực vật 14 1.3.2 Phân bố phận dùng 14 1.3.3 Thành phần hóa học Me rừng 15 1.3.4 Tác dụng dược lý Me rừng 15 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị nghiên cứu 18 2.1.1 Nguyên liệu nghiên cứu 18 2.1.2 Động vật thí nghiệm 19 2.1.3 Hóa chất, thuốc thử, thiết bị nghiên cứu 19 2.2 Nội dung thiết kế nghiên cứu 19 2.3 Phương pháp nghiên cứu 20 2.3.1 Phương pháp triển khai mơ hình gây độc tế bào gan cấp ethanol 20 2.3.2 Phương pháp triển khai mơ hình gây độc tế bào gan mạn ethanol 21 2.3.3 Phương pháp đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào gan cao định chuẩn Me rừng mơ hình gây độc tế bào gan cấp ethanol 22 2.3.4 Phương pháp xác định thông số nghiên cứu 24 2.4 Phương pháp xử lý số liệu 28 KẾT QUẢ 29 3.1 Kết triển khai mơ hình gây độc tế bào gan ethanol 29 3.1.1 Kết triển khai mơ hình gây độc tế bào gan cấp ethanol 29 3.1.2 Kết triển khai mơ hình gây độc tế bào gan mạn ethanol 32 3.2 Kết đánh giá tác dụng bảo vệ gan cao định chuẩn Me rừng mơ hình gây độc tế bào gan cấp ethanol 35 3.2.1 Ảnh hưởng cao định chuẩn Me rừng đến hoạt độ ASAT ALAT huyết mơ hình gây độc tế bào gan cấp ethanol 35 3.2.2 Ảnh hưởng cao định chuẩn Me rừng đến hàm lượng MDA gan mơ hình gây độc tế bào gan cấp ethanol 37 3.2.3 Ảnh hưởng cao định chuẩn Me rừng đến hàm lượng GSH gan mơ hình gây độc tế bào gan cấp ethanol 38 3.2.4 Ảnh hưởng cao định chuẩn Me rừng đến hàm lượng SOD gan mơ hình gây độc tế bào gan cấp ethanol 39 3.2.5 Ảnh hưởng cao định chuẩn Me rừng đến hình ảnh vi thể gan mơ hình gây độc tế bào gan cấp ethanol 40 BÀN LUẬN 42 4.1 .Về triển khai mơ hình gây độc tế bào gan cấp ethanol 42 4.2 Về triển khai mơ hình gây độc tế bào gan mạn ethanol 45 4.3 Về đánh giá tác dụng bảo vệ gan cao định chuẩn Me rừng mơ hình gây độc tế bào gan cấp ethanol 47 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT ADH Alcohol dehydrogenase ALDH Aldehyd dehydrogenase ALP Alkalin phosphatase ALAT Alanin aminotransferase ASAT Aspartat transaminase CRP C-reactive protein CYP2E1 Cytocrom P450 2E1 DPPH 2,2-diphenylpicrylhydrazyl DTNB 5,5'-Dithiobis (2-nitro benzoic acid) GGTP Gamma-glutamyltransferase GSH Glutathion GSH-Px Glutathion peroxidase GSSH Glutathion disulfid HDL High-density lipoprotein LDL Low-density lipoprotein MDA Malondialdehyd NBT Nitrotetrazolium clorid ROS Reactive oxygen species SOD Superoxid dismutase TNF-α Tumor necrosis factor alpha TG Triglycerid TBA Acid thiobarbituric DANH MỤC CÁC BẢNG STT Kí hiệu Bảng 1.1 Tên bảng Một số điều kiện tiến hành mơ hình gây độc tế bào gan cấp ethanol Trang Ảnh hưởng ethanol đến hàm lượng MDA, Bảng 3.1 GSH, SOD gan mơ hình gây độc tế 30 bào gan cấp Bảng 3.2 Ảnh hưởng ethanol đến hình ảnh vi thể gan mơ hình gây độc tế bào gan cấp 31 Ảnh hưởng ethanol đến hàm lượng MDA, Bảng 3.3 GSH, SOD gan mơ hình gây độc tế 33 bào gan mạn Bảng 3.4 Ảnh hưởng ethanol đến hình ảnh vi thể gan mơ hình gây độc gan mạn 34 Ảnh hưởng cao định chuẩn me rừng đến Bảng 3.5 hình ảnh vi thể gan mơ hình gây độc tế bào gan cấp 40 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, BIỂU ĐỒ STT Kí hiệu Tên hình Hình 1.1 Ba đường chuyển hóa ethanol gan Hình 1.2 Cơ chế hình thành bệnh gan rượu Hình 2.1 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu 20 Hình 2.2 Hình 2.3 Thiết kế nghiên cứu triển khai mơ hình gây độc tế bào gan cấp ethanol Thiết kế nghiên cứu triển khai mơ hình gây độc tế bào gan mạn ethanol Trang 21 22 Thiết kế nghiên cứu đánh giá tác dụng bảo vệ gan Hình 2.4 cao định chuẩn Me rừng mơ hình gây độc tế bào 23 gan cấp ethanol Hình 2.5 Phản ứng tạo phức MDA TBA 24 Hình 2.6 Phản ứng tạo phức GSH DTNB 25 Hình 2.7 Sơ đồ phản ứng khử anion superoxid NBT 27 10 Hình 3.1 11 Hình 3.2 Ảnh hưởng ethanol đến hoạt độ ASAT ALAT huyết mơ hình gây độc tế bào gan cấp Ảnh hưởng ethanol đến hoạt độ ASAT ALAT huyết mơ hình gây độc tế bào gan mạn 29 32 Ảnh hưởng cao định chuẩn Me rừng đến hoạt độ 12 Hình 3.3 ASAT ALAT huyết mơ hình gây độc 35 tế bào gan cấp ethanol Ảnh hưởng cao định chuẩn Me rừng đến hàm 13 Hình 3.4 lượng MDA gan mơ hình gây độc tế bào gan 37 cấp ethanol Ảnh hưởng cao định chuẩn Me rừng đến hàm 14 Hình 3.5 lượng GSH gan mơ hình gây độc tế bào gan 38 cấp ethanol Ảnh hưởng cao định chuẩn Me rừng đến hàm 15 Hình 3.6 lượng SOD gan mơ hình gây độc tế bào gan cấp ethanol 39 ĐẶT VẤN ĐỀ Rượu nguyên nhân phổ biến gây bệnh gan mạn tính giới dẫn đến 50% ca tiến triển xơ gan tử vong, 4-25% ca tiến triển ung thư gan… [10] Đi với phát kinh tế, mức độ tiêu thụ rượu gia tăng nước châu Á làm tăng tỷ lệ mắc bệnh gan rượu Bệnh gan rượu bao gồm thay đổi bệnh lý từ nhiễm mỡ đến viêm gan xơ gan liên quan đến việc sử dụng rượu [44] Mặc dù bệnh gan rượu gây ảnh hưởng lớn sức khỏe gánh nặng bệnh tật cho toàn xã hội phương pháp điều trị hạn chế Do đó, năm gần đây, hướng nghiên cứu dược liệu có tác dụng điều trị bệnh gan rượu ngày phát triển [24] Dựa kinh nghiệm dân gian, nhiều dược liệu đưa vào đánh giá tác dụng điều trị bệnh gan rượu thu kết khả quan như: sắn dây (Pueraria lobate), nghệ (Curcuma longa), giần sàng (Cnidium monnieri), me rừng (Phyllanthus emblica)… [17], [24], [77] Đặc biệt, me rừng nguồn dược liệu quan trọng có nhiều nghiên cứu đánh giá tác dụng bảo vệ gan mơ hình sử dụng tác nhân khác nhau: ethanol, carbon tetrachlorid (CCl4), paracetamol, arsen, cadmium [17], [18], [33], [62], [77] Ở Việt Nam, me rừng loài phân bố rộng khắp sử dụng phổ biến dân gian để điều trị bệnh gan rượu song chưa có nghiên cứu đầy đủ nhằm đánh giá tác dụng bảo vệ gan me rừng tổn thương rượu Để bước đầu đánh giá hiệu me rừng dược liệu tiềm điều trị bệnh gan rượu, trước tiên cần xây dựng mơ hình động vật thực nghiệm tin cậy, mô bệnh gan rượu người phù hợp với điều kiện Việt Nam Trên giới, mơ hình gây độc tế bào gan ethanol triển khai phổ biến Tuy nhiên, nghiên cứu tồn số điểm chưa thống kết ghi nhận có khác biệt Liều thời gian gây độc yếu tố ảnh hưởng đến thông số phản ánh mức độ tổn thương gan [28], [51], [86] Bên cạnh đó, đường dùng ảnh hưởng đến khả hấp thu ethanol thay đổi nồng độ ethanol máu làm ảnh hưởng đến mức độ tổn thương gan Trong mơ hình gây độc tế bào gan ethanol, thời điểm lấy mẫu ảnh hưởng đến thông số đánh giá mức độ tổn thương gan [15] Ở Việt Nam, nghiên cứu liên quan đến mơ hình gây tổn thương gan ethanol tương đối Do đó, chúng tơi tiến hành nghiên cứu “Triển khai mơ hình gây độc tế bào gan ethanol động vật thực nghiệm áp dụng đánh giá tác dụng me rừng” với mục tiêu sau: Triển khai mơ hình gây độc tế bào gan cấp mạn ethanol động vật thực nghiệm Đánh giá tác dụng bảo vệ gan cao định chuẩn Me rừng Phyllanthus emblica L mơ hình gây độc tế bào gan cấp ethanol ngột hình thành nên nhiều ROS gây stress oxy hóa tổn thương ty thể Với kết này, mơ hình ứng dụng nghiên cứu phát triển hướng điều trị cho bệnh gan rượu sản phẩm có nguồn gốc từ dược liệu Bên cạnh đó, nhiều nghiên cứu khác, mơ hình gây độc tế bào gan cấp ethanol kết hợp với mơ hình gây độc gan mạn ethanol (chế độ ăn uống lỏng có chứa ethanol, truyền ethanol trực tiếp vào dày) Trong hướng nghiên cứu này, mơ hình gây độc tế bào gan cấp ethanol đóng vai trò quan trọng làm tăng tổn thương ethanol gây [69] 4.2 Về triển khai mơ hình gây độc tế bào gan mạn ethanol  Lựa chọn mơ hình Để nghiên cứu tổn thương gan ethanol, nhiều mơ hình gây độc tế bào gan mạn ethanol phát triển: mơ hình đưa ethanol vào nước uống, mơ hình sử dụng chế độ ăn uống lỏng có chứa ethanol, mơ hình truyền ethanol trực tiếp vào dày, mơ hình cho chuột uống ethanol thời gian dài kết hợp với liều cao ethanol Mỗi nghiên cứu có đặc điểm riêng: mơ hình đưa ethanol vào nước uống cần có dụng cụ cho uống đặc biệt để tránh bay ethannol, động vật có ác cảm tự nhiên với việc uống rượu nên dễ gây nước khó gây tổn thương nghiêm trọng [51]; mơ hình truyền ethanol vào dày u cầu kỹ thuật cao, chi phí lớn, động vật dễ bị nhiễm trùng sau thực thủ thuật luồn ống vào dày, đường ống cần trì thời gian dài [40] Hiện nay, mơ hình sử dụng chế độ ăn uống lỏng chứa ethanol thường sử dụng Tuy nhiên, mơ hình sử dụng chế độ ăn uống lỏng có chứa ethanol cần chí phí cao chưa phù hợp với điều kiện nước cần có chế độ ăn uống tiêu chuẩn dụng cụ đặc biệt để tránh ethanol bay hơi, động vật phơi nhiễm với ethanol ngày Song việc uống rượu người thường diễn khoảng thời gian định (vài giờ) ngày Do đó, mơ hình cho chuột uống ethanol dài ngày kết hợp với liều cao ethanol mơ tốt mơ hình uống rượu người mà không cần can thiệp vào chế độ ăn uống động vật phù hợp với điều kiện nước [95] Do đó, chúng tơi lựa chọn mơ hình cho chuột uống ethanol dài ngày kết hợp với liều cao ethanol để tiến hành thử nghiệm Tương tự mơ hình gây độc tế bào gan cấp ethanol, việc sử dụng ethanol dài ngày làm tăng sản xuất ROS, tăng q trình peroxy hóa lipid [99] 45 Từ kinh nghiệm thu sau đợt pilot, mơ hình sử dụng động vật chuột nhắt trắng giống Việc pha ethanol ngày thực trước cho uống từ 5-10 phút Hàng ngày, chuột uống ethanol vào khung cố định Các thông số ASAT, ALAT, MDA, GSH, SOD tiếp tục sử dụng để đánh giá tổn thương ethanol gây tế bào gan  Lựa chọn chế phẩm đối chiếu silymarin Tương tự với mô hình gây độc tế bào gan cấp ethanol, silymarin lựa chọn làm chế phẩm đối chiếu thử nghiệm triển khai mơ hình gây độc té bào gan mạn ẹthanol  Kết triển khai mô hình gây độc tế bào gan mạn ethanol - Hoạt độ ASAT, ALAT huyết Trong nghiên cứu Tong Zhou Zhang Y., lơ chứng bệnh có hoạt độ ASAT, ALAT tăng so với lô chứng sinh lý khác biệt có ý nghĩa thống kê [95], [98] Kết tương tự với nghiên cứu này, hoạt độ ASAT huyết tăng cao nhiều (60%) so với lô chứng sinh lý (p < 0,01) Tuy nhiên, điểm khác biệt so với nghiên cứu trước hoạt độ ALAT huyết tăng 19% so với lơ chứng sinh lý song khơng có ý nghĩa thống kê (p > 0,05) Tương tự mơ hình gây độc cấp ethanol, tổn thương ethanol gây tế bào gan chủ yếu tổn thương ty thể Vì vậy, hoạt độ ASAT huyết tăng cao xuất sớm so với hoạt độ ALAT Ngồi ra, ngun nhân ALAT có xu hướng tăng song chưa có khác biệt lơ chứng bệnh chứng sinh lý thời gian gây độc mơ hình chưa đủ dài (15 ngày), hoạt độ ALAT lô dao động nhiều Các nghiên cứu thực khoảng thời gian dài để tạo tăng mạnh hoạt độ ALAT Chứng dương silymarin giúp cải thiện hoạt độ ASAT, ALAT huyết so với lơ chứng bệnh hoạt độ ASAT có khác biệt (p < 0,01) - Hàm lượng MDA, GSH, SOD gan Các thông số đánh giá mức độ stress oxy hóa có thay đổi tương tự với nghiên cứu trước [95], [98] Quá tải gốc tự gây phá vỡ cấu trúc tế bào, làm tăng peroxy hóa lipid màng tế bào MDA sản phẩm thứ cấp trình peroxy hóa lipid, có vai trò đánh giá mức độ peroxy hóa lipid màng tế bào mức độ tổn thương màng tế bào Hàm lượng MDA tăng đáng kể (290%) so với lô chứng sinh lý (p < 0,01), mức độ tăng thấp so với mơ hình gây độc gan cấp (tăng 427%) Hàm 46 lượng GSH giảm mạnh 83% so với lô chứng sinh lý (p < 0,01), mức độ giảm mạnh so với mơ hình gây độc gan cấp (65%) Khác với hàm lượng GSH, mức độ giảm SOD mơ hình gây độc gan mạn (31%) thấp so với mô hình gây độc gan cấp (45%) Sự giảm hàm lượng GSH, SOD cho thấy: sử dụng ethanol 15 ngày làm giảm chức hệ thống chống oxy hóa tế bào gan Q trình chuyển hóa ethanol tạo nhiều gốc tự do, gây cân chất oxy hóa/chống oxy hóa Để giải tình trạng này, chất chống oxy hóa: GSH, SOD sử dụng để loại bỏ gốc tự do, làm giảm dự trữ GSH, SOD Silymarin liều 100 mg/kg cải thiện rõ rệt thông số MDA (57%), GSH (165%), SOD (38%) so với lô chứng bệnh (p < 0,05) Việc sử dụng ethanol thời gian dài gây tổn thương đáng kể tế bào gan Cơ chế tổn thương tương tự mô hình gây độc tế bào gan cấp ethanol Với kết này, mơ hình sử dụng để đánh giá tác dụng bảo vệ gan dược liệu tiềm tổn thương gan rượu gây Tuy nhiên, mơ hình chưa gây tổn thương nghiêm trọng với tế bào gan việc cho uống ethanol thời gian dài gây stress chuột 4.3 Về đánh giá tác dụng bảo vệ gan cao định chuẩn Me rừng mơ hình gây độc tế bào gan cấp ethanol Nghiên cứu triển khai mơ hình gây độc tế bào gan ethanol: mơ hình cấp (3 liều ethanol 5g/kg cách 12 giờ) mô hình mạn (uống ethanol dài ngày kết hợp với liều cao ethanol) Kết cho thấy mơ hình gây tổn thương đáng kể đến tế bào gan Trong phạm vi nghiên cứu này, lựa chọn mơ hình gây độc tế bào gan cấp ethanol để đánh giá tác dụng bảo vệ gan Me rừng  Lựa chọn mức liều Me rừng Nghiên cứu Reddy cộng khẳng định Me rừng liều 250 mg/kg làm tăng hàm lượng chất chống oxy hóa: GSH, SOD, CAT, GPx làm giảm hoạt tính số enzym gây ôn định tế bào: Na⁺/K⁺-ATPase; Mg2+-ATPase [18] Trong số nghiên cứu khác, Me rừng sử dụng với mức liều 500mg/kg để đánh giá tác dụng bảo vệ gan số mơ hình sử dụng tác nhân khác (CCl4, arsen, cadmium) [31], [33], [43], [68] Nhóm nghiên cứu Chao-Ying Lee đánh giá tác dụng bảo vệ gan me rừng hai mức liều 500 mg/kg 1000 mg/kg mơ hình gây độc gan CCl4 có liều 1000 mg/kg cải thiện thông số ASAT, ALAT huyết so với lô chứng bệnh [43] Từ nghiên cứu công bố, Me rừng thường 47 sử dụng với mức liều khác từ 250-1000 mg/kg để đánh giá tác dụng bảo vệ gan Bên cạnh đó, nhóm nghiên cứu sàng lọc tác dụng bảo vệ gan cao định chuẩn Me rừng mức liều 500 mg/kg, 1000 mg/kg, 2000 mg/kg mơ hình gây độc tế bào gan CCl4 Cả mức liều cải thiện thông số ASAT, ALAT, MDA, GSH, SOD so với lơ chứng bệnh khơng có khác biệt tác dụng bảo vệ gan mức liều [3] Do đó, chúng tơi tiến nhành đánh giá tác dụng bảo vệ gan me rừng mức liều thường sử dụng 500 mg/kg 1000 mg/kg  Kết đánh giá tác dụng bảo vệ gan me rừng mơ hình gây độc tế bào gan cấp ethanol - Hoạt độ ASAT, ALAT huyết Kết nghiên cứu cho thấy mức liều 500 mg/kg 1000 mg/kg làm giảm rõ rệt hoạt độ ASAT huyết (p < 0,01), có xu hướng giảm nhẹ hoạt độ ALAT (p > 0,05) so với lô chứng bệnh Kết tương tự với nghiên cứu khác, cao me rừng liều 250 mg/kg làm giảm rõ rệt hoạt độ ASAT, ALAT chuột bị gây độc ethanol 60 ngày [63] - Hàm lượng MDA, GSH, SOD gan Me rừng chứng minh nhiều nghiên cứu có tác dụng chống oxy hóa thu dọn gốc tự [17], [38], [53] ,[57] Tương tự vậy, kết nghiên cứu cho thấy mức liều cao định chuẩn Me rừng làm giảm thông số MDA, GSH, SOD gan Ở hàm lượng MDA gan, liều 500 mg/kg làm giảm 69% so với lô chứng bệnh (p < 0,05), song liều 1000 mg/kg làm giảm 63% so với chứng bệnh khác biệt khơng có ý nghĩa (p > 0,05) Ở hàm lượng GSH, mức liều cao định chuẩn Me rừng làm tăng hàm lượng GSH gan: liều 500 mg/kg làm tăng 110 %(p < 0,01), liều 1000 mg/kg làm tăng 99% (p < 0,01) so với lô chứng bệnh Kết tương tự hàm lượng SOD, mức liều làm tăng 77% hàm lượng SOD gan so với lô chứng bệnh (p < 0,01) Như vậy, cao định chuẩn me rừng mức liều 500 mg/kg 1000 mg/kg có tác dụng bảo vệ gan mơ hình gây độc gan cấp ethanol Song tác dụng bảo vệ gan liều 500 mg/kg có xu hướng tốt so với liều 1000 mg/kg Trong nhiều công bố trước đây, Me rừng phân lập nghiều thành phần hóa học khác như: quercetin, acid gallic, corilagin acid ellagic Các thành phần chứng minh có tác dụng bảo vệ gan tác nhân gây độc paracetamol, 48 galactosamin, lipopolysacarid cách thu dọn gốc tự do, chống oxy hóa, chống viêm [77] Nghiên cứu Renuka Chaphalkar cộng tác dụng bảo vệ gan Me rừng thu dọn gốc tự tác dụng chống oxy hóa acid ellagic acid galic [17] Các nghiên cứu định hướng cho việc xác định thành phần có hoạt tính Me rừng Việt Nam đồng thời xác định chế tác dụng hoạt chất điều trị bệnh gan rượu nói riêng bệnh gan nói chung 49 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Đã triển khai mơ hình gây độc tế bào gan ethanol chuột nhắt trắng - Mơ hình gây độc tế bào gan cấp ethanol: ethanol sử dụng đường uống với liều 5g/kg cách 12 làm tăng rõ rệt thông số ASAT, MDA 58% 427% đồng thời làm giảm thông số GSH, SOD 65% 45% so với lô chứng bệnh Chứng dương silymarin cải thiện rõ rệt thông số ASAT (40%), MDA (65%), GSH (66%), SOD (45%) so với lô chứng bệnh - Mô hình gây độc tế bào gan mạn ethanol: ethanol sử dụng đường uống ngày đầu với liều 3g/kg (EtOH 35%); ngày với liều 4g/kg (EtOH 40%), ngày cuối liều cao 5g/kg (EtOH 50%) làm tăng đáng kể ASAT, MDA 60% 290%; giảm thông số GSH, SOD 83% 31% so với lô chứng sinh lý Simarin cải thiện rõ rệt thông số ASAT (24%), MDA (57%), GSH (165%), SOD (38%) so với lô chứng bệnh Đã đánh giá tác dụng bảo vệ gan cao định chuẩn Me rừng mơ hình gây độc tế bào gan cấp ethanol Cao định chuẩn Me rừng mức liều 500 mg/kg 1000 mg/kg có tác dụng bảo vệ gan trên mơ hình gây độc tế bào gan cấp ethanol thông qua làm giảm ASAT, ALAT, MDA tăng hoạt tính chống oxy hóa GSH, SOD Kiến nghị Áp dụng mơ hình triển khai để đánh giá tác dụng dược liệu tiềm Hồn thiện mơ hình gây độc tế bào gan ethanol: tiếp cận mơ hình sử dụng chế độ ăn uống lỏng có chứa ethanol kết hợp mơ hình với liều cao ethanol Phân lập, xác định hoạt chất có tác dụng bảo vệ gan Me rừng 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Đỗ Huy Bích (2006), Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, NXB Khoa học Kỹ thuật, tr 260-262 Bộ Y tế (2016), Báo cáo chung Tổng quan ngành y tế năm 2015 Tăng cường y tế sở hướng tới bao phủ chăm sóc sức khỏe tồn dân, Nhà xuất Y học, tr 33 Nguyễn Thùy Dương, Nguyễn Thị Uyên, et al (2019), "Tác dụng bảo vệ tế bào gan cao định chuẩn me rừng mô hình gây tổn thương gan carbon tetraclorid", Tạp chí Dược liệu, 24(2), tr 108-112 Vũ Thị Thu Giang (2018), Đánh giá tác dụng chống viêm thực nghiệm cao tồn phần me rừng (Phyllanthus emblica L Euphorbiaceae), Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ, Trường Đại học Dược Hà Nội Lê Thị Lan Phương, Phạm Huy Kiến Tài, et al (2014), "Đánh giá tác dụng bảo vệ gan bột sấy phun từ đài hoa bụp giấm (Hibiscus sabdariffa L.Malvaceae) chuột nhắt tổn thương tế bào gan cấp tính ethanol", Y Học thành phố Hồ Chí Minh, 18(1), tr 75-79 Nghiêm Thị Thanh Thảo (2014), Nghiên cứu thành phần hóa học me rừng (Phyllanthus emblica L.), Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ, Trường Đại học Dược Hà Nội Nguyễn Bảo Trân, Trần Quang Vinh, et al (2011), "Tác dụng chống oxy hóa bảo vệ gan chùm ngây (Moringa oleiffera Lam Moringaceae)", Tạp chí Dược học, 51(5), tr 25-29 Tiếng Anh Aroor A R., Roy L J., et al (2012), "A proteomic analysis of liver after ethanol binge in chronically ethanol treated rats", Proteome Science Arteel G E (2010), "Animal models of alcoholic liver disease", Dig Dis, 28(6), pp 729-36 10 Asrani S K., Devarbhavi H., et al (2019), "Burden of liver diseases in the world", J Hepatol, 70(1), pp 151-171 11 Bacon Bruce R (2015), Harrison's principles of internal medicine, McGraw Hill Education Medical, pp 2058-2067 12 Baykara B., Micili S C., et al (2014), "The protective effects of carnosine in alcohol-induced hepatic injury in rats", Toxicol Ind Health, 30(1), pp 25-32 13 Bedossa P., Kleiner E David (2016), Acoholic and Non-Alcoholic Fatty Liver Disease: Bench to Bedside, Springer International Publishing, pp 223-242 14 Brandon-Warner E., Walling T L., et al (2012), "Chronic ethanol feeding accelerates hepatocellular carcinoma progression in a sex-dependent manner in a mouse model of hepatocarcinogenesis", Alcohol Clin Exp Res, 36(4), pp 641-53 15 Carson E J., Pruett S B (1996), "Development and characterization of a binge drinking model in mice for evaluation of the immunological effects of ethanol", Alcohol Clin Exp Res, 20(1), pp 132-8 16 Chacko K R., Reinus J (2016), "Spectrum of Alcoholic Liver Disease", Clin Liver Dis, 20(3), pp 419-27 17 Chaphalkar R., Apte K G., et al (2017), "Antioxidants of Phyllanthus emblica L Bark Extract Provide Hepatoprotection against Ethanol-Induced Hepatic Damage: A Comparison with Silymarin", Oxidative Medicine and Cellular Longevity, 2017 18 Damodara Reddy V., Padmavathi P., et al (2010), "Protective Effect of Emblica officinalis Against Alcohol-Induced Hepatic Injury by Ameliorating Oxidative Stress in Rats", Indian J Clin Biochem, 25(4), pp 419-24 19 Demori I., Voci A., et al (2006), "Combined effects of high-fat diet and ethanol induce oxidative stress in rat liver", Alcohol, 40(2006), pp 185-191 20 Devaraj S., Ismail S., et al (2014), "Investigation of antioxidant and hepatoprotective activity of standardized Curcuma xanthorrhiza rhizome in carbon tetrachloride-induced hepatic damaged rats", Scientific World Journal, 2014 21 Develi S., Evran B., et al (2014), "Protective effect of Nigella sativa oil against binge ethanol-induced oxidative stress and liver injury in rats", Chin J Nat Med, 12(7), pp 495-9 22 Dhir H., Agarwal K., et al (1991), "Modifying role of Phyllanthus emblica and ascorbic acid against nickel clastogenicity in mice", Cancer Lett, 59(1), pp 9-18 23 Dhir H., Roy A K., et al (1990), "Modification of clastogenicity of lead and aluminium in mouse bone marrow cells by dietary ingestion of Phyllanthus emblica fruit extract", Mutat Res, 241(3), pp 305-12 24 Ding R B., Tian K., et al (2012), "Herbal medicines for the prevention of alcoholic liver disease: a review", J Ethnopharmacol, 144(3), pp 457-65 25 Gaire B P., Subedi L., et al (2014), "Phytochemistry, pharmacology and medicinal properties of Phyllanthus emblica Linn", Chin J Integr Med, 12(2), pp 77-82 26 Ganju L., Karan D., et al (2003), "Immunomodulatory effects of agents of plant origin", Biomed Pharmacother, 57(7), pp 296-300 27 Ghosh A., Ghosh T., et al (2010), "Silymarin: A review of pharmacological aspects and bioavailability enhancement approaches", Journal of Pharmaceutical Science and Technology, 2(10), pp 348-355 28 Ghosh Dastidar S., Warner J B., et al (2018), "Rodent Models of Alcoholic Liver Disease: Role of Binge Ethanol Administration", Biomolecules, 8(1) 29 Girish C., Pradhan S C (2012), "Hepatoprotective activities of picroliv, curcumin, and ellagic acid compared to silymarin on carbon-tetrachlorideinduced liver toxicity in mice", J Pharmacol Pharmacother., 3(2), pp 149-155 30 Jain A., Soni Manish, et al (2008), "Antioxidant and hepatoprotective activity of ethanolic and aqueous extracts of Momordica dioica Roxb leaves", Journal of Ethnopharmacology, 115(1), pp 61-66 31 Jose J K., Kuttan R (2000), "Hepatoprotective activity of Emblica officinalis and Chyavanaprash", J Ethnopharmacol, 72(1-2), pp 135-40 32 Keegan A., Martini R., et al (1995), "Ethanol-related liver injury in the rat: a model of steatosis, inflammation and pericentral fibrosis", J Hepatol, 23(5), pp 591-600 33 Khandelwal S., Shukla L J., et al (2002), "Modulation of acute cadmium toxicity by Emblica officinalis fruit in rat", Indian J Exp Biol, 40(5), pp 564-70 34 Ki S H., Park O., et al (2010), "Interleukin-22 treatment ameliorates alcoholic liver injury in a murine model of chronic-binge ethanol feeding: role of signal transducer and activator of transcription 3", Hepatology, 52(4), pp 1291-300 35 Kirpich I., Ghare S., et al (2012), "Binge alcohol-induced microvesicular liver steatosis and injury are associated with down-regulation of hepatic Hdac 1, 7, 9, 10, 11 and up-regulation of Hdac 3", Alcohol Clin Exp Res, 36(9), pp 1578-86 36 Koh P H., Mokhtar R A., et al (2012), "Antioxidant potential of Cymbopogon citratus extract: alleviation of carbon tetrachloride-induced hepatic oxidative stress and toxicity", Hum Exp Toxicol, 31(1), pp 81-91 37 Koneru M., Sahu B D., et al (2018), "Capsaicin, the pungent principle of peppers, ameliorates alcohol-induced acute liver injury in mice via modulation of matrix metalloproteinases", Can J Physiol Pharmacol, 96(4), pp 419-427 38 Krishnaveni M., Mirunalini S (2010), "Therapeutic potential of Phyllanthus emblica (amla): the ayurvedic wonder", J Basic Clin Physiol Pharmacol, 21(1), pp 93-105 39 Kumar G Suresh, Nayaka Harish, et al (2006), "Free and bound phenolic antioxidants in amla (Emblica officinalis) and turmeric (Curcuma longa)", Journal of Food Composition and Analysis, 19(5), pp 446-452 40 Lamas-Paz A., Hao F., et al (2018), "Alcoholic liver disease: Utility of animal models", World J Gastroenterol, 24(45), pp 5063-5075 41 Lambert J C., Zhou Z., et al (2003), "Prevention of alterations in intestinal permeability is involved in zinc inhibition of acute ethanol-induced liver damage in mice", J Pharmacol Exp Ther, 305(3), pp 880-6 42 Lazaro R., Wu R., et al (2015), "Osteopontin deficiency does not prevent but promotes alcoholic neutrophilic hepatitis in mice", Hepatology, 61(1), pp 12940 43 Lee C Y., Peng W H., et al (2006), "Hepatoprotective effect of Phyllanthus in Taiwan on acute liver damage induced by carbon tetrachloride", Am J Chin Med, 34(3), pp 471-82 44 Liangpunsakul S., Haber P., et al (2016), "Alcoholic Liver Disease in Asia, Europe, and North America", Gastroenterology, 150(8), pp 1786-97 45 Lieber C S., DeCarli L., et al (1975), "Sequential production of fatty liver, hepatitis, and cirrhosis in sub-human primates fed ethanol with adequate diets", Proc Natl Acad Sci U S A, 72(2), pp 437-41 46 Liu R., Chen Q H., et al (2018), "Ginseng (Panax ginseng Meyer) Oligopeptides Protect Against Binge Drinking-Induced Liver Damage through Inhibiting Oxidative Stress and Inflammation in Rats", 10(11) 47 Mailliard E Mark, Sorrell F Michael (2015), Harrison's principles of internal medicine, McGraw Hill Education Medical, pp 2052-2054 48 Malhi H., Gores G J (2008), "Cellular and molecular mechanisms of liver injury", Gastroenterology, 134(6), pp 1641-54 49 Mandayam S., Jamal M M., et al (2004), "Epidemiology of alcoholic liver disease", Semin Liver Dis, 24(3), pp 217-32 50 Marsano S Luis, Vatsalya V., et al (2016), Alcoholic and Non-Alcoholic Fatty Liver Disease: Bench to Bedside, Springer International Publishing, pp 165-177 51 Mathews Stephanie, Xu Ming-Jiang, et al (2014), Animal Models of Alcoholinduced liver disease: Pathophysiology, Translational Relevance and Challenges, Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, pp G819–G823 52 Muthuraman Arunachalam, Sood Shailja, et al (2011), "The antiinflammatory potential of phenolic compounds from Emblica officinalis L in rat", Inflammopharmacology, 19(6), pp 327-334 53 Nampoothiri S V., Prathapan A., et al (2011), "In vitro antioxidant and inhibitory potential of Terminalia bellerica and Emblica officinalis fruits against LDL oxidation and key enzymes linked to type diabetes", Food Chem Toxicol, 49(1), pp 125-31 54 O'Shea Robert S., Dasarathy Srinivasan, et al (2010), "Alcoholic liver disease", Hepatology, 51(1), pp 307-328 55 Osna N A., Donohue T M., Jr., et al (2017), "Alcoholic Liver Disease: Pathogenesis and Current Management", Alcohol Res, 38(2), pp 147-161 56 Pandey Govind, Sahni Y P (2011), A review on hepatoprotective activity of silymarin, IJRAP, pp 75-79 57 Pientaweeratch S., Panapisal V., et al (2016), "Antioxidant, anti-collagenase and anti-elastase activities of Phyllanthus emblica, Manilkara zapota and silymarin: an in vitro comparative study for anti-aging applications", Pharm Biol, 54(9), pp 1865-72 58 Pinmai K., Chunlaratthanabhorn S., et al (2008), "Synergistic growth inhibitory effects of Phyllanthus emblica and Terminalia bellerica extracts with conventional cytotoxic agents: doxorubicin and cisplatin against human hepatocellular carcinoma and lung cancer cells", World J Gastroenterol, 14(10), pp 1491-7 59 Pinmai K., Hiriote W., et al (2010), "In vitro and in vivo antiplasmodial activity and cytotoxicity of water extracts of Phyllanthus emblica, Terminalia chebula, and Terminalia bellerica", J Med Assoc Thai, 93 Suppl 7, pp S120-6 60 Pramyothin P., Samosorn P., et al (2006), "The protective effects of Phyllanthus emblica Linn extract on ethanol induced rat hepatic injury", J Ethnopharmacol, 107(3), pp 361-364 61 Rajak S., Banerjee S K., et al (2004), "Emblica officinalis causes myocardial adaptation and protects against oxidative stress in ischemic-reperfusion injury in rats", Phytother Res, 18(1), pp 54-60 62 Rasool M K., Sabina E P., et al (2010), "Hepatoprotective and antioxidant effects of gallic acid in paracetamol-induced liver damage in mice", J Pharm Pharmacol, 62(5), pp 638-43 63 Reddy V D., Padmavathi P., et al (2009), "Emblica officinalis protects against alcohol-induced liver mitochondrial dysfunction in rats", J Med Food, 12(2), pp 327-33 64 Rosato V., Abenavoli L., et al (2016), "Pharmacotherapy of alcoholic liver disease in clinical practice", The International Journal of Clinical Practice, 70(2), pp 119-31 65 Saeed S., Tariq P (2007), "Antibacterial activities of Emblica officinalis and Coriandrum sativum against Gram negative urinary pathogens", Pak J Pharm Sci, 20(1), pp 32-5 66 Sai Ram M., Neetu D., et al (2002), "Cyto-protective and immunomodulating properties of Amla (Emblica officinalis) on lymphocytes: an in-vitro study", J Ethnopharmacol, 81(1), pp 5-10 67 Sathesh Kumar S., Ravi Kumar B., et al (2009), "Hepatoprotective effect of Trichosanthes cucumerina Var cucumerina L on carbon tetrachloride induced liver damage in rats", J Ethnopharmacol, 123(2), pp 347-50 68 Sharma A., Sharma M K., et al (2009), "Modulatory role of Emblica officinalis fruit extract against arsenic induced oxidative stress in Swiss albino mice", Chem Biol Interact, 180(1), pp 20-30 69 Shukla S D., Pruett S B., et al (2013), "Binge ethanol and liver: new molecular developments", Alcohol Clin Exp Res, 37(4), pp 550-7 70 Siegmund S V., Haas S., et al (2005), "Animal models and their results in gastrointestinal alcohol research", Dig Dis, 23(3-4), pp 181-94 71 Singal A K., Bataller R., et al (2018), "ACG Clinical Guideline: Alcoholic Liver Disease", Am J Gastroenterol, 113(2), pp 175-194 72 Song Z., Deaciuc I., et al (2006), "Silymarin protects against acute ethanolinduced hepatotoxicity in mice", Alcohol Clin Exp Res, 30(3), pp 407-13 73 Sugimoto Kazushi, Takei Yoshiyuki (2016), Pathogenesis of alcoholic liver disease: Pathogenesis of alcoholic liver disease, Hepatology Research 74 Sumantran V N., Boddul S., et al (2007), "Differential growth inhibitory effects of W somnifera root and E officinalis fruits on CHO cells", Phytother Res, 21(5), pp 496-9 75 Takada Y., Noguchi T., et al (1982), "Superoxide dismutase in various tissues from rabbits bearing the Vx-2 carcinoma in the maxillary sinus", Cancer Res, 42(10), pp 4233-5 76 Tannapfel A., Denk H., et al (2011), "Histopathological diagnosis of nonalcoholic and alcoholic fatty liver disease", Virchows Arch, 458(5), pp 511-23 77 Thilakchand K R., Mathai R T., et al (2013), "Hepatoprotective properties of the Indian gooseberry (Emblica officinalis Gaertn): a review", Food Funct, 4(10), pp 1431-41 78 Thursz Mark, Gual Antoni, et al (2018), "EASL Clinical Practice Guidelines: Management of alcohol-related liver disease", Journal of Hepatology, 69(1), pp 154-181 79 Tsukamoto H., French S W., et al (1985), "Severe and progressive steatosis and focal necrosis in rat liver induced by continuous intragastric infusion of ethanol and low fat diet", Hepatology, 5(2), pp 224-32 80 Tsukamoto H., Mkrtchyan H., et al (2008), "Intragastric ethanol infusion model in rodents", Methods Mol Biol, 447, pp 33-48 81 Wang T., Yang P., et al (2013), "Deletion of circadian gene Per1 alleviates acute ethanol-induced hepatotoxicity in mice", Toxicology, 314(2-3), pp 193-201 82 Wasowicz W., Neve J., et al (1993), "Optimized steps in fluorometric determination of thiobarbituric acid-reactive substances in serum: importance of extraction pH and influence of sample preservation and storage", Clin Chem, 39(12), pp 2522-6 83 WHO (2014), Global status report on noncommunicable diseases 2014, Library Cataloguing-in-Publication Data, pp 25 84 Wu D., Cederbaum A I (2009), "Oxidative stress and alcoholic liver disease", Semin Liver Dis, 29(2), pp 141-54 85 Xiang J., Zhu W., et al (2012), "Effect of juice and fermented vinegar from Hovenia dulcis peduncles on chronically alcohol-induced liver damage in mice", Food Funct, 3(6), pp 628-34 86 Xu J., Tsukamoto H (2016), Alcoholic and Non-Alcoholic Fatty Liver Disease: Bench to Bedside, Springer International Publishing, pp 108-116 87 Yan S L., Wang Z H., et al (2016), "Reversal of ethanol-induced hepatotoxicity by cinnamic and syringic acids in mice", Food Chem Toxicol, 98(Pt B), pp 119126 88 Yan S L., Yin M C (2007), "Protective and alleviative effects from cysteinecontaining compounds on ethanol-induced acute liver injury through suppression of oxidation and inflammation", J Food Sci, 72(7), pp S511-5 89 Yang B., Kortesniemi M., et al (2012), "Analysis of hydrolyzable tannins and other phenolic compounds in emblic leafflower (Phyllanthus emblica L.) fruits by high performance liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry", J Agric Food Chem, 60(35), pp 8672-83 90 Yang R., Han X., et al (2003), "Ethyl pyruvate ameliorates acute alcoholinduced liver injury and inflammation in mice", J Lab Clin Med, 142(5), pp 32231 91 Yi J., Xia W., et al (2014), "Betulinic acid prevents alcohol-induced liver damage by improving the antioxidant system in mice", J Vet Sci, 15(1), pp 1418 92 Yimam M., Jiao P., et al (2016), "A Standardized Composition from Extracts of Myristica Fragrans, Astragalus Membranaceus, and Poria Cocos Protects Liver from Acute Ethanol Insult", J Med Food, 19(8), pp 780-8 93 Zhang L Z., Zhao W H., et al (2003), "Studies on chemical constituents in fruits of Tibetan medicine Phyllanthus emblica", Zhongguo Zhong Yao Za Zhi, 28(10), pp 940-3 94 Zhang Y J., Abe T., et al (2002), "Two new acylated flavanone glycosides from the leaves and branches of Phyllanthus emblica", Chem Pharm Bull (Tokyo), 50(6), pp 841-3 95 Zhang Y J., Zhou T., et al (2016), "The Effects of Syzygium samarangense, Passiflora edulis and Solanum muricatum on Alcohol-Induced Liver Injury", Int J Mol Sci, 17(10) 96 Zhao Lei, Jiang Yu, et al (2017), "Protective effects of Lactobacillus plantarum C88 on chronic ethanol-induced liver injury in mice", Journal of Functional Foods, 35, pp 97-104 97 Zhao T., Sun Q., et al (2015), "Anticancer Properties of Phyllanthus emblica (Indian Gooseberry)", Oxid Med Cell Longev, 2015 98 Zhou T., Zhang Y J., et al (2017), "Protective Effects of Lemon Juice on Alcohol-Induced Liver Injury in Mice", Biomed Res Int, 2017, pp 7463-571 99 Conde de la Rosa L., Moshage H., et al (2008), "Hepatocyte oxidant stress and alcoholic liver disease", Rev Esp Enferm Dig, 100(3), pp 156-63 ... thể hình 2.1 (trang bên) 19 Triển khai mơ hình gây độc tế bào gan ethanol Triển khai mơ hình gây độc tế bào gan mạn ethanol Triển khai mơ hình gây độc tế bào gan cấp ethanol Đánh giá tác dụng. .. Phương pháp triển khai mơ hình gây độc tế bào gan cấp ethanol 20 2.3.2 Phương pháp triển khai mơ hình gây độc tế bào gan mạn ethanol 21 2.3.3 Phương pháp đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào gan cao...BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI TRẦN THẢO HƯƠNG MÃ SINH VIÊN: 1401310 TRIỂN KHAI MƠ HÌNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO GAN BẰNG ETHANOL TRÊN ĐỘNG VẬT THỰC NGHIỆM VÀ ÁP DỤNG ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG CỦA ME RỪNG