Nghiên cứu bào chế và đánh giá tác dụng trên khối u thực nghiệm thuốc tiêm chứa Liposome doxorubicin.

ĐẶT VẤN ĐỀ Từ những năm 50 của thế kỷ XX, doxorubicin (DOX) đã được phát hiện, phân lập từ chủng vi khuẩn Streptomyces peucetius var. caesius và được ứng dụng trong lâm sàng để điều trị bệnh ung thư. Hiện nay, doxorubicin có thể được bán tổng hợp từ daunorubicin và được sử dụng khá phổ biến. Tuy nhiên, cũng giống như các thuốc điều trị ung thư thuộc nhóm kháng chuyển hóa khác, doxorubicin có rất nhiều tác dụng không mong muốn, đặc biệt là độc tính gây suy tủy, làm thiếu bạch cầu, giảm tiểu cầu, làm rối loạn nhịp tim và có thể dẫn đến tử vong. Do đó, hiện nay, thuốc tác dụng tại đích để điều trị bệnh ung thư là sự lựa chọn thích hợp để tăng cường hiệu quả của thuốc tại các khối u và giảm độc tính ở các tế bào lành. Một trong những hệ đưa thuốc tại đích đang được chú trọng phát triển trong bào chế hiện đại là dạng thuốc liposome. Đây là dạng thuốc có nhiều ưu điểm trong quá trình vận chuyển, phân bố, kiểm soát giải phóng và tăng sinh khả dụng của dạng thuốc. Ưu điểm đặc biệt của liposome sử dụng trong điều trị ung thư là các phân tử thuốc sẽ đi nhiều vào khối u, giải phóng thuốc và hạn chế thuốc đến các mô lành. Nhờ sự phát triển của công nghệ nano, trên thế giới đã có một vài hãng sản xuất nanoliposome doxorubicin và được ứng dụng trong lâm sàng như các biệt dược: Doxil, Caelyx, LipoDox,…[41] với nhiều cải tiến về mặt bào chế nhằm nâng cao sinh khả dụng và giảm độc tính. Tuy nhiên ở Việt Nam, các nghiên cứu về liposome chưa nhiều, chưa có chế phẩm nào được đưa vào sản xuất. Hiện nay, dạng bào chế liposome đang được chú trọng phát triển và có tiềm năng lớn cho tương lai. Vì vậy nghiên cứu liposome doxorubicin là vấn đề cấp thiết nhằm phát triển một thế hệ thuốc mới cho ngành Dược Việt Nam. Với lý do trên, đề tài luận án: “Nghiên cứu bào chế và đánh giá tác dụng trên khối u thực nghiệm thuốc tiêm liposome doxorubicin” được tiến hành với 2 mục tiêu: 1. Bào chế được thuốc tiêm liposome doxorubicin 2mg/ml ở quy mô phòng thí nghiệm, xây dựng tiêu chuẩn cơ sở và đánh giá được độ ổn định của chế phẩm. 2. Đánh giá được tác dụng của thuốc tiêm liposome doxorubicin trên khối u chuột thực nghiệm. Để đạt được các mục tiêu trên, đề tài thực hiện các nội dung nghiên cứu sau: 1. Nghiên cứu xây dựng công thức và qui trình bào chế liposome doxorubicin bằng phương pháp hydrat hóa film. 2. Đánh giá được các đặc tính của liposome doxorubicin để tiêu chuẩn hóa liposome doxorubicin và thuốc tiêm liposome doxorubicin. 3. Đánh giá độ ổn định của thuốc tiêm liposome doxorubicin 2mg/ml. 4. So sánh hiệu quả kháng u của thuốc tiêm doxorubicin bào chế được và thuốc đối chiếu trên động vật thực nghiệm.

LUẬN ÁN TIẾN SỸ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI - NĂM 2017

Lời cam đoan

1.2.2 Phân loại liposome 13

1.2.3 Ưu, nhược điểm của liposome 15

1.2.4 Nguyên liệu bào chế liposome 16

1.3 Các nghiên cứu về liposome doxorubicin 26

1.3.1 Nghiên cứu bào chế 26 1.3.2 Đánh giá tác dụng in vivo 33 Chương 2 NGUYÊN VẬT LIỆU,THIẾT BỊ, ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 38 2.1 Nguyên vật liệu 38

2.2 Thiết bị và dụng cụ nghiên cứu 39

2.3 Đối tượng nghiên cứu 40

2.4 Phương pháp nghiên cứu 41

2.4.1 Phương pháp bào chế 41 2.4.2 Phương pháp đánh giá các đặc tính liposome doxorubicin 45 2.4.3 Phương pháp đánh giá chất lượng thuốc tiêm liposome doxorubicin 51 2.4.4 Phương pháp đánh giá tác dụng của liposome doxorubicin trên khối u động vật 52 2.5 Phương pháp xử lý số liệu 55

2.6 Điều kiện thí nghiệm 56

2.7 Địa điểm nghiên cứu 56

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 57 3.1 Kết quả xây dựng phương pháp định lượng doxorubicin 57

3.1.1 Phương pháp đo quang phổ hấp thụ UV-VIS 57 3.1.2 Phương pháp HPLC 61 3.2 Kết quả xây dựng công thức bào chế liposome doxorubicin 64 3.2.1 Bố trí thí nghiệm 64

3.3 Kết quả xây dựng qui trình bào chế liposome doxorubicin 763.3.1 Bào chế liposome chưa mang dược chất 76

3.3.2 Quá trình đưa dược chất vào liposome 84

3.4 Kết quả bào chế thuốc tiêm liposome doxorubicin 92

3.5 Kết quả đề xuất tiêu chuẩn và đánh giá độ ổn định của thuốc tiêm

liposome doxorubicin 963.5.1 Đề xuất tiêu chuẩn 96

3.5.2 Đánh giá độ ổn định 98

3.6 Kết quả đánh giá tác dụng của thuốc tiêm liposome doxorubicin trên khối u động vật thực nghiệm 1033.6.1 Đánh giá trên chuột nhắt mang tế bào ung thư Sacoma TG 180103

3.6.2 Đánh giá tác dụng trên khối u chuột thiếu hụt miễn dịch mang tế bào ung thư tiền liệt tuyến 109

Chương 4: BÀN LUẬN 112

4.1 Phương pháp bào chế liposome 1124.1.1 Bào chế liposome chưa mang dược chất 112

4.1.2 Giảm và đồng nhất kích thước liposome 113

4.1.3 Đưa dược chất vào liposome 116

4.2 Xây dựng công thức bào chế liposome doxorubicin 1204.2.1 Tỷ lệ các lipid 120

4.2.2 Tỷ lệ lipid / doxorubicin 121

4.3 Phương pháp đánh giá liposome 1244.3.1 Phương pháp định lượng hàm lượng dược chất 124

4.3.4 Đánh giá giải phóng dược chất từ liposome 126

Bristish Pharmacopoeia ( Dược điển Anh)Congestive heart failure (Suy tim sung huyết )Cholesterol

Cộng sựDược chấtĐối chứng sinh họcĐối chứng ung thưDược điển Việt NamDioleoylphosphatidyl ethanolaminDimethyldioctadecylammonium bromidDoxorubicin hydroclorid

Dipalmitoylphosphatidylcholin1,2-Dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin1,2-Dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serin1,2-Distearoyl-sn-Glycero-3-Phosphoric acidDistearoyl phosphatidylcholin

Distearoyl phosphatidylethanolaminDistearoyl phosphoethanolamin polyethylene glycolDistearoyl Phosphatidyl glycerol

Egg-derived phosphatidylcholinEgg-derived phosphatidylglycerol

(Thụ thể của yếu tố tăng trưởng thượng bì)Hydrogenated phosphatidylcholin

Hydrogenated phosphatidylinositolHigh-performance liquid chromatography (Sắc kí lỏng hiệu năng cao)

Kính hiển viKích thước tiểu phânLarge unilamellar vesicle ( Liposome đơn lớp lớn)Left ventricular ejection fraction (Thể tích tống máu thất trái)

Multilamellar vesicle (Liposome nhiều lớp đồng trục )Multivesicular (Liposome kép )

Nồng độNhiễm sắc thểPhosphatidyl cholinpolydispersity index (Chỉ số đa phân tán)Polyethylenglycol

Phosphatidyl inositolPolytetrafluoroethylene TeflonRelative Standard deviation ( Độ lệch chuẩn tương đối)Standard deviation (Độ lệch chuẩn )

Tinh khiết hóa họcNhiệt chảy hoàn toànmelting temperature (Nhiệt chảy lỏng)United State Pharmacopoeia (Dược điển Mỹ )Cường độ ion

Một số phương pháp định lượng doxorubicin

Một số chế phẩm thuốc tiêm chứa doxorubicin trên thị trường

Phân loại liposome trên cơ sở kích thước và số lớp

Mốt số đặc tính của phospholipid dùng bào chế liposome

Tổng hợp một số nghiên cứu về liposome tuần hoàn lâu trong

máu và hướng đích

Nguyên vật liệu chính dùng trong nghiên cứu

Mật độ quang các mẫu dung dịch doxorubicin ở bước sóng

482 nm có và không có tá dược

Mối tương quan giữa mật độ quang ở các bước sóng và các

pH khác nhau với nồng độ doxorubicin

Kết quả kiểm tra độ lặp lại của phương pháp định lượng bằng

đo quang phổ hấp thụ UV-VIS

Mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ doxorubicin

Độ lặp lại của phương pháp định lượng bằng HPLC

Kết quả khảo sát độ thích hợp của hệ thống sắc ký

Kết quả khảo sát độ đúng

Các công thức bào chế liposome doxorubicin

Hàm lượng và hiệu suất liposome hóa của các mẫu liposome

Tỷ lệ giải phóng dược chất từ các mẫu liposome DOX (pH

7,4)

47141729

38585960

61626263656667

Kết quả đánh giá kích thước tiểu phân của các mẫu

Kết quả đánh giá kích thước tiểu phân của các mẫu sau 4 tuần

bảo quản

Hiệu suất liposome hóa của các mẫu sau 4 tuần và mới bào

chế

Tỷ lệ giải phóng dược chất ( %) liposome DOX sau 4 tuần

bảo quản tại pH 7.4

Tỷ lệ giải phóng dược chất ( %) liposome DOX sau 4 tuần

bảo quản tại pH 5,5

Phân bố kích thước hệ liposome ở các điều kiện siêu âm khác

nhau

Phân bố kích thước hệ liposome khi siêu âm thể tích nhỏ ( 10

ml)

Các qui trính nén /đẩy qua màng

Sự phân bố KTTP phụ thuộc vào qui trình nén/đẩyqua màng

Hiệu suất liposome hóa của doxorubicin ủ ở 50⁰C

Hiệu suất liposome hóa của doxorubicin ủ trong 30 phút

Hiệu suất liposome hóa doxorubicin theo phương pháp thẩm

tích 3 lần đệm HEPES

Hiệu suất liposome hóa doxorubicin theo số lần đổi đệm tiếp

tuyến

686972

7374757879

828385878889

KTTP liposome trước và sau khi gắn doxorubicin

Thời gian hòa tan DOX và hiệu xuất liposome hóa khi sử

dụng dược chất đông khô

So sánh các chỉ tiêu chất lượng giữa liposome dox bào chế

với chế phẩm Lipodox

Theo dõi độ ổn định và một số chỉ tiêu của thuốc tiêm

liposome doxorubicin ở điều kiện dài hạn

Theo dõi độ ổn định và một số chỉ tiêu của thuốc tiêm

liposome doxorubicin ở điều kiện phòng thí nghiệm

Tỷ lệ chuột mang u dưới da sống sót sau 30 ngày

Thời gian sống trung bình chuột mang u dưới da sau 30 ngày

Khối lượng u dưới da của chuột sau 30 ngày

Thể tích khối u dưới da của chuột sau 30 ngày

Khối lượng khối u cơ trung bình của chuột sau 30 ngày

Thể tích khối u cơ của chuột sau 30 ngày

Kích thước khối u UTTTL người ở các nhóm

Các hệ đệm được sử dụng để bào chế hỗn dịch liposome

DOX

9091949699101

103104105106107108110123

Sự phân hủy doxorubicin trong môi trường acid

Cấu tạo vỏ liposome

Các loại liposome

Cơ chế đổi đệm của hệ lọc tiếp tuyến

Cơ chế đổi đệm của phương pháp thẩm tích

Mô tả quá trình thẩm tích để tách doxorubicin tự do trong

mẫu liposome

Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa mật độ quang ở các

bước sóng và các pH khác nhau với nồng độ doxorubicin

Mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ doxorubicin

Đồ thị biểu diễn các chỉ số PDI và Z-average hệ liposome của

các mẫu

Hình ảnh chụp TEM của liposome doxorubicin bào chế theo

công thức A3.2

Đồ thị so sánh các chỉ số PDI và Z-average của các mẫu

liposome sau 4 tuần và mới bào chế

Hình ảnh chụp bề mặt soi âm bản của mẫu liposome sau siêu

âm

Hình ảnh chụp cắt ngang của mẫu liposome sau siêu âm

Hình ảnh chụp TEM của liposome khi sử dụng các phương

pháp giảm KTTP khác nhau

Sơ đồ bào chế lọ chứa bột doxorubicin đông khô

5131443434959

6170717381

828493

Tỷ lệ chuột mang khối u dưới da sống sót sau 30 ngày

Thời gian sống trung bình chuột mang u dưới da sau 30 ngày

Khối lượng khối u dưới da của chuột sau 30 ngày

Thể tích khối u dưới da của chuột sau 30 ngày

Khối lượng khối u cơ trung bình của chuột sau 30 ngày

Thể tích khối u cơ của chuột sau 30 ngày

Diễn biến kích thước khối u trên chuột

Trọng lượng chuột ở các nhóm điều trị

Cơ chế tăng thấm thuốc từ tuần hoàn vào vùng u

Cơ chế đưa doxorubicin hydroclorid vào trong liposome bằng

pH-gradient

95

103104105106107108110111114117

ĐẶT VẤN ĐỀ

Từ những năm 50 của thế kỷ XX, doxorubicin (DOX) đã được phát hiện,

phân lập từ chủng vi khuẩn Streptomyces peucetius var caesius và được ứng

dụng trong lâm sàng để điều trị bệnh ung thư Hiện nay, doxorubicin có thểđược bán tổng hợp từ daunorubicin và được sử dụng khá phổ biến Tuy nhiên,cũng giống như các thuốc điều trị ung thư thuộc nhóm kháng chuyển hóakhác, doxorubicin có rất nhiều tác dụng không mong muốn, đặc biệt là độctính gây suy tủy, làm thiếu bạch cầu, giảm tiểu cầu, làm rối loạn nhịp tim và

có thể dẫn đến tử vong Do đó, hiện nay, thuốc tác dụng tại đích để điều trịbệnh ung thư là sự lựa chọn thích hợp để tăng cường hiệu quả của thuốc tạicác khối u và giảm độc tính ở các tế bào lành

Một trong những hệ đưa thuốc tại đích đang được chú trọng phát triểntrong bào chế hiện đại là dạng thuốc liposome Đây là dạng thuốc có nhiều ưuđiểm trong quá trình vận chuyển, phân bố, kiểm soát giải phóng và tăng sinhkhả dụng của dạng thuốc Ưu điểm đặc biệt của liposome sử dụng trong điềutrị ung thư là các phân tử thuốc sẽ đi nhiều vào khối u, giải phóng thuốc vàhạn chế thuốc đến các mô lành Nhờ sự phát triển của công nghệ nano, trênthế giới đã có một vài hãng sản xuất nanoliposome doxorubicin và được ứngdụng trong lâm sàng như các biệt dược: Doxil, Caelyx, LipoDox,…[41] vớinhiều cải tiến về mặt bào chế nhằm nâng cao sinh khả dụng và giảm độc tính

Tuy nhiên ở Việt Nam, các nghiên cứu về liposome chưa nhiều, chưa

có chế phẩm nào được đưa vào sản xuất Hiện nay, dạng bào chế liposomeđang được chú trọng phát triển và có tiềm năng lớn cho tương lai Vì vậynghiên cứu liposome doxorubicin là vấn đề cấp thiết nhằm phát triển một thế

hệ thuốc mới cho ngành Dược Việt Nam

Với lý do trên, đề tài luận án: “Nghiên cứu bào chế và đánh giá tác dụng trên khối u thực nghiệm thuốc tiêm liposome doxorubicin” được tiến

hành với 2 mục tiêu:

1 Bào chế được thuốc tiêm liposome doxorubicin 2mg/ml ở quy mô phòng thí nghiệm, xây dựng tiêu chuẩn cơ sở và đánh giá được độ ổn định của chế phẩm.

2 Đánh giá được tác dụng của thuốc tiêm liposome doxorubicin trên khối u chuột thực nghiệm.

Để đạt được các mục tiêu trên, đề tài thực hiện các nội dung nghiên cứusau:

1 Nghiên cứu xây dựng công thức và qui trình bào chế liposome doxorubicin bằng phương pháp hydrat hóa film.

2 Đánh giá được các đặc tính của liposome doxorubicin để tiêu chuẩn hóa liposome doxorubicin và thuốc tiêm liposome doxorubicin.

3 Đánh giá độ ổn định của thuốc tiêm liposome doxorubicin 2mg/ml.

4 So sánh hiệu quả kháng u của thuốc tiêm doxorubicin bào chế được

và thuốc đối chiếu trên động vật thực nghiệm

Chương 1 TỔNG QUAN

1.1 Đại cương về doxorubicin

Công thức cấu tạo:

- Công thức phân tử:

C27H29NO11. Khối lượng phân tử:

579,99

Tên khoa học: (8S,10S)-10-{(3-Amino-2,3,6-trideoxy-α-L-lyxo-hexo

pyranosyl) oxy}7,8,9,10tetrahydro6,8,11trihydroxy8(2hydroxyacetyl) 1-methoxy-5,12-naphthacen-dion[133]

-1.1.1 Đặc điểm hóa lý

Tính chất: Ở điều kiện thường doxorubicin hydroclorid tồn tại dưới

dạng tinh thể hay bột vô định hình màu vàng cam, không mùi Điểm nóngchảy 230oC Dung dịch 5mg/ml có pH từ 4-5,5 Hằng số phân ly pKa1 = 7,34(phenol); pKa2 = 8,46 (amin); pKa3 = 9,46 (ester) Tan trong nước (50 mg/ml

ở 25oC), methanol, acetonitril, tetrahydrofuran Không tan trong cloroform,aceton, ethyl ether, benzene, ether dầu hỏa [133] Trong methanol hấp thụ ởbước sóng 233, 252, 288, 479, 496, 529 nm Dung dịch nước có màu vàngcam với pH acid, màu đỏ da cam tại môi trường trung tính, và màu tím màuxanh ở pH > 9 Với các đặc tính trên, có thể áp dụng định lượng doxorubicinbằng phương pháp quang phổ UV-vis hoặc HPLC với detector tử ngoại hoặchuỳnh quang [131] (bảng 1.1)

Bảng 1.1 Một số phương pháp định lượng doxorubicin

9-Ở pH 9,0 và 10,0 DOX bị phân hủy nhanh chóng Sự phân hủy có thểquan sát trực tiếp bằng mắt thường thông qua sự thay đổi màu sắc dung dịch

từ màu đỏ đến màu xanh-tím và cuối cùng là phân hủy hoàn toàn [34] Côngthức của doxorubicin có nhóm NH2 có khả năng bị proton hóa và 2 nhóm OH

có khả năng tách proton Do đó trong dung dịch, doxorubicin có thể tồn tại ởcác dạng: phân tử trung hòa, ion lưỡng cực, anion và cation

So sánh với các glycoside khác, ví dụ ginsenosid, trong công thức thiếumột nhóm chức amin so với doxorubicin, cho thấy rằng doxorubicin ổn địnhhơn trong dung dịch acid Dược chất tương đối ổn định trong môi trường pH

< 4 Doxorubicin hydrochlorid bền trong dung dịch có pH gần 4,0 Trongmôi trường acid với pH trên 4, DOX có thể bị phân hủy như sau:[133]

Hình 1.1 Sự phân hủy doxorubicin trong môi trường acid

*Nguồn: Theo Dominique M.M (1986)[34]

Các chế phẩm dung dịch đậm đặc để pha dung dịch tiêm truyền trên thịtrường đều có pH 3,0-4,0; sử dụng acid hydrocloric để điều chỉnh pH

Ảnh hưởng của nồng độ ion:

Sự ảnh hưởng của nồng độ ion tới tốc độ phân hủy DOX đã đượcnghiên cứu Dung dịch dược chất được điều chỉnh ở pH không đổi (1,25) vàthay đổi nồng độ ion bằng cách thêm natri clorid Độ ổn định của dược chất tỷ

lệ căn bậc hai của cường độ ion (µ) trong khảng 0,14 <(µ)1/2<0,75 Tại (µ)1/2>0,75 tốc độ phản ứng phân hủy dược chất tăng cùng với tỷ lệ trao đổi iondoxorubicin và proton H+[21],[23]

Ảnh hưởng của nhiệt độ:

Doxorubicin không bền dưới tác động của nhiệt độ Chế phẩm thôngthường được bảo quản tại nhiệt độ 4ºC Các nghiên cứu đánh giá sự ổn địnhcủa DOX trong huyết tương cũng cho thấy tại nhiệt độ 39ºC, DOX nhanhchóng bị phân hủy thành các hợp chất không phân cực (DOX-ONE và DOX-OL); quá trình diễn ra chậm hơn tại nhiệt độ 23ºC và tương đối ổn định tại4ºC [34]

Bảo quản:

Doxorubicin là chất nhạy cảm với ánh sáng ở nồng độ thấp Dược chấtdoxorubicin hydroclorid thường bảo quản dưới 25oC, tránh ánh sáng Các chế

phẩm như dung dịch, hỗn dịch liposome được bảo quản tránh ánh sáng, để ởnhiệt độ khoảng từ 2- 8oC, bột đông khô pha dung dịch tiêm bảo quản khôngquá 30oC, tránh ánh sáng [3], [133].

S nhưng sẽ chết ở pha G2[17], [44], [45], [62], [112]

1.1.4 Các dạng bào chế của doxorubicin

Về mặt bào chế, có thể chia thành 2 dạng thuốc chứa doxorubicin để phadung dịch tiêm truyền trên thị trường Một là dạng chứa doxorubicinhydroclorid tự do, hai là hỗn dịch liposome Với dạng chứa dược chất tự do,phổ biến là dạng dung dịch đậm đặc để pha dung dịch tiêm truyền, thường vớihàm lượng 2 mg/ml, đóng lọ với thể tích khác nhau Một số nhà sản xuất lạibào chế bột đông khô để pha dung dịch tiêm truyền nhằm tăng tuổi thọ chochế phẩm

Các dạng bào chế chứa doxorubicin được tóm tắt ở bảng 1.2 [3],[17],[118], [72]

Bảng 1.2 Một số chế phẩm thuốc tiêm chứa doxorubicin trên thị trường

Adorucin 10mg/5ml

50mg/25ml

Korea UnitedPharma (Hàn Quốc)Adriamycin 10mg/5ml

50mg/25ml Pfizer (Úc)Adriblastina 10mg, 50mg Pharmacia (Italia)Adrim 50mg/25ml Dabur (Ấn Độ)Doxorubicin

Ebewe

10mg/5ml,50mg/25ml

Ebewe Pharma(Áo)

Bột đông khô pha dịch truyền tĩnh mạch

Doxorubicin 10mg, 50mg Pharmachemie

(Hà Lan)Doxorubicin

DBL

10mg/5ml50mg/25ml

David Bull LabMayne Pharm (Úc)Doxorubicin

Servycal 10mg, 50mg

Laboratorios IMA(Achentina)Doxtie 10mg, 50 mg Bioprofarma

(Achentina)Zodox 10mg, 50mg Intas (Ấn Độ)

Liposome

Lọ bột đông khô pha hỗn dịch tiêm liposome qui ước

Cephalon (Anh, TâyBan Nha);Sopherion (Mỹ)

Hỗn dịch tiêm chứa PEGylated liposome doxorubicin

Caelyx 20mg/10ml

50mg/30ml

Schering Plough(Mỹ)Doxil 20mg/10ml

50mg/30ml Sequus pharm.(Mỹ)

(Đài Loan)

Hỗn dịch liposome nhạy cảm với nhiệt

ThermoDox 30mg/15ml

CelsionCorporation,Lawrenceville, NJ

1.1.5 Dược động học

Doxorubicin hydroclorid không ổn định trong dạ dày và các nghiên cứutrên động vật cho thấy thuốc hấp thu rất kém qua đường tiêu hóa Ngoài ra,thuốc rất khó được phân bố tới các mô qua đường uống, do đó thuốc được bàochế dạng tiêm truyền tĩnh mạch Doxorubicin được chuyển hóa bởi enzymaldoketoreductases-NADPH thành chất chuyển hóa ưa nước doxorubicinol13-hydroxyl có tác dụng chống ung thư và là chất chuyển hóa chính Nhữngreductases có mặt trong hầu hết các tế bào, đặc biệt là trong hồng cầu, gan vàthận Chất chuyển hóa khác không có tác dụng điều trị bao gồm các aglycon íttan trong nước, như doxorubicinon (adriamycinon) và 7-deoxy-doxorubicinon(17-deoxy-adriamycinon) Các enzyme reductase chuyển doxorubicin thành7-deoxyaglycon làm tăng tác dụng gây độc tế bào của thuốc vì nó tạo ra cácgốc hydroxyl gây tổn thương tế bào [133]

Do sự khác biệt về mặt bào chế, các chế phẩm chứa doxorubicin khácnhau khi sử dụng cho các thông số dược động học khác nhau [141]

Với dung dịch truyền tĩnh mạch, đồ thị nồng độ trong huyết tương khôngxuất hiện ở 3 pha tương ứng với thời gian bán thải là 12 phút; 3,3 giờ và 33giờ Thời gian bán thải tương đối dài của doxorubicin phản ánh việc phân bốvào các mô của dược chất Chỉ khoảng 33-50% dạng chuyển hóa tìm thấytrong nước tiểu, mật và phân sau 5 ngày truyền tĩnh mạch Phần còn lại củadược chất và các sản phẩm chuyển hóa vẫn còn nằm lại trong các mô tại các

tổ chức của cơ thể Với bệnh nhân ung thư, doxorubicin làm giảmadriamycinol, một chất có độc tính Quá trình này được xúc tác bởi enzymaldoketoreductases-NADPH, được tìm thấy trong tất cả các mô và đóng vaitrò quan trọng để xác định dược động học của doxorubicin [28] Thể tích phân

bố lớn (700 - 1100 L/m2), liên kết doxorubicin và chất chuyển hóadoxorubicinol với protein huyết tương là 74-76% và không phụ thuộc vàonồng độ của doxorubicin (> 2 µM)

Dược động học của liposome doxorubicin khác hẳn so với doxorubicindạng tự do Sự phân bố của dạng liposome bị giới hạn bởi lòng mạch, liên kếtprotein không đáng kể, thời gian phân bố dược chất tới các mô là 5 phút chothấy sự hấp thu nhanh chóng của doxorubicin Trong khi thời gian bán thảicủa thuốc gắn với liposome thường là dài (ví dụ Doxil có t1/2= 20–48 giờ).Khác với dạng dung dịch, liposome chuyển hóa theo hai giai đoạn: giai đoạnđầu tương đối ngắn (5 giờ) và giai đoạn thứ hai kéo dài (55 h)[134]

Gabizon và cộng sự đã thực hiện một nghiên cứu với chế phẩm Caelyx

cho thấy thời gian bán thải khoảng 50-55 giờ với liều lượng từ 10-20 mg/m2

trong điều trị các bệnh nhân sarcoma Kaposi liên quan đến AIDS, 60-80 giờvới mức liều 35-70 mg/m2 ở bệnh nhân mang khối u rắn; 36 giờ với liều 40-70mg/m2 trên các bệnh nhân khoa nhi

Độ thanh thải huyết thanh của Doxil 0,041 L/h/m2 với liều 20 mg/m2

Do thanh thải chậm, nên sinh khả dụng của Doxil gấp 2-3 lần so vớidoxorubicin tự do [105]

Các chế phẩm liposome gắn PEG và không gắn PEG cũng có sự khácbiệt Doxorubicin khi gắn với liposome đã PEG hóa có thời gian tồn tại trongvòng tuần hoàn kéo dài hơn Dạng liposome doxorubicin không PEG hóacũng cho thấy nồng độ đỉnh trong huyết tương của tổng lượng doxorubicin sửdụng cao hơn so với khi sử dụng doxorubicin dạng tự do [134]

Với dạng bào chế bột pha tiêm, dung dịch tiêm doxorubicin hydrocloridcác chỉ định được đưa ra thường là điều trị trong một số khối u rắn và khối u

máu ác tính, và thường được sử dụng trong điều trị các khối u sau đây: ungthư vú, ung thư phổi, ung thưbiểu mô buồng trứng, ung thư bàng quang, unguyên bào thần kinh, khối u Wilm, u liên kết mô mềm, u xương ác tính,bệnh bạch cầu cấp tính lymphocytic – lymphoblastic, bệnh bạch cầu nguyênbào tuỷ cấp tính, ung thư không Hodgkin, bệnh Hodgkin (liên quan mạchbạch huyết).

Doxorubicin cũng đã thể hiện hoạt tính chống ung thư, các khối u ác tính

ở người lớn và nhi khoa sau đây: ung thư biểu mô tuyến giáp, ung thư biểu

mô nội mạc tử cung, ung thư đầu và cổ, ung thư dạ dày, ung thư biểu mô tếbào gan chính, ung thư tinh hoàn, ung thư biểu mô tuyến tiền liệt, Ewingsarcoma, Rhabdomyosarcoma, đa u tủy, ung thư bạch cầu mạn tính

Trong khi đó dạng bào chế thuốc gắn trong PEGylated liposome (Doxil,Caelyx) có những chỉ định hẹp hơn, cụ thể hơn như:

*Điều trị ung thư vú và buồng trứng, nó được sử dụng để giếtcác tế bào ungthư, thu nhỏ kích thước và trì hoãn sự tăng trưởng của khối u

*Sử dụng trong kết hợp với thuốc khác là bortezomib để điều trị nhiều u tủy,

là một ung thư huyết tương tế bào Tế bào huyết tương được sản xuất trongtủy xương và là một thành phần của hệ thống miễn dịch

*Sử dụng để điều trị bướu thịt Kaposi, một dạng khác của ung thư, cải thiệnlàm phẳng, làm sáng và co rút bướu thịt Kaposi của bệnh ung thư [105],[134]

Đối với dạng bào chế liposome chứa doxorubicin hydroclorid nhưngkhông gắn PEG đại diện là Myocet chỉ định chính được đưa ra trong điều trịung thư vú nhằm mục đích giảm chi phí cho người bệnh tuy nhiên vẫn đảmbảo tập trung dược chất

1.1.7 Độc tính

Nhìn chung, sử dụng các chế phẩm chứa doxorubicin đều có nguy cơ gâyđộc tính lên cơ thể Độc tính trên tim là nghiêm trọng nhất, nhất là khả năng

suy tim sung huyết (CHF) đe dọa tính mạng người bệnh Ngoài ra các độctính trên da, hệ tiêu hóa, thần kinh, cũng đã được ghi nhận [3],[32],[134].Một trong các mục đích của bào chế liposome doxorubicin là để giảm độctính do khả năng hướng đích.

1.1.8 Liều lượng

*Liều dùng: được tính trên cơ sở diện tích da.

+ Các chế phẩm dung dịch tiêm và bột pha tiêm doxorubicin hydroclorid:

Điều trị các khối u rắn: Khi một tác nhân duy nhất được sử dụng làdoxorubicin, liều được đề nghị là 60-75mg/m2 cho mỗi chu kỳ ba tuần Nếudoxorubicin được sử dụng kết hợp với các tác nhân chống ung thư khác cókhả năng chồng chéo độc tính, liều khuyến cáo cho mỗi chu kỳ là 30-60mg/

m2

Điều trị ung thư bạch cầu cấp tính: liều khuyến cáo của doxorubicin là2,4 mg/kg trọng lượng cơ thể (tương ứng 75-90 mg/m2), được dùng trong bangày liên tiếp (một chu kỳ) Thời gian và liều của chu kỳ thứ hai được quyếtđịnh dựa vào tình trạng tủy xương và các tế bào máu ngoại vi, thời gian giữachu kỳ ít nhất là 10 ngày [3]

Doxorubicin có thể nhỏ trực tiếp vào bàng quang trong điều trị ung thư

ác tính Nhỏ 50ml dung dịch doxorubicin 1mg/ml trong 1h cách nhau 1 tuầnhoặc 1 tháng [3]

+Các chế phẩm liposome:

Sau khi được gắn vào liposome, doxorubicin được lưu giữ lâu hơn trong tếbào ung thư, do đó liều lượng của dạng bào chế này ít hơn và khoảng cách xahơn so với dùng dạng dược chất tự do

- Ung thư buồng trứng: 50 mg/m2 trong 4 tuần điều trị, dùng tối thiểu 4 đợt

- AIDS liên quan đến Kaposi bướu thịt: 20 mg/m2 trong 3 tuần điều trị

- Đa u tủy: 30 mg/m2 vào ngày thứ 4 sau khi sử dụng bortezomib được kiểmsoát ở mức 1,3 mg/m2 vào những ngày 1,4,8 và 11, sau mỗi 3 tuần[105],[134]

Dạng liposome không PEG hóa được sử dụng trong ung thư vú di căn với liều

tương tự như dạng doxorubicin tự do[133]

*Cách sử dụng:

Với dung dịch tiêm cũng như bột pha dung dịch tiêm doxorubicin:

Dung dịch doxorubicin được cho từ từ vào ống truyền tĩnh mạch có sẵndung dịch tiêm truyền natri clorua, hoặc dextrose 5% tiêm [3]

Với hỗn dịch tiêm liposome doxorubicin:

Việc pha loãng hỗn dịch tiêm liposome doxorubicin phụ thuộc vào côngthức bào chế Với liposome không gắn PEG (ví dụ như Myocet) quá trìnhhydrat hóa dùng đệm citrat, do đó nhà sản xuất thường khuyên pha loãng vớidung dịch natri clorid đẳng trương Đối với liposome gắn PEG như Lipodox,Caelyx, quá trình đưa dược chất vào liposome sử dụng chênh lệch đệmamoni, môi trường bên ngoài liposome được đẳng trương bằng sucrose do đónên pha loãng với dung dịch glucose 5% [72], [118]

1.2 Đại cương về liposome doxorubcin

1.2.1 Khái niệm

Liposome thuộc hệ đưa thuốc tới đích, là dạng phát triển ở mức cao hơnthuốc tác dụng kéo dài Nó là một dạng đặc biệt của microcapsule vànanocapsule, cấu tạo bao gồm một nhân nước ở giữa được bao bọc bởi một vỏphospholipid gồm một hay nhiều lớp đồng tâm, có kích thước thay đổi từhàng chục đến hàng nghìn nanomet [1], [2], [9]

Đặc tính của màng phospholipid của liposome là màng kép lipid gồm hailớp Trong quá trình hình thành liposome, các phân tử lipid hòa tan bao gồmmột đầu ưa nước và một đuôi kỵ nước, các lưỡng phân tử lipid tự kết tụ, sắpxếp liền nhau thành phiến mỏng khi độ hòa tan của chúng giảm dần ở môitrường nước

Các đầu ưa nước của màng kép lipid quay ra tiếp xúc với pha nước,trong khi đó các đuôi kỵ nước quay vào nhau trong màng kép (hình 1.2)

Kích thước tiểu phân của liposome tùy từng loại mà có kích thước khácnhau Loại một lớp nhỏ kích thước từ 20-50 nm Loại to từ 200-1000 nm.Loại nhiều lớp từ 400-3500 nm [1], [2],[47],[74].

1.2.2 Phân loại liposome

Phân loại về mặt cấu trúc:

Tùy theo phương pháp bào chế và quy trình làm giảm kích thước tiểuphân (KTTP), các liposome có kích thước, số lớp vỏ khác nhau Qua đó, cóthể phân thành các loại liposome như trong bảng 1.3[1]

Phân loại theo cấu tạo lớp vỏ của liposome: jjjjjjjjjjjjjjjjj

jTheo thành phần phospholipid cũng như theo sự thay đổi trên bề mặtphospholipid ta có thể phân chia thành: liposome quy ước, liposome nhạycảm pH hoặc nhiệt độ, liposome tích điện dương bề mặt, liposome gắn cácyếu tố ổn định, liposome gắn kháng thể… (Hình 1.3)

Tuy nhiên cách phân chia này chỉ là tương đối dựa trên từng nghiên cứucủa các tác giả khác nhau (hình 1.3) [20], [47], [69], [81]

Hình 1.2 Cấu tạo vỏ liposome

Bảng 1.3 Phân loại liposome trên cơ sở kích thước và số lớp Loại liposome

theo cấu trúc

Đường kính

Số lớp vỏ

*Nguồn theo Torchilin V P (2005) [138].

A: Liposome quy ước; B: Liposome gắn kháng thể; C: Liposome gắn yếu tố

ổn định; D: Liposome gắn kháng thể và các yếu tố ổn định; E: Các dạng liposome với các chất hướng đích khác; a- Thuốc tan trong nước; b-Thuốc tan trong dầu; c,d- Kháng thể gắn trên bề mặt liposome; e- Các phân tử PEG

1.2.3 Ưu, nhược điểm của liposome

- Cấu trúc màng phospholipid của liposome tương tự cấu trúc màng sinhhọc của cơ thể sống, do vậy liposome sẽ là chế phẩm y học có tính an toàncao

- Liposome có tác dụng bảo vệ và giải phóng một cách có kiểm soát cácdược chất

- Trong điều trị ung thư, liposome đưa thuốc tới đích là tế bào ung thư,hạn chế thuốc tới tế bào lành Ưu điểm đáng kể của liposome trong điều trịung thư là các tiểu phân liposome mang dược chất có đường kính nhỏ hơn cáclỗ rò ở các mạch máu nuôi khối u nên sẽ vượt qua được những khe hở này đivào khối u, giải phóng thuốc Còn kích thước các khe hở ở những mạch máucủa các mô bình thường có đường kính nhỏ hơn, không cho các tiểu phânliposome đi qua, vì vậy giảm thuốc đến các mô lành và gây độc Trong côngnghệ mới người ta bào chế các liposome có gắn trên bề mặt các ligand (phối

tử hay khớp nối) ví dụ kháng thể bề mặt, folat, vv…, các khớp nối này sẽhướng liposome tập trung nhiều ở mô ung thư giải phóng dược chất Với vaitrò là một chất mang, liposome phát huy tốt khả năng chứa và vận chuyểnnhững vật chất như gen, hemoglobin, vv… mà dạng thuốc khác không làmđược hoặc không hiệu quả bằng [9], [20], [138]

*Nhược điểm:

-Độ ổn định của liposome không cao Liposome là một hệ không đồngpha, luôn có khả năng kết tập của các tiểu phân trong hệ dẫn đến sự không ổn

định Mặt khác nguyên liệu để làm lớp vỏ liposome là các lipid rất dễ bị ảnhhưởng của các yếu tố: nhiệt độ, pH, vi sinh của môi trường.

-Tính đồng nhất giữa các lô mẻ sản xuất không cao Các thông số bàochế, điều kiện bào chế ảnh hưởng rất lớn đến sự hình thành liposome

-Cần nhiều thiết bị chuyên dụng và đồng bộ để bào chế và kiểm soáttrong quá trình bào chế làm cho việc nghiên cứu và đặc biệt là triển khai ởquy mô lớn gặp nhiều khó khăn

-Nguyên liệu tinh khiết, đắt tiền nên giá thành chế phẩm cao [1], [138]

1.2.4 Nguyên liệu bào chế liposome

Phospholipid là thành phần chính của liposome, do có cấu tạo gồm mộtđầu thân dầu và một đầu thân nước nên nó có khả năng tự kết hợp để tạothành lớp màng kép trong môi trường nước với những hình dạng khác nhautùy thuộc nồng độ lipid Các phospholipid dùng để bào chế liposome rất đadạng, có thể xuất tách từ nguồn nguyên liệu tự nhiên (đậu nành, lòng đỏtrứng) hoặc tổng hợp Các phospholipid có thể kể tên các nhóm chính sau:

tính Các đặc tính này ảnh hưởng trực tiếp đến các thông số trong quá trìnhbào chế liposome, độ ổn định và tác dụng sinh học của liposome [63], [147].

Bảng 1.4 Một số đặc tính của phospholipid dùng bào chế liposome

Loại phospholipid

Loại lipid (số mạch carbon: số dây nối đôi)

Nhiệt độ chuyển dạng (ºC)

Điện tích (pH 7,4)

*Nguồn Volkmar Weissig(2010)[147].

Cholesterol và dẫn chất được thêm vào phospholipid trong bào chếliposome, thường phối hợp ở tỷ lệ phù hợp trong thành phần của màngliposome Cholesterol có tác dụng làm giảm độ cứng và tính thấm của vỏliposome Tỷ lệ giữa các phospholipid và cholesterol là rất quan trọng, quyếtđịnh đặc điểm của màng, sự ổn định của màng Trong cấu trúc màng kép củaliposome, phospholipid và cholesterol tương tác liên kết nhau qua các cầu nốiacyl [99]

Trong quá trình bào chế lớp vỏ liposome, người ta còn dùng các chấtkhác:

- Chất tích điện tạo ra lực đẩy tĩnh điện giữa các lớp vỏ của liposome đểlàm tăng dung tích của khoang nước, do đó làm tăng khả năng đưa các dượcchất thân nước vào liposome Chất làm cho liposome tích điện âm như acidphosphatidic, dicetyl phosphat ; chất tích điện dương như stearylamin

- Các ligand (Phối tử - nhóm hướng đích) cũng được đưa vào lớp vỏlipid trong quá trình bào chế để đạt được mục đích mong muốn Ví dụ: folat,kháng thể, để hướng đích Các chất này thường được gắn vào bề mặtliposome sau khi bào chế liposome, cũng có trường hợp chúng được gắn trựctiếp vào lipid trước khi bào chế liposome.

- Chất cảm biến pH, cảm biến từ tính, [1], [15], [29],[33],[114]

Ở phương pháp đông khô còn dùng thêm các tá dược tạo khung cho quátrình đông khô, hay sử dụng các loại đường như sucrose, mannitol, lactose [24],[139],[114],[135]

1.2.5 Phương pháp bào chế liposome

Hiện nay có rất nhiều phương pháp bào chế liposome, một trong cácphương pháp hay được dùng nhất, ứng dụng hiệu quả nhất và dễ bổ sung, cảitiến là phương pháp Bangham hay còn gọi là phương pháp hydrat hóa màngmỏng lipid

Nguyên tắc của phương pháp: Hoà tan phospholipid và các thành phần

cấu tạo vỏ liposome vào dung môi hữu cơ (cloroform, methanol, ), bốc hơidung môi dưới áp suất giảm trong bình cất quay, phospholipid sẽ tạo thànhmàng film mỏng bám lên thành bình cất Nhiệt độ tiến hành xấp xỉ nhiệt độchuyển pha của lipid Có thể sục khí nitrogen để bay hơi hoàn toàn dung môihữu cơ Trên quy mô lớn người ta tiến hành tạo film mỏng bằng phương phápphun sấy Hydrat màng film đã tráng: thêm dung dịch nước có hệ đệm (nhưđệm phosphat, đệm citrat, ), vừa cho vừa lắc để phospholipid hydrat hoá tạothành liposome [9], [98]

Hạn chế của phương pháp hydrat hóa film là các liposome tạo thành cókích thước lớn không đồng nhất và lớp vỏ có thể có nhiều lớp

Để khắc phục hạn chế này, người ta hay sử dụng các biện pháp sau:

- Lọc ép bậc thang nhiều lần qua màng lọc (hay dùng màng carbonat) có kích thước xác định nhỏ dần, mỗi cỡ lỗ lọc khoảng 10 lần Các

poly-liposome tạo ra với kích thước nhỏ hơn, phân bố kích thước đều hơn [60],[74],[93].

- Có thể siêu âm ở tần số phù hợp để cho các liposome phân tán đều, cácliposome to vỡ ra tái tạo các liposome nhỏ hơn hoặc sắc ký tách đoạnliposome (hay dùng sắc ký cột lọc gel) [116]

- Kết hợp công đoạn đông lạnh- rã đông tuần hoàn: liposome sau khi bàochế đem đông lạnh ở nhiệt độ rất thấp sau đó rã đông ở nhiệt độ cao trên nhiệt

độ chảy của lipid, làm tuần hoàn như vậy khoảng 5-10 vòng Trong các thaotác này, các liposome cỡ lớn, nhiều lớp bị vỡ ra và tái tạo các liposome cỡnhỏ, vỏ lipid ít lớp hơn từ các mảng lipid kép Liposome thu được có kíchthước nhỏ và phân bố kích thước đều hơn [47], [98]

Dược chất có thể được đưa vào trong liposome theo hai cách:

- Với cách thứ nhất: Phối hợp ngay trong quá trình bào chế hình thànhliposome Dược chất thân nước thì hoà vào dung dịch nước, dược chất thândầu hoà vào dung dịch phospholipid trong dung môi hữu cơ Trong quá trìnhbào chế bản thân dược chất đã được đưa vào bên trong liposome

- Với cách thứ hai: Dược chất có thể được đưa vào liposome bằng cách:sau khi chế tạo xong liposome chưa chứa dược chất, pha dược chất trongdung dịch, phối hợp liposome rồi ủ với điều kiện nhiệt độ, thời gian nhất định

để dược chất đi qua màng gắn vào bên trong liposome theo các cơ chế khácnhau

Như vậy sau bước đưa dược chất vào trong liposome, dược chất tantrong nước sẽ nằm trong khoang nước (nhân nước) của liposome, còn dượcchất tan trong dầu sẽ nằm trong các lớp vỏ lipid [26],[91]

Trong thực tế người ta có thể kết hợp cả hai cách thức trên để đưa dượcchất vào trong liposome nhằm rút ngắn thời gian và tăng hiệu suất của quátrình này

Trong quá trình đưa dược chất vào trong liposome, để tăng hiệu suất đưadược chất gắn vào trong liposome có thể dùng các phương pháp:

- Dựa vào chênh lệch pH: dạng tồn tại của dược chất phụ thuộc nhiềuvào pH, sau khi hydrat hóa xong, người ta thay đổi pH môi trường bên ngoàitạo ra sự chênh lệch pH, khi dược chất vào bên trong do pH môi trường thayđổi dạng tồn tại của dược chất có thể thay đổi ví dụ: ít tan hơn, tạo phức, tạogel, quá trình này tạo điều kiện cho dược chất được kéo vào bên trongliposome nhiều hơn Hoặc pH môi trường bên ngoài liposome thay đổi làmdược chất thay đổi dạng dễ tiếp cận lớp vỏ lipid để vào bên trong liposomenhiều hơn [91]

- Dựa vào chênh lệch áp suất thẩm thấu hoặc chênh lệch nồng độ ion:sau khi hydrat hóa người ta tạo ra sự thay đổi nổng độ ion hay áp suất thẩmthấu ở môi trường bên ngoài liposome làm cho dược chất vào bên trongliposome nhiều hơn Cơ chế chủ yếu là sự trao đổi ion của các phân tử [91],[98]

- Dựa vào sự thay đổi môi trường chứa dược chất ở bên trong liposomekhác với bên ngoài làm thay đổi dạng tồn tại của dược chất dẫn đến tăng quátrình dược chất đi vào bên trong liposome

Ví dụ với một dược chất có tính base yếu như doxorubicin, BolotinElijah M và CSđã vận dụng phương pháp này như sau: sau khi bào chếliposome, hydrat hóa bằng dung dịch amoni sulfat 120mM, làm giảm và đồngnhất kích thước liposome, sau đó thẩm tích để thay thế môi trường amonisulfat bên ngoài bằng dung dịch doxorubicin hydroclorid trong amoni clorid.Doxorubicin dưới dạng ion (DXR-NH3+) từ môi trường đi qua vỏ liposomevào bên trong liposome, tại môi trường bên trong ion này kết hợp với ionsulfat (SO42-) tạo thành phân tử dạng gel gần như kết tủa Kết quả làdoxorubicin đi qua lớp màng nhiều hơn vào bên trong do thay đổi quá trìnhcân bằng doxorubicin giữa bên trong và bên ngoài màng [26]

Ngoài ra còn nhiều phương pháp khác để bào chế liposome như:

- Phương pháp Batzri và Korn (phương pháp hòa tan ethanol) [98]

- Phương pháp Deamer và Bangham [38], [98]

- Phương pháp bốc hơi pha đảo [74]

- Phương pháp pha loãng polyol [100]

- Phương pháp hòa tan và thẩm tách chất diện hoạt [100]

- Phương pháp đông khô [24], [85]

- Phương pháp phun hỗn hợp chất lỏng hòa tan trong khí siêu tới hạn [56]

- Phương pháp bốc hơi pha đảo siêu tới hạn [126]

1.2.6 Đánh giá liposome

*Hình thái liposome:

Các thông số về hình thái bên ngoài và cấu trúc của liposome như hìnhdáng, đặc điểm bề mặt, cấu trúc lớp vỏ lipid vv ảnh hưởng nhiều đến đặctính và tác dụng của hệ liposome

Các thông số hình thái bên ngoài được đánh giá bằng cách quan sát, chụpbởi kính hiển vi điện tử quét (SEM) có khả năng phóng đại đến 300.000 lần

và chụp được các tiểu phân liposome tới kích thước trên 10 nm Qua đánh giánày thu được hình ảnh bề mặt của liposome [3],[74]

Để đánh giá cấu trúc cắt ngang của liposome, người ta sử dụng hệthống kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) có khả năng chụp được mặt cắtcủa các tiểu phân Qua đánh giá này thu được hình ảnh mặt cắt ngang cấu trúccủa tiểu phân liposome, hình ảnh cấu trúc lớp vỏ lipid và bên trong nhân củaliposome

Ngoài ra hiện nay người ta còn dùng một số phương pháp đánh giá nhưchụp bằng kính hiển vi cộng hưởng từ hạt nhân (ARS) cho hình ảnh 3 chiềucủa tiểu phân, hiển vi nhiệt quét (STM), hiển vi lực nguyên tử

*Kích thước tiểu phân của liposome và phân bố kích thước tiểu phân:

KTTP của liposome liên quan nhiều đến hiệu quả đưa thuốc đến đích(mô bệnh) của liposome và hiệu quả lâm sàng, thời gian bán thải của thuốc.KTTP càng nhỏ, gần 100nm sẽ đem lại hiệu quả điều trị cao hơn [74], [110].Các tiểu phân liposome được bào chế ra có các kích thước dao động trongmột khoảng xác định Khoảng dao động này càng hẹp, kích thước các tiểuphân liposome càng đều đặn thì độ ổn định của liposome càng cao [153] Dovậy trong bào chế liposome mang dược chất, ngoài việc làm nhỏ các tiểuphân, nhà bào chế còn phải dùng các kỹ thuật để làm đồng đều hóa các tiểuphân liposome [20], [105]

Để xác định kích thước tiểu phân và phân bố kích thước tiểu phân có thể

đo trực tiếp bằng các phương pháp chụp hình ảnh trên hoặc các phương phápđánh giá như phương pháp nhiễu xạ ánh sáng động hay dùng các thiết bịlaser Kết quả thu được là kích thước của các tiểu phân trong hệ phân bố ởcác khoảng nào với tỷ lệ bao nhiêu Liên quan đến sự phân bố kích thước tiểuphân của hệ liposome là chỉ số đa phân tán PDI (polydiversity index) Chỉ sốnày càng nhỏ phản ánh kích thước các tiểu phân trong hệ liposome càngđồng đều PDI của hệ liposome dưới 0,25 được coi là phân bố hẹp, PDI trên0,5 là phân bố rộng[79]

*Hàm lượng dược chất gắn vào liposome và khả năng giải phóng dược chất:

Trong dạng thuốc có chứa liposome, tỷ lệ dược chất gắn vào liposomecàng cao thì càng thỏa mãn yêu cầu của dạng thuốc Để đánh giá hàm lượngdược chất gắn vào liposome người ta định lượng dược chất trong liposometheo phương pháp phù hợp với dược chất Tính toán lượng dược chất tổngcộng trong cả hệ và lượng dược chất chỉ gắn với liposome sẽ cho biết tỷ lệdược chất gắn vào liposome trong hệ

Sinh khả dụng in vitro của liposome được đánh giá thông qua đánh giá

khả năng giải phóng dược chất trong các môi trường xác định sau các khoảngthời gian xác định Trong đánh giá này thường sử dụng các hệ thống thẩm tích

đặt trong môi trường đệm, định lượng dược chất khuếch tán ra môi trườngbằng phương pháp định lượng có hiệu lực để đánh giá khả năng dược chấtgiải phóng ra môi trường [19],[79].

*Độ ổn định của liposome:

Một trong những lí do làm cho liposome chưa được đưa vào sản xuấthàng loạt là vấn đề độ ổn định của chế phẩm Trong quá trình bảo quảnliposome không bền về cả mặt hoá học và vật lý:

+ Về hoá học: phospholipid, thành phần chính của vỏ liposome là hợp

chất dễ bị oxy hoá Quá trình oxy hoá tăng nhanh do tác động của các yếu tố:nhiệt độ, ánh sáng, ion kim loại, pH môi trường vv [1], [2]

+Về vật lý: Có hiện tượng thay đổi tính thấm của lớp lipid trong quá

trình bảo quản gây rò rỉ dược chất và sự kết vón liposome làm giảm hiệu suấtdược chất được gắn vào liposome, thay đổi quá trình giải phóng dược chất[1], [2]

Để đánh giá độ ổn định của liposome, người ta đánh giá các chỉ tiêu chấtlượng của liposome (hính thái cảm quan, kích thước, phân bố kích thước, hàmlượng dược chất, khả năng giải phóng dược chất, vv ) sau các khoảng thờigian xác định mà liposome được bảo quản ở các điều kiện nhất định

*Sinh khả dụng của liposome:

Sinh khả dụng in vivo của liposome được đánh giá thông qua các thử

nghiệm trên động vật Có nhiều loài động vật được sử dụng để xây dựng mô

hình in vivo như thỏ, mèo, chuột, cá, gà Trong số đó, chuột được sử dụng

rộng rãi hơn cả do sự tương đồng về mặt di truyền với con người cũng như sựtiện lợi khi nuôi và chăm sóc trong phòng thí nghiệm

Mô hình in vivo có ưu điểm nổi bật là đánh giá được chính xác tác động

của thuốc lên khối u cũng như lên cơ thể do sự tương tác của cả ba yếu tố: hệmiễn dịch, khối u và thuốc quyết định Tuy nhiên, quá trình sàng lọc trên mô

hình này tốn nhiều thời gian hơn so với các mô hình khác và cần có sự theodõi chặt chẽ, thường xuyên của người làm thí nghiệm.

Sau khi động vật thử nghiệm được tiêm liposome, các thông số dượcđộng học của liposome và dược chất được xác định tại các cơ quan đích cầnđánh giá như: gan, lách, khối u, bằng các biện pháp khác nhau như bóc tách

mô, chiết dược chất, định lượng hoặc chụp ảnh huỳnh quang (kết hợp đánhdấu huỳnh quang trước đó) Qua đánh giá ở các thời điểm khác nhau sẽ chokết quả đặc điểm dược động học và đặc tính hướng đích của mẫu liposome.Các thông số này thường được so sánh với chế phẩm đối chiếu như dạng bàochế thường quy hay chế phẩm dạng liposome có sẵn [40], [41], [46], [66],[94]

*Tính an toàn của chế phẩm:

Chế phẩm liposome cần được đánh giá độc tính ở nhiều khía cạnh

+ Độc tính với tế bào in vitro: chọn tế bào cho ủ với liposome trong môi

trường thích hợp rồi xác định tỷ lệ tế bào sống sót, so sánh với chế phẩm đối

chiếu để đánh giá độc tính in vitro của mẫu liposome nghiên cứu [61], [49].

Do cấu trúc đặc biệt của hệ mang thuốc liposome là lớp vỏ phospholipid

kép, do vậy nghiên cứu trên tế bào invitro phải chứng minh được khả năng

xâm nhập vào tế bào của liposome cao hơn so với dạng dược chất tự do Ví

dụ, ưu thế của doxorubicin là phát huỳnh quang, nên dễ dàng quan sát bằngthiết bị phù hợp

Tuy nhiên, khi dùng dạng liposome, dược chất được chứa trong khoang nước, lớp lipid bao quanh sẽ ngăn cản việc phát xạ, nhất là nồng độ thấp Vìvậy khi thử nghiệm cần phải đưa thêm các chất vào lớp lipid để trợ giúp pháthiện hệ mang thuốc để đánh giá khả năng thâm nhập vào tế bào khi thửnghiệm [19], [136]

Trong một mô hình nuôi cấy tế bào 3D, Amey Bandekar và CS[19] đã

sử dụng của liposome trên tế bào ung thư biểu mô vú BT474 với số lượng 3,6

ml tế bào (105 tế bào/ml) cho mỗi đĩa Sau 5 ngày, khối cầu đạt đường kínhkhoảng 100 mm Để đánh giá khả năng tác dụng lên tế bào ung thư trên, cácdạng bào chế khác nhau của doxorubicin đã được ủ vào khối cầu với hàmlượng DOX 0,12 mmol/mL; với dạng liposome không mang dược chất để đốichiếu, hàm lượng lipid giữ ở nồng độ 333 mM.

+ Độc tính với các tổ chức: Thử trên động vật thí nghiệm Có thể xét

nghiệm các chỉ số sinh hóa hoặc đánh giá hàm lượng dược chất phân bố tạicác cơ quan để chứng minh phân bố liposome chủ yếu ở cơ quan đích, ít phân

bố tới các cơ quan lành

Trong một nghiên cứu của Lisa M Kaminskas và CS[77], độc tính của

các hệ mang thuốc liposome (L-DOX), dendrime (D-DOX) trên tế bào ungthư biểu mô Walker 256 sau 3 ngày được so sánh với dạng dung dịch Tế bàosống sót được định lượng bằng phương pháp MTT Kết quả cho thấy giá trị

IC50 của dạng liposome và dendrime gấp 10 lần so với dạng dược chất tự do Một số nghiên cứu tăng cường hướng đích cho liposome bằng cách gắnthêm các nhóm chức năng có ái lực với các thụ thể đặc hiệu tại vùng, mô, tếbào ung thư Ví dụ liposome gắn streptavidin nhằm tăng cường liên kết giữathuốc với kháng thể Thy 1.2 đặc trưng trên tế bào P388 Khả năng xâm nhập

vào tế bào invitro được thực hiện với các tế bào bệnh bạch cầu lymphocytic

P388 của chuột, được cho thêm kháng thể Thy 1.2 Tế bào được phân tíchbằng phương pháp đo dòng tế bào và kính hiển vi điện tử huỳnh quang Kếtquả cho thấy liposome gắn streptavidin có khả năng gắn vào tế bào tăng 20lần so với dạng tự do, trong khi độc tính với tế bào giảm (IC50 của dạngliposome gấp 20 lần so với dạng dược chất tự do) [86]

1.3 Các nghiên cứu về liposome doxorubicin

1.3.1 Nghiên cứu bào chế

1.3.1.1 Liposome quy ước

Liposome quy ước là liposome được bào chế với phosphatydincholin tựnhiên hoặc tổng hợp, chủ yếu hướng đích theo cơ chế thụ động và giảm độctính cho dược chất Về nguyên liệu, các nghiên cứu dùng EPC [24], [92] ; PCkết hợp với PE, PG [85]; PC kết hợp với sphingomyelin trứng[16], ngoài racòn sử dụng một tỷ lệ cholesterol để tăng độ bền cho vỏ liposome MayerLawrence D.[92],Achim Marcela[15], Rudra A[121]sử dụng phương pháphydrat hóa film, giảm kích thước liposome bằng cách ép qua màngpolycarbonat hoặc siêu âm nên kích thước trung bình dưới 100 nm, tuy nhiênMayer Lawrence D đưa dược chất vào liposome bằng chênh lệch pH thôngqua đổi đệm Hepes bằng cách lọc gel nên đạt được tỷ lệ dược chất đượcliposome hóa cao hơn

Li Chunlei và Deng YingJieđã sử dụng phương pháp đông khô để tạo ratiền liposome nhằm tăng độ ổn định Với tá dược tạo khung là đườngsacarose, doxorubicin và các chất điều chỉnh pH được phối hợp trong phanước Sử dụng 4 tỷ lệ về khối lượng của lipid/đường lần lượt là 1:1, 1:2,5,1:5, 1:7,5 Sự phối hợp các pha cho sản phẩm biến đổi từ hỗn dịch đục sangdung dịch một pha Dung dịch này được lọc vô khuẩn qua màng 0,22 µm rồiđem đông khô Sản phẩm đông khô hòa tan trở lại trong nước sẽ tạo thànhhỗn dịch liposome Từ thực nghiệm và giản đồ 3 pha thu được, nghiên cứucho thấy với tỷ lệ lipid/đường là 1:5 sẽ thu được dịch một pha và KTTPliposome đạt khoảng 150nm [85]

Cũng bằng phương pháp đông khô, nhưngBenjakul Ruthairatvà mộtnhóm tác giả Thái Lan lại sử dụng chất mang trơ dễ bay hơi là clorobutanolhemihydrat (CBN) và dung môi tert-butanol Tiền liposome khi lắc với nướcthu được liposome có kích thước khoảng 400-1000nm Mặc dù liposome thuđược có kích thước tiểu phân lớn và chưa đồng đều nhưng nghiên cứu đã đưa

ra một cải tiến rất đáng lưu ý về hệ dung môi bay hơi sử dụng [24]

Johnston Michael J W.và cộng sự đã nghiên cứu bào chế liposomedoxorubicin bằng phương pháp hòa tan ethanol (phương pháp Batzri vàKorn) Các lipid được hòa tan trong ethanol, thêm lượng nhỏ cholesterylhexa-dexyl ether, bơm dịch lipid vào dung dịch magnesi sulfat để tạo liposome.Lọc ép 10 lần qua màng polycarbonat 100nm thu được liposome kích thước110nm ± 25nm Dược chất doxorubicin pha thành dung dịch rồi phối hợpliposome ủ trong 90 phút ở 65oC để được gắn vào trong liposome Kết quảnghiên cứu chỉ ra rằng doxorubicin có thể gắn vào liposome để đạt được giátrị D/L (thuốc/lipid) cao đến 0,46 Bằng cách thay đổi giá trị D/L, tỷ lệ thuốcgiải phóng từ liposome có thể thay đổi trong một khoảng rộng và sự thay đổinày phù hợp với sự gắn thuốc ở bên trong liposome Ngoài ra, kết quả của sựlắng thuốc ở các cấu trúc bên trong liposome là nguyên nhân dẫn đến sự thayđổi cấu trúc và làm vỡ màng liposome ở tỷ lệ D/L cao trên 0,2 [75].

1.3.1.2 Liposome tuần hoàn dài và hướng đích

Ngoài các dạng bào chế được đưa ra thị trường, doxorubicin còn là mộtdược chất điển hình để nghiên cứu đưa thuốc tới đích (model drug) Liposomedoxorubicin tuần hoàn dài dựa trên nguyên tắc lớp phospholipid kép được baobằng polyme thân nước (ví dụ PEG) để “ngụy trang”, tránh quá trình thựcbào, giảm liên kết protein huyết tương, do vậy kéo dài thời gian lưu trongtuần hoàn Polyme thân nước có thể gắn trước vào phospholipid (có sẵn) ,hoặc tạo phản ứng liên kết trong quá trình bào chế Để tăng cường hướngđích, có thể sử dụng phospholipid có nhiệt độ chuyển dạng thấp, dễ giảiphóng dược chất khi kích thích bởi nhiệt; hoặc gắn thêm các nhóm chức có áilực đặc biệt với thụ thể của vùng ung thư Bảng 1.5 tổng hợp một số nghiêncứu bào chế liposome doxorubicin tuần hoàn dài và tăng cường hướng đích

Về phương pháp bào chế liposome, đa số các nghiên cứu sử dụngphương pháp hydrat hóa màng mỏng lipid, giảm kích thước liposome bằng épđùn qua màng polycarbonat có kích thước lỗ xốp giảm dần [19], [46], ; hoặc