BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ QUỐC PHÒNG HỌC VIỆN QUÂN Y ĐẶNG TRƯỜNG GIANG NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ, ĐÁNH GIÁ SINH KHẢ DỤNG, ĐỘC TÍNH VÀ TÁC DỤNG BẢO VỆ TẾ BÀO GAN CỦA PHYTOSOME SILYBIN LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC[.]
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ QUỐC PHÒNG HỌC VIỆN QUÂN Y ĐẶNG TRƯỜNG GIANG NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ, ĐÁNH GIÁ SINH KHẢ DỤNG, ĐỘC TÍNH VÀ TÁC DỤNG BẢO VỆ TẾ BÀO GAN CỦA PHYTOSOME SILYBIN LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI – 2023 MỤC LỤC Trang phụ bìa Lời cam đoan Mục lục Danh mục chữ viết tắt luận án Danh mục bảng Danh mục hình ĐẶT VẤN ĐỀ Chương TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN VỀ SILYBIN 1.1.1 Nguồn gốc 1.1.2 Cơng thức hóa học 1.1.3 Tính chất lý hóa 1.1.4 Dược động học 1.1.5 Tác dụng dược lý 1.1.6 Công dụng, liều dùng, tác dụng không mong muốn 1.1.7 Một số biện pháp cải thiện sinh khả dụng đường uống silybin 1.2 PHYTOSOME 12 1.2.1 Khái niệm 12 1.2.2 Thành phần phytosome 13 1.2.3 Ưu, nhược điểm phytosome 15 1.2.4 Phương pháp bào chế phytosome 16 1.2.5 Các tiêu đánh giá phytosome 21 1.2.6 Một số nghiên cứu bào chế phytosome silybin 26 1.3 MỘT SỐ NỘI DUNG ĐÁNH GIÁ SINH KHẢ DỤNG VÀ TÁC DỤNG BẢO VỆ TẾ BÀO GAN CỦA PHYTOSOME 26 1.3.1 Nội dung đánh giá sinh khả dụng phytosome 26 1.3.2 Nội dung đánh giá tác dụng bảo vệ gan phytosome 28 Chương NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 30 2.1.1 Nguyên vật liệu 30 2.1.2 Thiết bị nghiên cứu 31 2.1.3 Động vật thí nghiệm 32 2.1.4 Địa điểm thực nghiên cứu 33 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 34 2.2.1 Phương pháp nghiên cứu bào chế phytosome silybin 34 2.2.2 Nghiên cứu đánh giá sinh khả dụng, độc tính cấp, bán trường diễn tác dụng bảo vệ tế bào gan phytosome silybin 48 2.2.3 Phương pháp xử lý số liệu 55 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 57 3.1 KẾT QUẢ BÀO CHẾ PHYTOSOME SILYBIN 57 3.1.1 Kết nghiên cứu số tính chất silybin phospholipid 57 3.1.2 Kết nghiên cứu bào chế phytosome silybin quy mơ phịng thí nghiệm 67 3.1.3 Kết bào chế, đánh giá số đặc tính tiêu chất lượng phytosome silybin quy mô 150g/mẻ 3.1.4 Theo dõi độ ổn định phytosome silybin 88 102 3.2 KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ SINH KHẢ DỤNG, ĐỘC TÍNH VÀ TÁC DỤNG BẢO VỆ TẾ BÀO GAN CỦA PHYTOSOME SILYBIN 3.2.1 Kết đánh giá sinh khả dụng phytosome silybin 105 105 3.2.2 Kết đánh giá tác dụng độc tính cấp độc tính bán trường diễn phytosome silybin thực nghiệm 111 3.2.3 Kết nghiên cứu tác dụng bảo vệ tế bào gan phytosome silybin chuột cống trắng thực nghiệm Chương BÀN LUẬN 4.1 VỀ NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ PHYTOSOME SILYBIN 4.1.1 Về nghiên cứu số tính chất silybin phospholipid 115 119 119 119 4.1.2 Về nghiên cứu bào chế phytosome silybin quy mơ phịng thí nghiệm 120 4.1.3 Về đánh giá số đặc tính phytosome silybin 129 4.1.4 Về theo dõi độ ổn định phytosome silybin 136 4.2 VỀ ĐÁNH GIÁ SINH KHẢ DỤNG, ĐỘC TÍNH VÀ TÁC DỤNG BẢO VỆ TẾ BÀO GAN CỦA PHYTOSOME SILYBIN 137 4.2.1 Về đánh giá sinh khả dụng phytosome silybin 137 4.2.2 Về đánh giá độc tính phytosome silybin 143 4.2.3 Về đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào gan phytosome silybin 143 4.3 ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN 146 KẾT LUẬN 148 KIẾN NGHỊ 150 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH NGHIÊN CỨU CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT TT Phần viết tắt ̅ X/TB 13 C-NMR Phần viết đầy đủ Giá trị trung bình Phổ cộng hưởng từ hạt nhân đồng vị 13C (Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance) H-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân đồng vị 1H (Hydro-1 Nuclear Magnetic Resonance) 31 P-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân đồng vị 31P (Phospho-31 Nuclear Magnetic Resonance) AE Aerosil ALT Alanine Aminotransferase AST Aspartate aminotransferase ATP Adenosine triphosphat AUC0-24/∞ Diện tích đường cong nồng độ - thời gian từ thời điểm đến 24 giờ/vô 10 CR Chất rắn 11 Cmax Nồng độ đỉnh máu 12 COX Cyclooxygenase 13 CTPT Công thức phân tử 14 cs Cộng 15 DCM Dichloromethan 16 DĐVN Dược điển Việt Nam 17 DLS Tán xạ ánh sáng động học (Dynamic light scattering) 18 DMSO Dimethyl sulfoxide 19 DNA Phân tử mang thông tin di truyền (Acid Deoxyribonucleic) TT 20 Phần viết tắt DSC Phần viết đầy đủ Phân tích nhiệt quét vi sai (Differential scanning calorimetry) 21 ĐT Độ tan 22 EE Tỷ lệ hoạt chất phytosome hóa (Entrapment efficiency) 23 ESI Kỹ thuật ion hóa phun điện (Electrospray inonization) 24 EtOH Ethanol 25 h Giờ (Hours) 26 HC Hoạt chất 27 HLB Hằng số cân dầu nước (Hydrophilic Lipophilic Balance) 28 HPLC Sắc ký lỏng hiệu cao (High-performance liquid chromatography) 29 Hps Hiệu suất phun sấy 30 HQC Nồng độ định lượng cao (High Quantitative Concentration) 31 HSPC Phosphatidyl cholin đậu nành hydrogen hóa (Hydrogenated soy phosphatidyl cholin) 32 Hth Hiệu suất thu hồi hoạt chất 33 IR/ FT-IR Phổ hồng ngoại phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (Infrared spectroscopy Fourier transform Infrared spectroscopy) 34 KLPT Khối lượng phân tử 35 KTTP Kích thước tiểu phân 36 LD50 Liều gây chết 50% số động vật thí nghiệm (Lethal Dose) TT 37 Phần viết tắt LOD Phần viết đầy đủ Giới hạn phát (Limit of Detector) 38 Log P/Log D Hệ số phân bố dầu - nước (Partition coefficient/Distribution coefficient) 39 LOQ Giới hạn định lượng (Limit of Quantitation) 40 LQC Nồng độ định lượng thấp (Low Quantitative Concentration) 41 m/z Khối lượng/điện tích ion 42 MD Maltodextrin 43 MQC Nồng độ định lượng trung bình (Medium Quantitative Concentration) 44 MRT Thời gian lưu trú trung bình (mean retention/residence time) 45 MS Phổ khối lượng (Mass spectrometry) 46 NSX Nhà sản xuất 47 NXB Nhà xuất 48 NN-LN Nhỏ - Lớn 49 PBS Dung dịch muối đệm phosphat (Phosphate Buffered Saline) 50 PC Phosphatidyl cholin 51 PDI Chỉ số đa phân tán (Polydispersity index) 52 PL Phospholipid 53 PSC Phổ tương quan photon (photon correlation spectroscopy) 54 PVP Polyvinylpyrrolidone 55 RSD Độ lệch chuẩn tương đối (Relative standard deviation) 56 SD Độ lệch chuẩn (Standard Deviation) TT 57 Phần viết tắt SEM Phần viết đầy đủ Kính hiển vi điện tử quét (Scanning electron microscopy) 58 Si-A/Si-B Silybin A/ Silybin B 59 Si-PC Silybin-phosphatidyl cholin 60 Siphy/ Sitp Silybin dạng phytosome/Silybin toàn phần 61 SKD Sinh khả dụng 62 SKĐ Sắc kí đồ 63 SMEDDS Hệ phân phối thuốc tự vi nhũ hóa (self-microemulsifying drug delivery system) 64 SPC Phosphatidyl cholin đậu nành (Soy phosphatidyl cholin) 65 t1/2 Thời gian bán thải 66 TBA Tert-butylalchol 67 TD/CR Tá dược/chất rắn 68 TEM Kính hiển vi điện tử truyền qua (Transmission electron microscopy) 69 THF Tetrahydrofuran 70 Tmax Thời gian đạt tới nồng độ đỉnh máu 71 TT Thứ tự 72 tt/kl Thể tích/khối lượng 73 USP Dược điển Mỹ (United States Pharmacopoeia) 74 tt/tt Thể tích/thể tích 75 WHO Tổ chức y tế giới (World Health Organzation) 76 XRD Phổ nhiễu xạ tia X (X-ray diffraction) 77 TMTTTT Tĩnh mạch trung tâm tiểu thùy 78 HE x 200/400 Nhuộm Hematoxylin-Eosin, 200/400 lần độ phóng đại DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng Trang 1.1 Tỷ lệ mol dược chất phospholipid bào chế phytosome 17 1.2 Một số dung môi sử dụng nghiên cứu bào chế phytosome 18 1.3 Thông số nhiệt độ thời gian phản ứng bào chế phytosome 19 1.4 Một số nghiên cứu bào chế phytosome silybin 26 2.1 Danh mục nguyên liệu, hóa chất sử dụng 30 2.2 Thiết bị sử dụng nghiên cứu 31 2.3 Tương quan CI khả trơn chảy 47 2.4 Chương trình chạy sắc ký 49 2.5 Bố trí thử theo phương pháp chéo đơi 51 3.1 Hàm lượng silybin nguyên liệu 63 3.2 Độ tan silybin số dung môi 63 3.3 Độ ổn định hàm lượng silybin nhiệt độ khác 24 64 3.4 Độ ổn định hàm lượng PC nhiệt độ khác 24 65 3.5 Độ tan silybin dạng phytosome chloroform 67 3.6 Độ ổn định phytosome chloroform 68 3.7 Ảnh hưởng thời gian hòa tan đến hiệu suất phytosome hóa 68 3.8 Thơng số MS mẫu phân tích 69 3.9 Tỷ lệ hoạt chất phytosome hóa độ tan nước silybin dạng phytosome thời gian phản ứng khác 70 3.10 Độ lặp lại phương pháp xác định EE% 71 3.11 Đặc tính phức hợp Si-PC với PL khác 71 3.12 Độ ổn định phức hợp Si-PC bào chế với PL khác 72 3.13 Ảnh hưởng dung môi phản ứng tới EE% độ tan silybin nước 73 Bảng Tên bảng Trang 3.14 Ảnh hưởng lượng dung môi phản ứng đến EE% độ tan silybin nước 3.15 Ảnh hưởng tỉ lệ mol Si:PC đến EE% độ tan silybin nước 73 74 3.16 Ảnh hưởng nhiệt độ phản ứng đến EE% độ tan silybin nước 75 3.17 Ảnh hưởng thời gian phản ứng đến EE% độ tan silybin nước 75 3.18 Ảnh hưởng tốc độ khuấy trộn đến EE% độ tan silybin nước 76 3.19 Ảnh hưởng dung mơi hydrat hóa đến đặc tính phytosome silybin 78 3.20 Ảnh hưởng lượng nước hydrat hóa đến đặc tính phytosome silybin 79 3.21 Ảnh hưởng cơng suất siêu âm đến đặc tính phytosome silybin 3.22 Ảnh hưởng thời gian siêu âm đến đặc tính phytosome silybin 80 81 3.23 Ảnh hưởng loại tá dược hỗ trợ phun sấy đến đặc tính bột phytosome silybin 83 3.24 Ảnh hưởng tỷ lệ TD hỗ trợ phun sấy đến đặc tính bột phytosome silybin 85 3.25 Ảnh hưởng nhiệt độ khí đầu vào tốc độ phun dịch đến đặc tính bột phytosome silybin 86 3.26 Một số tiêu chất lượng mẫu bột phytosome silybin bào chế quy mơ 150g/mẻ 89 3.27 Độ hịa tan silybin dạng phytosome bào chế quy mô 150g/mẻ 90 PHỤ LỤC 10 KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG BẢO VỆ GAN CỦA PHYTOSOME SILYBIN Phụ lục 10.1 Khối lượng chuột trước sau thí nghiệm (n=10) Khối lượng chuột (gam/con) Lơ Trước thí nghiệm (ngày 1) Sau ngày uống mẫu Sau ngày uống mẫu Lô (chứng sinh lý) Lô (chứng bệnh lý) Lô (silymarin) Lô (silybin nguyên liệu) Lô (phytosome liều 1) Lô (phytosome liều 2) 141,3 ± 22,0 153,1 ± 19,7 147,8 ± 24,9 162,2 ± 23,5 151,5 ± 18,4 151,2 ± 27,3 143,0 ± 15,6 158,1 ± 20,8 149,3 ± 23,9 162,5 ± 33,0 157,9 ± 15,9 158,1 ± 23,6 142,7 ± 15,3 158,0 ± 19,4 150,3 ± 24,1 171,5 ± 30,9 162,9 ± 16,3 154,8 ± 18,9 P (trong ngày) P (giữa ngày) P(ngày 1)1-2-3-4-5-6:0,418; P(ngày 7)1-2-3-4-5-6:0,234 ; P (ngày 9)1-2-3-4-5-6:0,10 *P(lô1)1-7-9:0,272; **P(lô2)1-7-9:0,429; *P(lô3)1-7-9:0,142; **P(lô4)1-7-9:0,161; **P(lô5)1-7-9:0,005; **P(lô6)1-79:0,166 (*P:Kiểm định Friedman – P: Kiểm định Kruskal-Wallis – **P: Kiểm định RM one-way ANOVA) Phụ lục 10.2 Nhiệt độ chuột trước sau thí nghiệm (n=10) Nhiệt độ chuột (°C) Lô Lô (chứng sinh lý) Lô (chứng bệnh lý) Lô (silymarin) Lô (silybin nguyên liệu) Lô (phytosome liều 1) Lô (phytosome liều 2) P (trong ngày) P (giữa ngày) Trước thí nghiệm (ngày 1) Sau ngày uống mẫu Sau ngày uống mẫu 36,7 ± 0,4 36,7 ± 0,7 36,8 ± 0,5 37,2 ± 0,5 36,9 ± 0,5 36,9 ± 0,4 37,0 ± 0,4 36,4 ± 0,4 36,8 ± 0,4 37,2 ± 0,6 37,0 ± 0,5 36,8 ± 0,4 37,1 ± 0,8 36,6 ± 0,4 37,1 ± 0,5 36,7 ± 0,5 36,9 ± 0,6 37,2 ± 0,7 P(ngày 1)1-2-3-4-5-6:0,392; P (ngày 7)1-2-3-4-5-6:0,002 ; **P (ngày 9)1-2-3-4-5-6:0,123 *P(lô1)1-7-9:0,405; *P(lô2)1-7-9:0,121; *P(lô3)1-7-9:0,601; ***P(lô4)1-7-9:0,154; ***P(lô5)1-7-9:0,873; ***P(lô6)1-79:0,120 (*P:Kiểm định Friedman – P: Kiểm định Kruskal-Wallis - **P: kiểm định one-way ANOVA ***P: kiểm định RM one-way ANOVA) Phụ lục 10.3 Hình ảnh Đại thể Lơ Lô Lô Lô Lô Lô Phụ lục 10.4 Hình ảnh vi thể PL10.4.1: Hình ảnh vi thể gan chuột lô chứng sinh học (chuột số 04) (HE x 200) Nhu mơ gan bình thường PL10.4.2: Hình ảnh vi thể gan chuột lơ chứng sinh học (chuột số 01) (HE x 200) Sung huyết nhu mô gan PL10.4.3: Hình ảnh vi thể gan chuột lơ chứng bệnh lý (chuột số 15) (HE x 200) Thối hóa, hoại tử tế bào gan quanh TMTTTT PL10.4.4: Hình ảnh vi thể gan chuột lô chứng bệnh lý (chuột số 17) (HE x 200) Hoại tử nhu mô gan PL10.4.5: Hình ảnh vi thể gan chuột lơ uống silymarin (chuột số 27) (HE x 200) Viêm nhẹ khoảng cửa nhu mơ gan PL10.4.6: Hình ảnh vi thể gan chuột lơ uống silymarin (chuột số 22) (HE x 200) Thối hóa tồn tế bào gan PL10.4.7: Hình ảnh vi thể gan chuột lô uống silybin nguyên liệu (chuột số 40) (HE x 200) Thối hóa mỡ cục tế bào gan PL10.4.8: Hình ảnh vi thể gan chuột lơ uống silybin nguyên liệu (chuột số 37) (HE x 200) Thoái hóa tồn tế bào gan + viêm nhẹ khoảng cửa PL10.4.9: Hình ảnh vi thể gan chuột lơ uống phytosome silybin liều (chuột số 47) (HE x 200) Thối hóa tế bào gan quanh TMTTTT PL10.4.10: Hình ảnh vi thể gan chuột lô uống phytosome silybin liều (chuột số 44) (HE x 200) Thối hóa tồn tế bào gan, số thối hóa mỡ PL10.4.11 Hình ảnh vi thể gan chuột lô uống phytosome silybin liều (chuột số 57) (HE x 200) Nhu mô gan bình thường PL10.4.12: Hình ảnh vi thể gan chuột lơ uống phytosome silybin liều (chuột số 53) (HE x 200) Thối hóa mỡ giọt nhỏ tế bào gan PHỤ LỤC 11 QUY TRÌNH BÀO CHẾ PHYTOSOME SILYBIN QUY MƠ 150 g/mẻ HỌC VIỆN QUÂN Y PHYTOSOME Quy trình: ………… SILYBIN Có hiệu lực từ ngày ký MỤC ĐÍCH: Hướng dẫn chi tiết cách thức tiến hành bào chế phytosome silybin, nhằm bào chế sản phẩm đạt tiêu chuẩn chất lượng cách ổn định, an toàn hiệu PHẠM VI ÁP DỤNG: Phịng thí nghiệm TRÁCH NHIỆM: Tất nhân viên tham gia vào quy trình NỘI DUNG QUY TRÌNH: 4.1 Thơng tin tổng quát: - Tên nguyên liệu: Phytosome silybin - Dạng bào chế: dạng bột phun sấy - Quy cách đóng gói: Bột phun sấy chứa phytosome silybin đóng túi zipper - Cỡ mẻ: 150g 4.2 Công thức bào chế: Tên nguyên liệu Đơn vị Số lượng TT Tiêu chuẩn Silybin 95% gam 25,0 NSX Phosphatidyl cholin 90% gam 75,0 NSX Maltodextrin gam 40,0 NSX Aerosil gam 10,0 NSX EtOHtđ ml 3880,0 NSX THF ml 120,0 NSX Nước cất ml 850,0 DĐVN V 4.3 Thiết bị: TT Tên thiết bị - dụng cụ Bếp từ gia nhiệt Đơn vị Số lượng 01 Model C-MAG HS10 Bình cầu thủy tinh (6 lít) 01 SJ: 60/46 Hệ thống quay máy 01 N1200B Máy siêu âm đầu dò máy 01 01D882 Máy phun sấy ly tâm máy 01 LPG-5 4.4 Sơ đồ quy trình: 4.5 Quy trình bào chế: 4.5.1 Kiểm tra trước bào chế: - Bình cầu, sinh hàn dụng cụ thủy tinh phải rửa nước tinh khiết, tráng nước cất, sấy tủ sấy khô - Bếp khuấy từ gia nhiệt, hệ thống cô quay chân không, thiết bị siêu âm đầu dò thiết bị phun sấy phải vệ sinh lắp đặt sẵn 4.5.2 Kiểm nhận nguyên liệu: Các nguyên liệu kiểm tra chất lượng trước đưa vào bào chế theo tiêu chuẩn ghi mục 4.2 4.5.3 Cân chia xử lý nguyên liệu: Tiến hành cân chia nguyên liệu theo bảng sau: TT Tên nguyên liệu Silybin 95% Phosphatidyl cholin 90% Maltodextrin Aerosil EtOHtđ THF Nước cất 4.5.4 Tiến hành bào chế: Đơn vị gam gam gam gam ml ml ml Số lượng 25,0 75,0 40,0 10,0 3880,0 120,0 850,0 Thiết bị sử dụng Cân điện tử 1.000g Cân điện tử 1.000g Cân điện tử 1.000g Cân điện tử 1.000g Cân lò xo 10kg Cân điện tử 3.000g Cân điện tử 3.000g * Bước Tạo phức hợp - Nguyên liệu: silybin 95%, Phosphatidyl cholin 90%, EtOHtđ - Thiết bị: Bếp từ gia nhiệt C-MAG HS10, bình cầu (SJ: 60/46), sinh hàn thủy tinh hệ thống quay N1200B - Tiến hành: Hịa tan silybin 95%, PC90% vào 4,0 lít hỗn hợp dung mơi EtOHtd:THF (97:3) Sau đưa vào bình cầu dung tích lít, tiến hành phản ứng (hồi lưu) bếp từ gia nhiệt điều kiện nhiệt độ 50°C, tốc độ khuấy 100 vòng/phút thời gian 4,5 Kết thúc phản ứng, chuyển bình cầu sang máy quay chân không, tiến hành cô bốc dung môi 50°C đến tạo màng film mỏng - Nhân viên ghi chép nội dung vào phiếu theo dõi, nhân viên kiểm nghiệm kiểm tra cảm quan Yêu cầu: có hình thành màng film mỏng bình quay chân khơng * Bước Hydrat hóa giảm KTTP - Nguyên liệu: màng film phức hợp, nước cất - Thiết bị: Máy siêu âm đầu dò 01D882 - Tiến hành: Nhấc bình cầu khỏi hệ thống cất quay, sau cho từ từ 850,0 ml nước cất vào bình cầu, vừa cho vừa kết hợp khuấy trộn để tạo hỗn dịch phytosome Sau hydrat hóa hết thể tích nước chuyển bình cầu vào đầu dị siêu âm, tiến hành siêu âm 720W 12 phút - Nhân viên ghi chép nội dung vào phiếu theo dõi, nhân viên kiểm nghiệm kiểm tra cảm quan u cầu: Hỗn dịch màu trắng, khơng có tượng kết tụ tiểu phân đáy bình * Bước Phun sấy - Nguyên liệu: Hỗn dịch nano phytosome silybin, maltodextrin, aerosil - Thiết bị: Máy phun sấy ly tâm LPG-5 - Tiến hành: Sau siêu âm, tiến hành phối trộn hỗn hợp tá dược MD/AE (80/20) vào hỗn dịch Hỗn dịch phun sấy sử dụng máy LPG-5 điều kiện khí đầu vào 140°C, tốc độ cấp dịch 10ml/phút Thu bột bình thu mẫu - Nhân viên ghi chép nội dung vào phiếu theo dõi, nhân viên kiểm nghiệm kiểm tra cảm quan Yêu cầu: Bột khô tơi, màu trắng đến vàng, khơng mùi, vị đắng * Bước Đóng túi, dán nhãn - Bột phun sấy thu hồi phận thu hồi sản phẩm chuyển vào túi Zipper Đóng kín túi dán nhãn mặt ngồi túi - Nhân viên kiểm nghiệm lấy mẫu kiểm tra tiêu theo tiêu chuẩn chất lượng sản phẩm 4.5.5 Lưu ý: Tồn thơng số trình bào chế phải ghi chép cụ thể theo biểu mẫu quy trịnh TÀI LIỆU KÈM THEO: Không LƯU TRỮ HỒ SƠ: Không - HẾT TÀI LIỆU - PHỤ LỤC 12 TIÊU CHUẨN CHẤT LƯỢNG PHYTOSOME SILYBIN (DỰ THẢO) HỌC VIỆN QUÂN Y TT NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG SẢN XUẤT THUỐC PHYTOSOME SILYBIN Số TC: Si-PC.01/K69 Có hiệu lực kể từ ngày ký Phytosome silybin bào chế phản ứng tạo phức silybin phosphatidylcholin (PC), sau hydrat hóa làm khô phương pháp phun sấy YÊU CẦU KỸ THUẬT 1.1 Tính chất: Dạng bột khơ tơi, màu trắng đến vàng, không mùi, vị đắng 1.2 Mất khối lượng làm khơ: Khơng q 5% 1.3 Kích thước tiểu phân số PDI: - KTTP: Kích thước tiểu phân trung bình khơng q 300nm - Chỉ số PDI: ≤ 0,5 1.4 Chỉ số nén CI (%) KLRbk: - Chỉ số CI (%): từ 16 - 20% - KLRbk: khơng nhỏ 0,35 1.5 Định tính: Chế phẩm phải thể phép thử định tính silybin A Silybin B: Trong phần định lượng, sắc ký đồ mẫu thử phải xuất pic có thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu pic silybin A silybin B sắc ký đồ mẫu chuẩn 1.6 Định lượng: - Hàm lượng silybin dạng phytosome chế phẩm không nhỏ 10,0% (KL/KL) - Hàm lượng silybin tồn phần chế phẩm khơng nhỏ 11% (KL/KL) 1.7 Độ hòa tan: Phần trăm silybin hòa tan sau 60 phút dung dịch pH 6,8 không nhỏ 85% PHƯƠNG PHÁP THỬ 2.1 Tính chất: Kiểm tra cảm quan 2.2 Mất khối lượng làm khô: Thử theo phụ lục 9.6, DĐVN V (1 g, 1050C giờ) 2.3 Kích thước tiểu phân số PDI: - Kích thước tiểu phân phytosome silybin phân bố môi trường nước dạng hỗn dịch (huyền phù) xác định phương pháp tán xạ ánh sáng động (Dynamic Light Scattering - DLS) - Tiến hành: Cân khoảng 0,01g bột phytosome silybin, phân tán 50ml nước cất lần Tiếp tục pha loãng nước cất lần khoảng 50 - 100 lần đến quan sát mẫu dung dịch đục nhờ nhờ gần suốt tiến hành đo kích thước tiểu phân máy đo kích thước tiểu phân ZT100-Z 2.4 Chỉ số nén CI (%) KLRbk: Tiến hành theo DĐVN V, phụ lục 6.13 Một lượng bột có khối lượng xác định (m) cho vào ống đong hình trụ Thế tích khối bột ban đầu V0 Sau đó, ống đong gõ đến thể tích khơng thay đổi đọc thể tích cuối Vf Chỉ số nén bột tính theo cơng thức: CI (%) = 𝑉0 − 𝑉𝑓 × 100 𝑉𝑓 Khối lượng riêng biểu kiến tính theo cơng thức: Dbk = m/Vf Trong đó: +> Dbk: Khối lượng riêng biểu kiến bột (g/ml) +> m: Khối lượng bột/cốm đem đo (g) +> Vf: Thể tích biểu kiến bột sau gõ (ml) 2.5 Định tính: Định tính Silybin A B: phương pháp sắc ký lỏng (DĐVN V, phụ lục 5.3) Điều kiện sắc ký, mẫu chuẩn, mẫu thử, cách tiến hành phần Định lượng (mục 2.6) 2.6 Định lượng: Phương pháp sắc ký lỏng (DĐVN V, phụ lục 5.3) * Điều kiện sắc ký: cột Luna C18 (250 x 4,6 mm, µm, Phenomenex, Mỹ); detector UV, bước sóng phát 288 nm; dung mơi pha động MeOH: H3PO4: nước= 20: 0,5: 80 (A) MeOH: H3PO4: nước= 80: 0,5: 20 (B); tốc độ dòng 1,0 mL/phút; theo chương trình gradient (0-5 phút: 15 % B, 5-20 phút: 15-45 % B, 20-30 phút: 45 % B, 30-31 phút: 45-15 % B, 31-40 phút: 15% B); thể tích tiêm mẫu 10 µl; nhiệt độ cột 40ᵒC * Chuẩn bị dung dịch thử dung dịch chuẩn: Mẫu chuẩn: Cân xác khoảng 25,0 mg chuẩn silybin (gồm hỗn hợp Si-A Si-B) vào bình định mức 25 mL, hòa tan MeOH vừa đủ đến vạch để dung dịch chuẩn gốc có nồng độ khoảng 1,0 mg/mL Từ dung dịch này, chuẩn bị chuẩn làm việc có nồng độ 20 µg/mL Mẫu thử (định lượng silybin dạng phytosome): Cân xác khoảng lượng phytosome tương ứng với khoảng 0,1g silybin vào bình nón (có nắp), thêm 25mL chloroform, lắc máy lắc 10 phút Lọc dịch qua màng lọc 0,22 µm Tiến hành dịch đến cắn Sau hịa tan 10mL MeOH (siêu âm 30 phút), chuyển vào bình định mức 25mL bổ sung vừa đủ thể tích MeOH, lắc Hút 1mL chuyển vào bình định mức 25mL, bổ sung vừa đủ thể tích MeOH, lắc Lọc qua màng lọc 0,45 µm, trước định lượng HPLC Mẫu thử (định lượng silybin tồn phần): Cân xác khoảng lượng phytosome tương ứng với khoảng 0,1g silybin vào bình định mức 25mL, thêm khoảng 10mL MeOH siêu âm 30 phút, để nguội, bổ sung vừa đủ thể tích MeOH, lắc Hút 1mL chuyển vào bình định mức 25mL, bổ sung vừa đủ thể tích MeOH, lắc Lọc qua màng lọc 0,45 µm, trước định lượng HPLC * Tiến hành: Tiêm riêng biệt lần dung dịch chuẩn làm việc, lần 10µl vào máy sắc ký lỏng Tiến hành sắc ký theo điều kiện mô tả, ghi nhận sắc ký đồ, thời gian lưu diện tích pic silybin Độ lệch chuẩn tương đối thời gian lưu diện tích píc silybin khơng lớn 2,0% Tiêm 10 µl dung dịch thử dung dịch chuẩn làm việc vào hệ thống sắc ký lỏng Tiến hành sắc ký theo điều kiện nêu, ghi thời gian lưu diện tích pic silybin sắc ký đồ dung dịch Hàm lượng % (KL/KL) silybin dạng phytosome/silybin toàn phần chế phẩm tính theo cơng thức: 𝑋(%) = 𝑅𝑇 100 𝑥 25 𝑥 25 × 𝐶𝐶 × 𝑅𝐶 106 × 𝑚 Trong đó: - RT, Rc diện tích pic silybin sắc ký đồ dung dịch thử dung dịch chuẩn tương ứng - m khối lượng chế phẩm lấy định lượng (g) - CC nồng độ silybin dung dịch chuẩn (µg/ml) 2.7 Độ hịa tan: Tiến hành khảo sát độ hòa tan silybin sau: - Cân lượng mẫu (tương đương với 100mg silybin) cho vào cốc chứa môi trường thử độ hịa tan Các bình chứa nhúng bể cách thủy (37 ± 0,5)℃ - Môi trường thử độ hịa tan: mơi trường pH 6,8: 900ml dung dịch đệm phosphat (bổ sung 0,5% Tween 80 để đảm bảo điều kiện sink) - Thiết bị thử kiểu cánh khuấy với tốc độ khuấy 100 vòng/phút Sau khoảng thời gian 10, 30, 60, 120, 180, 240 phút, lấy khoảng 10ml dung dịch thử, ly tâm phút với tốc độ 10.000 vòng/phút Phần dịch lọc qua màng lọc 0,2µm định lượng hàm lượng silybin HPLC với điều kiện sắc ký tương tự mục 2.6 Tiếp theo bù khoảng 10ml dung dịch môi trường phối trộn với phần cắn sau ly tâm, sau rót vào cốc thử độ hịa tan để trì thể tích khơng đổi thời điểm khác PHỤ LỤC 13 MỘT SỐ HÌNH ẢNH KTTP CỦA PHYTOSOME SILYBIN Phụ lục 13.1 Hình ảnh KTTP phytosome silybin (mẻ 1) Phụ lục 13.2 Hình ảnh KTTP phytosome silybin (mẻ 2) Phụ lục 13.3 Hình ảnh KTTP phytosome silybin (mẻ 3)