Nghiên cứu bào chế, đánh giá sinh khả dụng, độc tính và tác dụng bảo vệ tế bào gan của phytosome silybin.Nghiên cứu bào chế, đánh giá sinh khả dụng, độc tính và tác dụng bảo vệ tế bào gan của phytosome silybin.Nghiên cứu bào chế, đánh giá sinh khả dụng, độc tính và tác dụng bảo vệ tế bào gan của phytosome silybin.Nghiên cứu bào chế, đánh giá sinh khả dụng, độc tính và tác dụng bảo vệ tế bào gan của phytosome silybin.Nghiên cứu bào chế, đánh giá sinh khả dụng, độc tính và tác dụng bảo vệ tế bào gan của phytosome silybin.Nghiên cứu bào chế, đánh giá sinh khả dụng, độc tính và tác dụng bảo vệ tế bào gan của phytosome silybin.Nghiên cứu bào chế, đánh giá sinh khả dụng, độc tính và tác dụng bảo vệ tế bào gan của phytosome silybin.Nghiên cứu bào chế, đánh giá sinh khả dụng, độc tính và tác dụng bảo vệ tế bào gan của phytosome silybin.Nghiên cứu bào chế, đánh giá sinh khả dụng, độc tính và tác dụng bảo vệ tế bào gan của phytosome silybin.Nghiên cứu bào chế, đánh giá sinh khả dụng, độc tính và tác dụng bảo vệ tế bào gan của phytosome silybin.Nghiên cứu bào chế, đánh giá sinh khả dụng, độc tính và tác dụng bảo vệ tế bào gan của phytosome silybin.Nghiên cứu bào chế, đánh giá sinh khả dụng, độc tính và tác dụng bảo vệ tế bào gan của phytosome silybin.Nghiên cứu bào chế, đánh giá sinh khả dụng, độc tính và tác dụng bảo vệ tế bào gan của phytosome silybin.Nghiên cứu bào chế, đánh giá sinh khả dụng, độc tính và tác dụng bảo vệ tế bào gan của phytosome silybin.Nghiên cứu bào chế, đánh giá sinh khả dụng, độc tính và tác dụng bảo vệ tế bào gan của phytosome silybin.Nghiên cứu bào chế, đánh giá sinh khả dụng, độc tính và tác dụng bảo vệ tế bào gan của phytosome silybin.Nghiên cứu bào chế, đánh giá sinh khả dụng, độc tính và tác dụng bảo vệ tế bào gan của phytosome silybin.Nghiên cứu bào chế, đánh giá sinh khả dụng, độc tính và tác dụng bảo vệ tế bào gan của phytosome silybin.Nghiên cứu bào chế, đánh giá sinh khả dụng, độc tính và tác dụng bảo vệ tế bào gan của phytosome silybin.Nghiên cứu bào chế, đánh giá sinh khả dụng, độc tính và tác dụng bảo vệ tế bào gan của phytosome silybin.Nghiên cứu bào chế, đánh giá sinh khả dụng, độc tính và tác dụng bảo vệ tế bào gan của phytosome silybin.Nghiên cứu bào chế, đánh giá sinh khả dụng, độc tính và tác dụng bảo vệ tế bào gan của phytosome silybin.
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ QUỐC PHÒNG HỌC VIỆN QUÂN Y ĐẶNG TRƯỜNG GIANG NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ, ĐÁNH GIÁ SINH KHẢ DỤNG, ĐỘC TÍNH VÀ TÁC DỤNG BẢO VỆ TẾ BÀO GAN CỦA PHYTOSOME SILYBIN Ngành đào tạo: Công nghệ dược phẩm bào chế thuốc Mã số: 972 02 02 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI-2023 CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HỒN THÀNH TẠI HỌC VIỆN QUÂN Y Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Hữu Mỹ PGS.TS Nguyễn Văn Long Phản biện 1: GS.TS Nguyễn Ngọc Chiến Phản biện 2: PGS.TS Đoàn Cao Sơn Phản biện 3: PGS.TS Trịnh Nam Trung Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp trường vào hồi: ngày tháng Có thể tìm hiểu luận án tại: Thư viện Quốc Gia Thư viện Học viện Quân y năm ĐẶT VẤN ĐỀ Cây kế sữa (Silybum marianum (L.) Gaertn), thuộc họ Cúc (Asteraceae) với thành phần hóa học flavonoid chứng minh có số hoạt tính sinh học quan trọng chống oxi hóa mạnh, ức chế hủy hoại tế bào gan tác nhân rượu, thuốc, đồng thời kích thích tái tạo tế bào gan; cải thiện đáng kể chức gan mật tác dụng khơng mong muốn Trong số hoạt chất thuộc nhóm flavonoid Kế sữa silybin chất chiếm tỉ lệ lớn (từ 50-70%) hoạt chất tạo nên tác dụng sinh học nhóm Tuy nhiên, silybin có độ tan tính thấm nên sinh khả dụng theo đường uống thấp Do đó, số nghiên cứu thực nhằm cải thiện độ tan, tính thấm sinh khả dụng silybin như: tạo phức với β-cyclodextrin, tạo dẫn xuất glycosid, bào chế liposome phytosome Trong số biện pháp trên, bào chế hoạt chất dạng phytosome xem hướng nghiên cứu mới, có hiệu việc nâng cao sinh khả dụng đường uống silybin Trong phytosome hoạt chất (cao chiết chất tinh khiết) thường flavonoid, polyphenol tự nhiên liên kết với phospholipid thông thường phosphatidyl cholin (PC) tạo thành tiểu phân có cấu trúc tương tự màng tế bào, qua vừa cải thiện độ tan hoạt chất dịch ruột, vừa tăng vận chuyển hoạt chất qua lớp màng lipid kép Mặt khác, phytosome hấp thu theo chế chủ động nhờ tế bào M ruột non vào tuần hồn chung qua hệ lympho, qua giảm chuyển hóa bước qua gan tăng sinh khả dụng silybin Trên giới có nhiều nghiên cứu chế phẩm phytosome nhiều hoạt chất phytosome quercetin, phytosome curcumin, phytosome trà xanh, phytosome ginkgo biloba ; có số nghiên cứu phytosome silybin Tuy nhiên, Việt Nam đến chưa có nghiên cứu bào chế phytosome silybin Bên cạnh đó, nguồn nguyên liệu phytosome nói chung phytosome silybin nói riêng chủ yếu nhập từ nước với giá thành cao ảnh hưởng phần đến việc ứng dụng rộng rãi dạng phytosome vào sản phẩm chăm sóc bảo vệ sức khỏe Do đó, việc tiến hành nghiên cứu bào chế phytosome silybin cần thiết Vì vậy, đề tài: “Nghiên cứu bào chế, đánh giá sinh khả dụng, độc tính tác dụng bảo vệ tế bào gan phytosome silybin” thực với hai mục tiêu sau: Bào chế phytosome silybin qui mơ phịng thí nghiệm Đánh giá sinh khả dụng, độc tính cấp, bán trường diễn tác dụng bảo vệ tế bào gan phytosome silybin thực nghiệm * Những đóng góp luận án: - Đã xây dựng cơng thức quy trình bào chế phytosome silybin quy mô 150g/mẻ phương pháp bốc dung môi qua giai đoạn (tạo phức hợp, hydrat hóa phun sấy tạo bột khơ) Sản phẩm thu có hàm lượng silybin dạng phytosome đạt khoảng 12%, hàm lượng silybin toàn phần đạt khoảng 13% Phytosome silybin bào chế cải thiện đáng kể độ tan, độ hòa tan silybin so với silybin nguyên liệu Bột phytosome có đặc tính (độ ẩm, CI KLRbk) thích hợp ứng dụng vào dạng viên nang cứng, viên nén, cốm, bột Đã đề xuất tiêu chuẩn chất lượng cho bột phytosome silybin theo dõi ổn định điều kiện phịng thí nghiệm lão hóa cấp tốc thời gian 06 tháng - Đã xây dựng mơ hình đánh giá sinh khả dụng phytosome silybin chó ta thực nghiệm Mơ hình có tính khả thi áp dụng cho nghiên cứu tương tự Phương pháp phân tích đủ độ nhạy, đặc hiệu để xác định nồng độ chất dạng phytosome dịch sinh học với nồng độ thấp (cỡ ng/mL) - Đã chứng minh silybin dạng phytosome cải thiện sinh khả dụng tác dụng bảo vệ tế gan động vật thực nghiệm Những kết đề tài làm sở cho nghiên cứu bào chế dạng phytosome cho hoạt chất khác (thuộc nhóm flavonoid) có độ tan kém, tính thấm sinh khả dụng thấp Từ góp phần vào phát triển dạng phytosome ứng dụng bào chế sản phẩm thuốc, thực phẩm bảo vệ sức khỏe Việt Nam * Nội dung cấu trúc luận án: Luận án bao gồm 150 trang Đặt vấn đề: trang; chương (tổng quan): 27 trang; chương (nguyên vật liệu phương pháp nghiên cứu): 27 trang; chương (kết nghiên cứu): 62 trang; chương (bàn luận): 29 trang; kết luận kiến nghị: trang * Tài liệu tham khảo: Luận án bao gồm 184 tài liệu, có 167 tài liệu tiếng Anh Chương TỔNG QUAN Tổng quan luận án cập nhật vấn đề: - Về silybin: Nguồn gốc; công thức hóa học; tính chất lý hóa; dược động học; tác dụng dược lý; công dụng, liều dùng, tác dụng không mong muốn; số biện pháp cải thiện sinh khả dụng đường uống silybin theo tài liệu công bố - Về phytosome: Khái niệm; thành phần; ưu, nhược điểm; phương pháp bào chế; tiêu đánh giá; số nghiên cứu bào chế phytosome silybin theo tài liệu công bố - Về nội dung đánh giá sinh khả dụng (SKD) tác dụng bảo vệ tế bào gan phytosome: tổng quan nội dung theo tài liệu công bố Chương NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 2.1.1 Nguyên vật liệu Nguyên liệu bào chế đạt tiêu chuẩn nhà sản xuất gồm: Silybin 95%, PC90%, Ethanoltđ, THF, maltodextrin, aerosil Các chất chuẩn, hóa chất đạt tiêu chuẩn phân tích 2.1.2 Thiết bị nghiên cứu Các thiết bị gồm: Máy khuấy từ gia nhiệt IKA CMAG HS4HS10 (Malaysia), Máy siêu âm đồng hóa 01D882 (Hàn Quốc), Thiết bị cất quay chân khơng EYELA - N1200B (Nhật Bản), Thiết bị phun sấy LPG5 (Trung Quốc), hệ thống HPLC, máy đo kích thước tiểu phân, máy đo phổ DSC, NMR, IR, XRD, máy phân tích huyết học, máy xét nghiệm sinh hóa … 2.1.3 Động vật thí nghiệm Chuột cống trắng chủng Wistar, giống (không mang thai, không nuôi con/cho bú), 8-12 tuần, cân nặng 190±20g chuột nhắt trắng chủng Swiss, giống, khoẻ mạnh, cân nặng 1822g Chuột cống trắng chủng Wistar, hai giống, khỏe mạnh, cân nặng 180±20g Chuột cống trắng, giống, từ tháng tuổi, cân nặng 120±20g Chó ta, giống đực khỏe mạnh, cân nặng 10-12kg 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1 Phương pháp nghiên cứu bào chế phytosome silybin 2.2.1.1 Nghiên cứu số tính chất silybin phospholipid a Thẩm định phương pháp định lượng silybin A silybin B nguyên liệu phức hợp Si-PC HPLC * Chuẩn bị: Mẫu chuẩn: dãy chuẩn Si-A có nồng độ từ 2,35 đến 94,12 µg/mL dãy chuẩn Si-B có nồng độ từ 2,45 đến 97,96 µg/mL (trong MeOH) Mẫu trắng nguyên liệu: MeOH Mẫu trắng phức hợp: PC thực quy trình bào chế mẫu thử phức hợp Si-PC Mẫu thử nguyên liệu: nguyên liệu silybin MeOH Mẫu thử phức hợp Si-PC: Hòa tan silybin PC theo tỉ lệ hỗn hợp dung mơi THF EtOHtđ Hỗn hợp trì nhiệt độ 50°C khoảng Sau phản ứng, hỗn hợp bốc áp suất giảm để tạo màng film Thêm cloroform vào hòa tan, ly tâm lấy dịch, lọc qua màng 0,22 µm Dung dịch pha loãng tới nồng độ cần thiết MeOH, trước phân tích HPLC * Điều kiện sắc ký: cột C18 (250x4,6 mm, 5µm); detector UV, 288 nm, tốc độ dòng 1,0 mL/phút, nhiệt độ cột 40°C Pha động: MeOH: H3PO4: nước (20:0,5:80) (A) MeOH: H 3PO4: nước (80:0,5:20) (B) theo chương trình gradient (0-5 phút: 15 % B, 5-20 phút: 15-45 % B, 20-30 phút: 45 % B, 30-31 phút: 45-15 % B, 31-40 phút: 15% B) * Thẩm định phương pháp: Tính tương thích hệ thống; tính chọn lọc, độ đặc hiệu; khoảng tuyến tính; độ lặp lại, độ đúng, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng, theo yêu cầu chung ICH b Thẩm định phương pháp định lượng phosphatidyl cholin nguyên liệu HPLC * Chuẩn bị: Mẫu chuẩn: chuẩn bị dãy chuẩn PC MeOH từ 9,90 - 198,00 µg/mL Mẫu trắng: MeOH Mẫu thử: nguyên liệu PC MeOH pha loãng tới nồng độ cần thiết, lọc qua màng lọc 0,22µm, trước phân tích HPLC * Điều kiện sắc ký: cột C18 (250x4,6mm, 5µm); detector UV, 205 nm, tốc độ dòng 1,0 mL/phút, nhiệt độ cột 40°C Hệ dung môi ACN:MeOH:nước (30:65:5) chạy theo chương trình đẳng dịng * Thẩm định phương pháp: Tính tương thích hệ thống, tính chọn lọc, độ đặc hiệu, khoảng tuyến tính, độ lặp lại, độ đúng, giới hạn phát giới hạn định lượng theo yêu cầu chung ICH c Xác định hàm lượng silybin ngun liệu Hịa tan xác khoảng 0,1 g ngun liệu silybin MeOH bình định mức 100 mL, pha lỗng MeOH đến nồng độ thích hợp, lọc qua màng lọc 0,45 µm trước định lượng HPLC d Xác định độ tan silybin số dung môi Cân lượng dư nguyên liệu silybin vào bình nón nút mài, thêm khoảng 10 mL dung môi khảo sát, lắc 250C, với tốc độ 200 vịng/phút 48 Sau đem ly tâm 4.000 vòng/phút 15 phút, lớp dịch đem lọc qua màng lọc 0,2 µm, pha lỗng MeOH (nếu cần), trước định lượng HPLC Các dung môi khảo sát gồm: EtOHtđ, EtOH 96%, hỗn hợp EtOH tđ:THF với tỷ lệ khác nhau, nước cất, chloroform, n-octanol, THF e Độ ổn định hàm lượng silybin phosphatidyl cholin khoảng nhiệt độ khác Cân xác khoảng 0,1g silybin; khoảng 0,15g phosphatidyl cholin vào bình cầu, thêm 20ml hỗn hợp dung môi EtOHtđ:THF (97:3) vào hòa tan, gia nhiệt nhiệt độ khảo sát (nhiệt độ phòng, 40, 50, 60 700C) 24 Sau chuyển vào bình định mức 100 mL, vừa đủ MeOH Lọc qua màng lọc 0,45 µm, pha loãng MeOH, trước định lượng HPLC So sánh hàm lượng hoạt chất trước sau thời gian khảo sát Phần dịch MeOH cịn lại đem áp suất giảm 40 0C đến cắn Cắn thu đem đo phổ FTIR So sánh phổ FTIR mẫu nhiệt độ với mẫu ban đầu 2.2.1.2 Nghiên cứu bào chế phytosome silybin quy mô phịng thí nghiệm Tiến hành bào chế phytosome silybin theo giai đoạn (tạo phức hợp, hydrat hóa phun sấy tạo bột khô): a Giai đoạn tạo phức hợp Si-PC * Khảo sát ảnh hưởng yếu tố công thức bào chế: Loại phospholipid: PC 90% PC50% Loại dung môi phản ứng: EtOH hỗn hợp EtOHtđ:THF Lượng dung môi phản ứng (CR/DM): 0,5%, 1,0%, 1,5%, 2,0% Tỉ lệ mol Si:PC: 1:0,5; 1:1; 1:2; 1:3, 1:4 * Khảo sát ảnh hưởng thông số kỹ thuật quy trình bào chế: Nhiệt độ phản ứng: nhiệt độ phòng; 40°C; 50°C; 60°C; 70°C Thời gian phản ứng: 2; 3; 4; 5; Tốc độ khuấy trộn: 50; 100; 150 vòng/phút * Chỉ tiêu đánh giá: EE%, độ tan silybin nước độ hòa tan phức hợp so với nguyên liệu silybin ban đầu b Giai đoạn hydrat hóa phức hợp * Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến q trình hydrat hóa: Loại dung mơi hydrat hóa: nước; đệm phosphat 6,8 7,4 Lượng dung mơi hydrat hóa: tỉ lệ DM/CR (tt/kl) 6:1; 8:1; 10:1; 12:1 * Khảo sát yếu tố đến trình làm giảm đồng KTTP: Mức lượng siêu âm: 600W, 720W, 840W 1.080W Thời gian siêu âm: 3, 5, 10, 15 phút * Chỉ tiêu đánh giá: KTTP, PDI, Zeta, EE%, độ tan silybin nước độ hòa tan phytosome silybin trước sau hydrat hóa c Giai đoạn phun sấy tạo bột phytosome silybin * Khảo sát ảnh hưởng loại tá dược hỗ trợ phun sấy: Các tá dược Maltodextrin (MD) Aerosil (AE) tỷ lệ: MD/AE (100:0); MD/AE (0:100); MD/AE (80:20); MD/AE (60:40); MD/AE (40:60) mẫu không sử dụng tá dược * Khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ tá dược hỗ trợ phun sấy: Tiến hành phun sấy với tỷ lệ tá dược so với lượng chất rắn hỗn dịch (TD/CR) = 1:1; 0,5:1; 0,4:1; 0,2:1 * Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ khí đầu vào tốc độ phun dịch: Khảo sát nhiệt độ 120, 140 160°C tốc độ phun dịch 5, 10 15ml/phút * Chỉ tiêu đánh giá: độ ẩm, KLR, CI, Hps, Hth, hàm lượng Sitp, hàm lượng Siphy, độ tan silybin nước, độ hòa tan phytosome silybin trước sau phun sấy 2.2.1.3 Phương pháp đánh giá đặc tính số tiêu chất lượng phytosome silybin a Xác định tỷ lệ hoạt chất phytosome hóa: Tỷ lệ hoạt chất phytosome hóa tính theo cơng thức: EE% = HL silybin dạng phytosome/HL silybin tồn phần Trong đó: Hàm lượng silybin dạng phytosome: Hòa tan lượng phytosome tương ứng với khoảng 0,1g silybin chloroform, lắc máy lắc 10 phút Lọc dịch qua màng lọc 0,22 µm Sau đó, hút xác 5,0 ml dịch lọc tiến hành pha loãng MeOH đến nồng độ cần thiết Lọc qua màng lọc 0,45 µm, trước định lượng HPLC Hàm lượng silybin tồn phần: Hịa tan lượng phytosome tương ứng với 0,1g silybin MeOH, pha loãng đến nồng độ thích hợp, sau lọc qua màng 0,45 µm tiến hành sắc ký với điều kiện tương tự b Hình thái cấu trúc tiểu phân: Chụp TEM: Bột phytosome silybin phun sấy phân tán nước cất với tỷ lệ nước/CR = 10:1, khuấy phút Sau ly tâm tốc độ 10.000 vòng/phút để thu lấy phần tủa Phần tủa rửa tiếp lần nước cất, sau hydrat hóa trở lại với nước cất (tỷ lệ nước/CR = 20:1), khuấy phút Sau lọc qua giấy lọc có kích thước lỗ lọc 3µm, thu lấy phần hỗn dịch, pha loãng mẫu để chụp TEM Chụp SEM: Cân khoảng 0,05-0,1g mẫu (bột phytosome phun sấy, MD, AE, Silybin nguyên liệu) gắn lên giá đo băng dính dẫn điện C, mẫu khơng dẫn điện cho vào máy phủ chất dẫn Pt khoảng 30-50S Sau cho mẫu vào buồng mẫu đo c KTTP, PDI: Tiến hành đo máy Horiba SZ-100, sử dụng cuvet disposable cuvett cell Ánh sáng tán xạ đo góc 90° d Thế Zeta: Tiến hành tương tự 2.2.1.3.c với cuvet zeta electrode cell với số đếm nằm khoảng 300 - 400 kcps e Mất khối lượng làm khô: Thử theo Phụ lục 9.6, DĐVN V (1 g, 1050C giờ) f Độ tan hoạt chất: Độ tan silybin dạng phytosome dung môi tiến hành theo mô tả mục 2.2.1.1.d g Hệ số phân bố dầu-nước: log D tính theo cơng thức: LogD = Log(([Silybin]/n-octanol)/([Silybin]/pha nước)) Trong đó: [Silybin]/n-octanol: Nồng độ silybin dạng phân tử pha noctanol [Silybin]/pha nước: Nồng độ silybin (dạng ion hóa dạng phân tử) pha nước pH khác h Độ hòa tan hoạt chất: Phương pháp cánh khuấy với lượng mẫu (tương đương với 100mg silybin) cốc chứa môi trường thử (Môi trường pH 1,2 + 0,5% Tween 80 môi trường pH 6,8 + 0,5% Tween 80) Sau khoảng thời gian 10, 30, 60, 120, 180, 240 phút, lấy 10ml dung dịch thử, ly tâm phút với tốc độ 10.000 vòng/phút Phần dịch lọc qua màng lọc 0,2µm để định lượng HPLC i Đánh giá tương tác phân tử hoạt chất phospholipid - Phân tích phổ hồng ngoại FTIR: Lấy khoảng 5-10 mg mẫu làm khô, trộn nghiền mịn với kali bromid, hỗn hợp đồng đem dập thành viên mỏng Tiến hành quét phổ vùng từ 400 - 4000 cm-1 với mẫu: silybin, PC, phức hợp Si-PC hỗn hợp vật lý Silybin - PC - Phân tích nhiệt vi sai (DSC): Cân khoảng 2-6 mg làm khơ, đặt đĩa nhơm tích 40 µL, hàn nắp đĩa nhơm, đưa vào buồng máy Tiến hành quét nhiệt từ nhiệt độ phòng đến 725°C, tốc độ gia nhiệt 5°C/phút, tốc độ thổi khí nitrogen 40 µl/phút với mẫu: silybin, PC, phức hợp Si-PC hỗn hợp vật lý Silybin - PC - Phân tích phổ nhiễu xạ tia X (XRD): Tiến hành đo phổ nhiễu xạ tia X mẫu silybin, PC, phức hợp Si-PC hỗn hợp vật lý Silybin - PC nhiễu xạ kế tia X với bước sóng tia X lấy từ xạ Kα đồng kim loại λCu = 1,5406Ǻ, cường độ dòng điện 40 mA, điện áp 40 kV, góc quét từ 5°-60° với tốc độ quay góc θ = 1°/phút, nhiệt độ 25°C - Phân tích phổ cộng hưởng từ 1H-NMR 13C-NMR: Hòa tan mẫu (silbyin, PC phức hợp Si-PC) vào dung môi DMSO (sử dụng dung môi deuterium); tiến hành đo phổ 1H-NMR (500 MHz) 13 C-NMR (125 MHz) 12 enzyme AST, ALT mổ chuột để quan sát vi, đại thể gan chuột Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 KẾT QUẢ BÀO CHẾ PHYTOSOME SILYBIN 3.1.1 Kết nghiên cứu số tính chất silybin phospholipid 3.1.1.1 Kết thẩm định phương pháp định lượng silybin A silybin B HPLC - Tính tương thích hệ thống: Phương pháp định lượng có số đĩa lý thuyết Si-A si-B >39000 >44000; hệ số đối xứng 1,38 1,34 RSD thời gian lưu diện tích pic Si-A Si-B nhỏ 2% Phương pháp phân tích đảm bảo ổn định phù hợp để định lượng silybin mẫu - Tính chọn lọc, đặc hiệu: Tại vị trí xuất đáp ứng pic Si-A Si-B sắc ký đồ mẫu chuẩn, xuất pic tương ứng SKĐ mẫu thử đồng thời không xuất pic tương ứng mẫu trắng Pic silybin A silybin B mẫu thử cân đối, sắc nét, độ rộng chân pic nhỏ, tách hoàn toàn khỏi pic tạp Phương pháp phân tích đảm bảo độ chọn lọc đặc hiệu - Khoảng nồng độ tuyến tính: Trong khoảng nồng độ khảo sát, có mối liên hệ tuyến tính diện tích pic nồng độ chất phân tích Đường hồi quy Si-A Si-B đường thẳng (y = 22527x + 6475,9 y = 22174x + 12322) với hệ số tương quan R gần (0,9995 0,9992) - Độ lặp lại: RSD điểm khảo sát ngày khác ngày < % Phương pháp xây dựng đảm bảo độ lặp lại - Độ đúng: Độ thu hồi phương pháp lớn 95% mẫu thử nguyên liệu phức Si-PC Phương pháp định lượng đáp ứng yêu cầu độ - Giới hạn phát giới hạn định lượng: LOD LOQ Si-A 0,003 µg/mL 0,009 µg/mL; Si-B 0,004 µg/mL 0,012 µg/mL 3.1.1.2 Kết thẩm định phương pháp định lượng PC - Tính chọn lọc, đặc hiệu: Tại vị trí xuất đáp ứng pic chất cần phân tích sắc ký đồ mẫu chuẩn, xuất pic tương ứng 13 SKĐ mẫu thử đồng thời không xuất pic tương ứng mẫu trắng Pic PC mẫu thử cân đối, sắc nét, độ rộng chân pic nhỏ Phương pháp đảm bảo tính chọn lọc đặc hiệu - Tính tương thích hệ thống: RSD thời gian lưu diện tích pic phosphatidyl cholin nhỏ 2% Phương pháp phân tích tương thích với hệ thống sắc ký - Khoảng nồng độ tuyến tính: Đường hồi quy PC đường thẳng y = 9001,3x - 3621,6 với hệ số tương quan R 0,9996 Phương pháp định lượng đáp ứng yêu cầu khoảng tuyến tính - Độ lặp lại: RSD điểm khảo sát ngày khác ngày < 2% Phương pháp xây dựng đảm bảo độ lặp lại - Độ đúng: Độ thu hồi phương pháp lớn 95% Phương pháp định lượng đáp ứng yêu cầu độ - Giới hạn phát giới hạn định lượng: giá trị LOD LOQ PC 0,40 µg/mL 1,33 µg/mL 3.1.1.3 Kết xác định hàm lượng silybin mẫu nguyên liệu Kết cho thấy silybin nguyên liệu có hàm lượng silybin đạt 96,21 % (tỷ lệ si-A si-B xấp xỉ 49% 51%) 3.1.1.4 Kết đánh giá độ tan silybin số dung môi Silybin thực tế không tan nước (9,29 µg/mL) chloroform (4,96 µg/mL) Độ tan silybin EtOH 96% giảm khoảng lần so với EtOH tuyệt đối Khi thêm THF vào EtOH tđ, độ tan silybin hỗn hợp dung môi tăng từ 1,5 đến 2,5 lần so với dùng cồn tuyệt đối 3.1.1.5 Kết đánh giá độ ổn định hàm lượng silybin PC nhiệt độ khác Mẫu silybin PC ổn định hàm lượng dung môi phản ứng khoảng nhiệt độ khảo sát 24 3.1.2 Kết nghiên cứu bào chế phytosome silybin quy mơ phịng thí nghiệm 3.1.2.1 Kết xây dựng phương pháp xác định EE% Có thể sử dụng chloroform để tách riêng silybin dạng tự phytosome mẫu bào chế, qua xác định tỷ lệ hoạt chất phytosome hóa Phương pháp đảm bảo độ xác độ lặp lại 14 3.1.2.2 Kết giai đoạn bào chế phức hợp Si-PC Các thông số gồm: Dung môi phản ứng: hỗn hợp dung môi EtOHtđ:THF = 97:3 (tt/tt); tỉ lệ chất tham gia phản ứng/dung môi 2,0%; tỉ lệ mol Si:PC 1:2; nhiệt độ phản ứng 50 0C; thời gian phản ứng giờ; tốc độ khuấy trộn: 50 vòng/phút 3.1.2.3 Kết giai đoạn hydrat hóa phức hợp Si-PC Các thơng số gồm: dung mơi hydrat hóa màng film nước; tỉ lệ nước/chất rắn 8:1 Hỗn dịch thu tiến hành siêu âm với mức lượng siêu âm 720 W thời gian 10 phút 3.1.2.4 Kết giai đoạn phun sấy tạo bột phytosome silybin Các thông số gồm: Tá dược hỗ trợ phun sấy: MD/AE (80/20); tỷ lệ tá dược/chất rắn: 0,5:1; nhiệt độ khí đầu vào: 140ºC; tốc độ cấp dịch: 10mL/phút Mẫu bột phytosome thu có hàm lượng Si khoảng 13%, Siphy khoảng 12% độ tan silybin nước tăng khoảng 59 lần so với silybin dạng tự 3.1.3 Kết bào chế, đánh giá số đặc tính tiêu chất lượng phytosome silybin quy mô 150g/mẻ 3.1.3.1 Bào chế phytosome silybin quy mô 150g/mẻ Tiến hành bào chế phytosome silybinn quy mô 150g/mẻ với thiết bị gồm: Bếp từ gia nhiệt C-MAG HS10, hệ thống cất quay N1200B sử dụng bình cầu (SJ: 60/46) dung tích lít, máy siêu âm đầu dị 01D882 máy phun sấy ly tâm LPG-5 Tiến hành điều chỉnh số nội dung sau: Tỷ lệ HC/DM từ 2,0% thành 2,5% Thời gian phản ứng từ 4,0 lên 4,5 Tốc độ khuấy trộn từ 50 vòng/phút lên 100 vòng/phút Tỷ lệ nước/CR từ 8:1 thành 8,5:1 Thời gian siêu âm từ 10 phút lên 12 phút Kết cho thấy, mẫu thu khơng có khác biệt tiêu độ ẩm, KLR, CI, hàm lượng Sitp, hàm lượng Si phy, Hth, độ hòa tan so với mẫu nghiên cứu giai đoạn phun sấy Từ kết quy trình bào chế phytosome silybin 150g/mẻ sau: Hòa tan silybin 95%, PC90% (tỷ lệ mol 1:2) vào 4,0 lít hỗn hợp dung mơi EtOH td:THF (97:3) Sau đưa vào bình cầu, tiến hành phản ứng (hồi lưu) bếp từ gia nhiệt điều kiện nhiệt độ 50°C, tốc độ khuấy 100 vòng/phút thời gian 4,5 Kết thúc phản ứng, chuyển bình cầu sang 15 máy quay chân không, tiến hành cô bốc dung môi 50°C đến tạo màng film mỏng Sau cho từ từ 850,0 ml nước cất vào bình cầu, vừa cho vừa kết hợp khuấy trộn để tạo hỗn dịch phytosome Sau hydrat hóa hết thể tích nước chuyển bình cầu vào đầu dị siêu âm, tiến hành siêu âm 720W 12 phút Sau siêu âm, tiến hành phối trộn hỗn hợp tá dược MD/AE (80/20) vào hỗn dịch Hỗn dịch phun sấy điều kiện khí đầu vào 140°C, tốc độ cấp dịch 10ml/phút Bột phytosome thu đóng gói bảo quản túi zip (PE pha nhôm) 3.1.3.2 Đánh giá số đặc tính số tiêu chất lượng phytosome silybin bào chế quy mô 150g/mẻ dự kiến tiêu chuẩn chất lượng phytosome silybin Tiến hành bào chế 03 mẻ phytosome silybin với công thức bào chế thể bảng 3.28 Bảng 3.28 Thành phần công thức bào chế phytosome silybin 150g/mẻ STT Thành phần Silybin 95% Phosphatidyl cholin 90% Maltodextrin Aerosil EtOHtđ THF Nước cất Đơn vị gam gam gam gam ml ml ml Số lượng 25,0 75,0 40,0 10,0 3880,0 120,0 850,0 Kết đánh giá hình thành liên kết Si PC: Trên phổ DSC phức hợp Si-PC, hai đỉnh thu nhiệt silybin PC hoàn toàn biến Thay vào đỉnh thu nhiệt thấp 72,6oC Điều gợi ý có hình thành liên kết silybin PC Phổ IR phức hợp cho thấy pic 3609,13 cm -1 nhóm hydroxyl (O-H) tự phân tử silybin biến mất, đồng thời pic 3454,85 3131,83 cm-1 có dịch chuyển số sóng thành 3398,96 3010,34 cm-1 Bên cạnh đó, pic hấp thụ nhóm P=O PC có dịch chuyển số sóng từ 1243,86 cm -1 thành 1238,08 cm-1 Như vậy, có liên kết nhóm –OH tự Si nhóm PO 4- PC Trên phổ XRD phức hợp đỉnh nhiễu xạ Si PC biến Chứng tỏ Si tồn dạng 16 vơ định hình phức hợp Phổ 1H-NMR phức hợp cho thấy: Tín hiệu 10,53 ppm nhóm -OH bị mất, tín hiệu -OH lại yếu, thấp tù so sánh với tín hiệu silybin tinh khiết Trên phổ 13C-NMR phức hợp so với PC (độ sai khác) vùng choline gồm: (δ) N(CH3) 53,096 - 53,078 (+0,018); C2 57,958 – 57,886 (+0,072); C3 62,270 62,220 - 62,176 62,130 (+0,094/+0,096) Độ dịch chuyển hóa học nhóm khác có xu hướng dịch trường mạnh (bên phải) so sánh phức hợp với Si PC Carbon 2,3 gần nhóm PO4- PC bị ảnh hưởng nhiều Tiến hành đánh giá số tiêu chất lượng phytosome bào chế dự kiến tiêu chuẩn chất lượng (Bảng 3.35): Bảng 3.35 Dự kiến tiêu chuẩn sở phytosome silybin Tiêu chuẩn Tính chất KTTP (nm) PDI Độ ẩm (%) CI (%) KLRbk (g/ml) Định (HPLC) tính Định lượng (HPLC) Siphy (%) Sitp (%) % Silybin hòa tan sau 60 phút dd pH 6,8 Mẻ Mẻ Mẻ Đề xuất tiêu chuẩn dạng bột khô tơi, màu trắng vàng, không mùi, vị đắng 189,5 ± 188,7 ± 187,9 ± Không 300nm 6,4 7,9 8,0 0,430 ± 0,443 ± 0,437 ± Không 0,5 0,011 0,024 0,021 3,47 ± 3,46 ± 3,45 ± Không % 0,16 0,16 0,14 19,20 ± 19,33 ± 19,13 ± 16 - 20 0,80 0,83 0,76 0,415 ± 0,418 ± 0,416 ± Không nhỏ 0,35 0,013 0,014 0,015 bột phytosome silybin thể peak trùng với peak silybin chuẩn sắc ký đồ - Hàm lượng silybin dạng 12,68 ± 12,60 ± 12,69 ± phytosome mẫu 0,82 0,40 0,67 không 10,0% - Hàm lượng silybin toàn 13,43 ± 13,48 ± 13,56 ± phần mẫu không 0,40 0,39 0,50 11,0% 91,71 ± 3,46 90,06 ± 4,07 93,70 ± 2,90 ≥ 85% 3.1.4 Theo dõi độ ổn định phytosome silybin 17 Kết sau tháng bảo quản điều kiện (Điều kiện phịng thí nghiệm điều kiện lão hóa cấp tốc): Hệ tiểu phân phytosome silybin tồn dạng cấu trúc hình thái ban đầu KTTP PDI thay đổi không đáng kể (p>0,05) Chỉ tiêu khối lượng làm khơ, hàm lượng Siphy, hàm lượng Sitp độ hịa tan mẫu mẻ bào chế nằm giới hạn cho phép 3.2 KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ SINH KHẢ DỤNG, ĐỘC TÍNH VÀ TÁC DỤNG BẢO VỆ TẾ BÀO GAN CỦA PHYTOSOME SILYBIN 3.2.1 Kết đánh giá sinh khả dụng phytosome silybin 3.2.1.1 Kết xây dựng phương pháp định lượng silybin A silybin B huyết tương chó HPLC - Độ chọn lọc - đặc hiệu: Tại vị trí xuất đáp ứng pic Si-A Si-B sắc ký đồ mẫu silybin huyết tương không xuất pic tương ứng mẫu trắng Pic catechin, silybin A silybin B mẫu thử cân đối, sắc nét, độ rộng chân pic nhỏ, tách hoàn toàn khỏi pic tạp Phương pháp đảm bảo độ chọn lọc đặc hiệu - Tính tương thích hệ thống: RSD thời gian lưu diện tích pic catechin, Si-A Si-B nhỏ 2% Phương pháp phân tích tương thích với hệ thống sắc ký - Khoảng nồng độ tuyến tính: Trong khoảng nồng độ khảo sát, có mối liên hệ tuyến tính tỷ lệ diện tích pic (S silybin /Scatechin) nồng độ chất phân tích Đường hồi quy Si-A Si-B đường thẳng (y = 0,488x – 0,0194 y = 0,4996x – 0,0177) với hệ số tương quan R2 gần (0,9997 0,9997) - Độ xác: Độ lặp lại: RSD điểm khảo sát ngày khác ngày < 3% Phương pháp xây dựng đảm bảo độ lặp lại Độ lặp lại trung gian: RSD điểm khảo sát < 3% Phương pháp xây dựng đảm bảo độ lặp lại trung gian Độ tái lặp: RSD điểm khảo sát < 3% Phương pháp xây dựng đảm bảo độ tái lặp - Độ đúng: Ở điểm khảo sát, độ thu hồi phương pháp lớn 85% Phương pháp định lượng đáp ứng yêu cầu độ 18 - Giới hạn phát giới hạn định lượng: Giá trị LOD LOQ Si-A 4,69 ng/mL 14,20 ng/mL; Si-B 2,79 ng/mL 8,46 ng/mL - Độ ổn định mẫu: Độ ổn định ngày: Định lượng silybin mẫu LQC, MQC HQC sau thời gian để ổn định 24 giờ, cho độ thu hồi 110,42 - 116,43%; 104,17 108,95%; 98,30 - 99,10% Silybin ổn định huyết tương sau thời gian 24 Độ ổn định sau chu kỳ rã đông: Định lượng silybin mẫu LQC, MQC HQC sau chu kỳ đông-rã, cho độ thu hồi 99,64 - 111,65%; 85,34 - 105,44%; 89,67 - 103,21% Silybin ổn định huyết tương sau chu kỳ đông- rã 3.2.1.2 Kết đánh giá sinh khả dụng phytosome silybin chó thực nghiệm Bảng 3.40 Các thông số dược động học silybin nguyên liệu phytosome silybin (n=6) Thông số Tmax Cmax t1/2 MRT AUC0-14 (1) AUC0- (2) ng/ml giờ Silybin nguyên liệu (a) 5,2 ± 0,8 945,2±26,0 3,6±0,6 8,11±0,6 Phytosome silybin (b) 3,5 ± 0,5 1547,7±93,7 4,7±0,6 8,82±0,4 ng/ml.giờ 6683,8±748,1 11024,6±885,7 ng/ml.giờ 7693,1±637,2 Đơn vị (1)/(2) % Ln[AUC0-14] Ln[AUC0-∞] Ln[MRT] Ln[Cmax] 86,5±2,9 8,80 ± 0,11 8,95 ± 0,08 2,09 ± 0,07 6,85 ± 0,03 13471,2±1072, 81,9±1,8 9,31 ± 0,08 9,51 ± 0,08 2,18 ± 0,05 7,34 ± 0,06 Pa-b 0,008* 0,0156 pa-b < 0,0001 pa-b < 0,0001 pa-b: 0,042 pa-b < 0,0001 3.2.2 Kết đánh giá tác dụng độc tính cấp độc tính bán trường diễn phytosome silybin thực nghiệm Chưa xác định LD50 chế phẩm phytosome silybin theo đường uống chuột nhắt trắng Phytosome silybin khơng có biểu độc tính cấp liều 28,81g/kg chuột nhắt trắng theo đường uống Dựa theo bảng phân loại hóa chất theo mức độ độc, dựa vào