Nghiên cứu bào chế và đánh giá tác dụng trên khối u thực nghiệm thuốc tiêm chứa Liposome doxorubicin

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ QUỐC PHÒNG HỌC VIỆN QUÂN Y -KHÁNH THỊ NHI NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG TRÊN KHỐI U THỰC NGHIỆM THUỐC TIÊM LIPOSOME DOXORUBICIN LUẬN ÁN TIẾN SỸ DƯỢC HỌC HÀ NỘI - NĂM 2017 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ QUỐC PHÒNG HỌC VIỆN QUÂN Y KHÁNH THỊ NHI NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG TRÊN KHỐI U THỰC NGHIỆM THUỐC TIÊM LIPOSOME DOXORUBICIN Chuyên ngành : Công nghệ dược phẩm Bào chế thuốc Mã số : 62 72 04 02 LUẬN ÁN TIẾN SỸ DƯỢC HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1.PGS.TS Phạm Thị Minh Huệ 2.PGS.TS.Nguyễn Minh Chính HÀ NỘI - NĂM 2017 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu riêng Các số liệu, kết nêu luận án trung thực chưa công bố công trình khác Tác giả Khánh Thị Nhi LỜI CÁM ƠN Trong trình học tập, nghiên cứu hoàn thành luận án, nhận giúp đỡ tận tình Thầy cô, anh chị, bạn đồng nghiệp người thân gia đình Trước hết xin bày tỏ lòng kính trọng đặc biệt biết ơn sâu sắc tới: PGS TS Phạm Thị Minh Huệ PGS TS Nguyễn Minh Chính Những người Thầy tận tình trang bị cho kiến thức quý báu chuyên môn, nghề nghiệp nghiên cứu khoa học Các Thầy bên tôi, động viên tôi, giúp đỡ suốt trình nghiên cứu hoàn thành luận án Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc, lời cám ơn chân thành tới: Ban Giám đốc, phòng Sau đại học, Thầy Cô Trung tâm Đào tạo Nghiên cứu Dược, Bộ môn Sinh Lý Bệnh, Bộ môn Dược Lý - Học viện Quân Y tạo điều kiện thuận lợi cho trinh học tập nghiên cứu Tôi xin cảm ơn Ban Giám hiệu Thầy, Cô Bộ môn Bào chế Trường đại học Dược Hà Nội, Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ương, Viện vệ sinh dịch tễ Trung ương tạo điều kiện tốt để hoàn thành luận án Tôi xin gửi lời cám ơn chân thành tới Trung tâm Y Tế Hoài Đức Hà Nội, sở Y tế Hà Nội, anh/chị đồng nghiệp, người thân gia đình bạn bè động viên giúp đỡ tạo điều kiện để hoàn thành luận án Ngày tháng năm 2017 Khánh Thị Nhi MỤC LỤC Trang phụ bìa Lời cam đoan Mục lục Ký hiệu viết tắt Danh mục bảng Danh mục hình ĐẶT VẤN ĐỀ Chương TỔNG QUAN 1.1 Đại cương doxorubicin .3 1.1.1 Đặc điểm hóa lý .3 1.1.2 Độ ổn định .4 1.1.3 Cơ chế tác dụng .6 1.1.4 Các dạng bào chế doxorubicin 1.1.5 Dược động học 1.1.6 Chỉ định 1.1.7 Độc tính .10 1.1.8 Liều lượng 11 1.2 Đại cương liposome doxorubcin 12 1.2.1 Khái niệm .12 1.2.2 Phân loại liposome .13 1.2.3 Ưu, nhược điểm liposome .15 1.2.4 Nguyên liệu bào chế liposome .16 1.2.5 Phương pháp bào chế liposome 18 1.2.6 Đánh giá liposome .21 1.3 Các nghiên cứu liposome doxorubicin 25 1.3.1 Nghiên cứu bào chế .25 1.3.2 Đánh giá tác dụng invivo 33 Chương 38 NGUYÊN VẬT LIỆU,THIẾT BỊ,ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .38 2.1 Nguyên vật liệu 38 2.2 Thiết bị dụng cụ nghiên cứu 39 2.3 Đối tượng nghiên cứu 40 2.4 Phương pháp nghiên cứu 40 2.4.1 Phương pháp bào chế 40 2.4.2 Phương pháp đánh giá đặc tính liposome doxorubicin 45 2.4.3 Phương pháp đánh giá chất lượng thuốc tiêm liposome doxorubicin 51 2.4.4 Phương pháp đánh giá tác dụng liposome doxorubicin khối u động vật .51 2.5 Phương pháp xử lý số liệu 55 2.6 Điều kiện thí nghiệm 55 2.7 Địa điểm nghiên cứu 55 Chương 56 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 56 3.1 Xây dựng phương pháp định lượng doxorubicin 56 3.1.1 Phương pháp đo quang phổ hấp thụ UV-VIS .56 3.1.2 Phương pháp sắc kí lỏng hiệu cao .59 3.2 Xây dựng công thức bào chế liposome doxorubicin 63 3.2.1 Bố trí thí nghiệm 63 3.3 Xây dựng qui trình bào chế liposome doxorubicin 74 3.3.1 Bào chế liposome chưa mang dược chất .74 3.4 Bào chế thuốc tiêm liposome doxorubicin 90 3.5 Đề xuất tiêu chuẩn đánh giá độ ổn định thuốc tiêm liposome doxorubicin .93 3.5.1 Đề xuất tiêu chuẩn .94 3.5.2 Đánh giá độ ổn định .95 3.6 Đánh giá tác dụng thuốc tiêm liposome doxorubicin khối u động vật thực nghiệm 100 3.6.1 Đánh giá chuột nhắt mang tế bào ung thư Sacoma TG 180 .100 3.6.2 Đánh giá tác dụng khối u chuột thiếu hụt miễn dịch mang tế bào ung thư tiền liệt tuyến 106 Chương 109 BÀN LUẬN .109 4.1 Phương pháp bào chế liposome .109 4.1.1 Bào chế liposome chưa mang dược chất 109 4.1.2 Giảm đồng kích thước liposome 110 4.1.3 Đưa dược chất vào liposome .113 4.2 Xây dựng công thức bào chế liposome doxorubicin 117 4.2.1 Tỷ lệ lipid 117 4.2.2 Tỷ lệ lipid/ doxorubicin .118 4.3 Phương pháp đánh giá liposome 121 4.3.1 Phương pháp định lượng hàm lượng dược chất .121 4.3.2 Phương pháp đánh giá phân bố kích thước tiểu phân .122 4.3.3 Phương pháp đánh giá hình thái cấu trúc 122 4.3.4 Đánh giá giải phóng dược chất từ liposome 123 4.3.5 Độ ổn định liposome 124 4.3.6 Về đánh giá tác dụng khối u .125 KẾT LUẬN 129 ĐỀ XUẤT 130 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI LUẬN ÁN 131 TÀI LIỆU THAM KHẢO 132 PHỤ LỤC 151 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT TT Viết tắt ADN Từ/cụm từ đầy đủ Acid Deoxyribonucleic ARN Acid ribonucleic BP Bristish Pharmacopoeia ( Dược điển Anh) CHF Congestive heart failure (Suy tim sung huyết ) CHL Cholesterol TT Viết tắt CS Từ/cụm từ đầy đủ Cộng DC Dược chất ĐCSH Đối chứng sinh học ĐCUT Đối chứng ung thư 10 DĐVN Dược điển Việt Nam 11 DOPE Dioleoylphosphatidyl ethanolamin 12 DDAB Dimethyldioctadecylammonium bromid 13 DOX Doxorubicin hydroclorid 14 DPPC Dipalmitoylphosphatidylcholin 15 DPPE 1,2-Dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin 16 DPPS 1,2-Dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serin 17 DSPA 1,2-Distearoyl-sn-Glycero-3-Phosphoric acid 18 DSPC Distearoyl phosphatidylcholin 19 DSPE Distearoyl phosphatidylethanolamin 20 DSPE–PEG Distearoyl phosphoethanolamin polyethylene glycol 21 DSPG Distearoyl Phosphatidyl glycerol 22 EPC Egg-derived phosphatidylcholin 23 EPG Egg-derived phosphatidylglycerol 24 EurPh European Pharmacopoeia ( Dược điển Châu Âu) 25 FDA Food and Drug Administration ( Cục Quản Lý Thực Phẩm Dược Phẩm Hoa Kỳ) 26 HEPES N-2- hydroxyethylpiperazine-N’-2-ethanesulfonic acid 27 HER2 /neu Human Epidermal Growth Factor Receptor (Thụ thể yếu tố tăng trưởng thượng bì) 28 HPC Hydrogenated phosphatidylcholin 29 HPI Hydrogenated phosphatidylinositol TT 30 Viết tắt HPLC Từ/cụm từ đầy đủ High-performance liquid chromatography (Sắc kí lỏng hiệu cao) 31 KHV Kính hiển vi 32 KTTP Kích thước tiểu phân 33 LUV Large unilamellar vesicle ( Liposome đơn lớp lớn) 34 LVEF Left ventricular ejection fraction (Thể tích tống máu thất trái) 35 MLV Multilamellar vesicle (Liposome nhiều lớp đồng trục ) 36 MVV Multivesicular (Liposome kép ) 37 NĐ Nồng độ 38 NST Nhiễm sắc thể 39 PC Phosphatidyl cholin 40 PDI polydispersity index (Chỉ số đa phân tán) 41 PEG Polyethylenglycol 42 PI Phosphatidyl inositol 43 PTFE Polytetrafluoroethylene Teflon 44 RSD Relative Standard deviation ( Độ lệch chuẩn tương đối) 45 SD Standard deviation (Độ lệch chuẩn ) 46 SPC Soy phospatidyl cholin (Phosphatidyl cholin dầu đậu tương ) 47 SUV Small unilamellar vesicle (Liposome đơn lớp nhỏ) 48 TB Trung bình 49 TBUT Tế bào ung thư 50 TCCS Tiêu chuẩn sở 51 TEM Transmission electron microscopy (Kính hiển vi điện tử truyền qua) *Đồ thị phân bố kích thước liposome siêu âm thiết bị Labsonic với thể tích siêu âm 10ml sau gắn doxorubicin Phụ lục 4: Sắc ký đồ doxorubicin * Mẫu chuẩn 100µg/ml *Mẫu định lượng toàn phần liposome doxorubicin Phụ lục 5: Tiêu chuẩn sở phiếu kiểm nghiệm thuốc tiêm liposome doxorubicin mg/ml Phụ lục 6: Hình ảnh đại thể khối u ung thư tiền liệt tuyến đùi chuột Nude Sau ghép tế bào khoảng 10 ngày, khối u xuất đùi chuột, với đường kính trung bình khoảng 4-5mm, thể tích tương ứng khoảng 30mm Khối u có mật độ chắc, di động da, tượng nóng đỏ vị trí khối u Chuột lô chứng Chuột lô thử thuốc nghiên cứu Chuột lô thử thuốc đối chiếu Hình ảnh khối ung thư TLT đùi chuột thời điểm điều trị Sau điều trị tuần, khối u nhóm chuột có mật độ chắc, di động, ảnh hưởng tới vận động chuột Không có tượng nóng đỏ quanh khối u Có thể nhìn thấy hệ thống mạch máu tân tạo bề mặt khối u (hình 3.3) Chuột lô chứng Chuột thử thuốc nghiên cứu Chuột lô thử thuốc đối chiếu Hình ảnh khối ung thư TLT đùi chuột sau tuần điều tri ... tác dụng thuốc tiêm liposome doxorubicin khối u chuột thực nghiệm Để đạt mục ti u trên, đề tài thực nội dung nghiên c u sau: Nghiên c u xây dựng công thức qui trình bào chế liposome doxorubicin. .. Đánh giá đặc tính liposome doxorubicin để ti u chuẩn hóa liposome doxorubicin thuốc tiêm liposome doxorubicin Đánh giá độ ổn định thuốc tiêm liposome doxorubicin 2mg/ml So sánh hi u kháng u thuốc. ..BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ QUỐC PHÒNG HỌC VIỆN QUÂN Y KHÁNH THỊ NHI NGHIÊN C U BÀO CHẾ VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG TRÊN KHỐI U THỰC NGHIỆM THUỐC TIÊM LIPOSOME DOXORUBICIN Chuyên ngành