Nghiên cứu bào chế nano nhũ tương nhỏ mắt Diclophenac và bước đầu đánh giá sinh khả dụng của chế phẩm (TT)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI Đặng Thị Hiền NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ NANO NHŨ TƢƠNG NHỎ MẮT DICLOFENAC VÀ BƢỚC ĐẦU ĐÁNH GIÁ SINH KHẢ DỤNG CỦA CHẾ PHẨM Chuyên ngành: Công nghệ dƣợc phẩm Bào chế thuốc Mã số: 62720402 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƢỢC HỌC Hà Nội, năm 2016 Công trình đƣợc hoàn thành tại: Bộ môn Bào chế Trường Đại học Dược Hà Nội Bộ môn Vật lý - Hóa lý Trường Đại học Dược Hà Nội Bộ môn Công nghiệp Dược Trường Đại học Dược Hà Nội Viện Kiểm nghiệm, nghiên cứu dược trang thiết bị Y tế quân đội Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS Nguyễn Trần Linh PGS.TS Nguyễn Văn Long Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án cấp Trường Họp tại: Vào hồi ngày Có thể tìm hiểu luận án tại: tháng năm 2016 - Thư viện Quốc gia Việt Nam - Thư viện Đại học Dược Hà Nội CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DÙNG TRONG LUẬN ÁN ADC AIC AUC AUMC BCS CĐDH CDH Cmax Acid diclofenac The Akaike information criterion The area under the curve (Diện tích đường cong) Area under the first moment curve (Diện tích đường cong thời điểm đầu) Biopharmaceutical Classification System (Bảng phân loại sinh dược học) Chất đồng diện hoạt Chất diện hoạt Maximum concentration (Nồng độ thuốc tối đa) GP Công thức bào chế Chỉ tiêu chất lượng Công thức tối ưu Dược chất Dung dịch Đồng hóa Food and Drug Administration (Cơ quan quản lý thuốc – thực phẩm) Giải phóng GPDC Giải phóng dược chất HPLC High Performance Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng) HQC High quality control sample (Mẫu kiểm chứng nồng độ cao) IPM IVIVC Isopropyl myristat In vitro – in vivo correlation (tương quan in vitro – in vivo) KTG LC-MS Kích thước giọt Liquid chromatography–mass spectrometry (Sắc ký lỏng khối phổ) CTBC CTCL CTTƯ DC DD ĐNH FDA LLOQ Lower Limit of Quantification (Giới hạn định lượng dưới) LQC Lower quality control sample (Mẫu kiểm chứng nồng độ thấp) MCT Medium-chain triglycerides (triglycerid có acid béo mạch trung bình) Middle quality control sample (Mẫu kiểm chứng nồng độ trung bình) Mean residence time (Thời gian lưu trung bình) Môi trường Môi trường phân tán Natri diclofenac Nano nhũ tương MQC MRT MT MTPT NaDC NNT PdI RSD SD SKD TCCS TEM Tmax Polydispersity index (chỉ số đa phân tán) Relative standard deviation (Độ lệch chuẩn tương đối) Standard deviation (Độ lệch chuẩn) Sinh khả dụng Tiêu chuẩn sở Transmission electron microscopy (Hiển vi điện tử truyền qua) Maximum time (Thời gian đạt nồng độ thuốc tối đa) MỞ ĐẦU Tính cấp thiết luận án Công nghệ nano tạo cách mạng lớn bào chế thuốc đại Sử dụng công nghệ nano để thiết kế hệ phân phối thuốc tạo nên phát triển ngành y học, hứa hẹn tiến đột phá điều trị chẩn đoán Tuy nhiên, ngành công nghiệp dược phẩm Việt Nam, chế phẩm bào chế theo công nghệ nano mẻ chưa ứng dụng vào sản xuất Diclofenac DC điển hình nhóm NSAIDs, có khả ngăn chặn co đồng tử xảy trình lấy tinh thể đục, làm giảm viêm đau tổn thương biểu mô giác mạc sau phẫu thuật Diclofenac dược chất có độ hòa tan kém, chế phẩm thuốc nhỏ mắt diclofenac có thị trường chủ yếu dạng dung dịch có hiệu điều trị không cao NNT số hệ bào chế có cấu trúc nano nhận quan tâm nhiều nhà khoa học giới Nhiều nghiên cứu chứng minh, NNT làm tăng tỉ lệ hấp thu thuốc vào mô bên mắt, tăng thời gian lưu thuốc trước giác mạc, cải thiện SKD hiệu điều trị mắt Các nghiên cứu hệ phân phối thuốc mắt tiềm cho DC thuộc nhóm II, III bảng phân loại sinh dược học (BCS) Chính vậy, nghiên cứu bào chế nano nhũ tương nhỏ mắt chứa diclofenac bước đầu đánh giá sinh khả dụng chế phẩm vấn đề cấp thiết, có ý nghĩa khoa học, góp phần phát triển nghiên cứu, bào chế thuốc theo công nghệ nano Việt Nam Mục tiêu luận án Xây dựng công thức quy trình bào chế nano nhũ tương nhỏ mắt diclofenac 0,1% quy mô phòng thí nghiệm Nâng quy mô bào chế, dự thảo tiêu chuẩn sở, đánh giá độ ổn định cho nano nhũ tương nhỏ mắt diclofenac 0,1% Đánh giá sinh khả dụng chế phẩm thỏ thí nghiệm bước đầu thiết lập tương quan in vitro – in vivo chế phẩm Những đóng góp luận án Lần Việt Nam, nano nhũ tương nhỏ mắt diclofenac tiến hành nghiên cứu tương đối đầy đủ: từ lựa chọn công thức bào chế, xây dựng quy trình bào chế, nâng quy mô, dự thảo tiêu chuẩn sở, nghiên cứu độ ổn định, đánh giá SKD in vivo súc vật đến thiết lập tương quan in vitro – in vivo Luận án có đóng góp sau: - Xây dựng công thức quy trình bào chế nano nhũ tương nhỏ mắt diclofenac thiết bị siêu âm, thiết bị siêu âm kết hợp đồng hóa áp suất cao, thiết bị phân cắt tốc độ cao - Xây dựng mô hình đánh giá SKD chế phẩm nano nhũ tương nhỏ mắt chứa diclofenac mắt thỏ Mô hình cho thấy, chế phẩm có khả kéo dài thời gian lưu thuốc trước giác mạc làm tăng thấm dược chất qua giác mạc nên cải thiện SKD chế phẩm so với dạng dung dịch đối chiếu - Xây dựng mô hình thiết lập tương quan in vitro – in vivo Tương quan sau thiết lập ứng dụng xây dựng tiêu chuẩn sở cho chế phẩm sử dụng để nghiên cứu phát triển sản phẩm, kiểm soát chất lượng sản phẩm Cấu trúc luận án Luận án gồm 149 trang không kể tài liệu tham khảo phụ lục, 58 bảng, 37 hình, 165 tài liệu tham khảo Bố cục gồm: Đặt vấn đề (1 trang), tổng quan (32 trang), nguyên liệu, trang thiết bị, nội dung phương pháp nghiên cứu (21 trang), Kết nghiên cứu (73 trang), Bàn luận (20 trang), Kết luận, đề xuất (2 trang), Danh mục công trình công bố liên quan đến luận án (1 trang), Tài liệu tham khảo (14 trang) CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1 THÔNG TIN VỀ DƢỢC CHẤT ACID DICLOFENAC 1.1.1 Công thức hóa học Hình 1.1 Công thức cấu tạo acid diclofenac 1.1.2 Đặc tính lý hóa  Tính chất vật lý: Bột kết tinh màu trắng hoắc gần trắng, hút ẩm, tan nước, độ tan phụ thuộc pH Tan tốt dầu thực vật  Tính chất hóa học: - Tính acid yếu, pKa = 4,0 1.1.3 Tác dụng, định Diclofenac thuộc nhóm chống viêm không steroid - NSAIDs, có tác dụng ức chế tổng hợp prostagladin rõ rệt, tạo tác dụng chống viêm, giảm đau mạnh Hiện thị trường có DD thuốc nhỏ mắt chứa NaDC Chỉ định: DD nhỏ mắt 0,1% NaDC giảm đau tổn thương biểu mô chấn thương, phẫu thuật, điều trị viêm sau phẫu thuật, bệnh viêm mạn tính không lây nhiễm, ngăn ngừa thu hẹp đồng tử phẫu thuật đục thủy tinh thể, giảm triệu chứng viêm màng kết mạc 1.2 NANO NHŨ TƢƠNG 1.2.1 Khái niệm NNT hệ phân tán siêu vi dị thể, có phân bố KTG nằm khoảng từ 20 - 500 nm, hình thành từ hai chất lỏng không đồng tan, chất lỏng pha phân tán (pha nội, pha không liên tục) phân tán vào chất lỏng thứ hai MTPT (pha ngoại, pha liên tục), ổn định CDH CĐDH 1.2.2 Thành phần NNT hình thành hòa trộn pha dầu, pha nước, CDH, CĐDH số thành phần khác 1.2.3 Kỹ thuật bào chế nano nhũ tƣơng 1.2.3.1 Kỹ thuật phân tán hay nhũ hóa sử dụng lượng cao Kỹ thuật thực thiết bị như: thiết bị ĐNH phân cắt tốc độ cao, thiết bị ĐNH áp suất cao, thiết bị siêu âm 1.2.3.2 Kỹ thuật tự nhũ hóa hay nhũ hóa sử dụng lượng thấp Bao gồm phương pháp: phương pháp điểm đảo pha, phương pháp nhiệt độ đảo pha, phương pháp tự nhũ hóa 1.2.4 Đặc tính nano nhũ tƣơng Các đặc tính quan trọng NNT bao gồm phân bố KTG số đa phân tán, đặc tính động học, hiệu điện bề mặt (thế zeta), độ nhớt 1.2.5 Ƣu nhƣợc điểm nano nhũ tƣơng Ƣu điểm: Tăng độ tan dược chất, tăng ổn định dược chất, bảo vệ dược chất khỏi thủy phân oxy hóa, tăng hấp thu, tăng sinh khả dụng, tác dụng đích, tăng hoạt tính, giảm độc tính, sử dụng nhiều đường dùng Tăng hoạt tính, giảm độc tính, sử dụng nhiều đường dùng Nhƣợc điểm: Sử dụng nồng độ cao chất diện hoạt, chất đồng diện hoạt Độ ổn định bị ảnh hưởng nhiệt độ pH, khó khăn trình bảo quản 1.3 NANO NHŨ TƢƠNG NHỎ MẮT 1.3.1 Đặc điểm cấu tạo mắt liên quan đến hấp thu dƣợc chất Mắt cấu tạo lớp: lớp ngoài, lớp lớp Các yếu tố trước giác mạc cộng với thời gian tiếp xúc với màng hấp thu ngắn lý làm cho lượng thuốc hấp thu vào mô bên thấp 5% tổng lượng thuốc đưa vào 1.3.2 Một số nghiên cứu nano nhũ tƣơng nhỏ mắt NNT dùng cho nhãn khoa nghiên cứu với nhiều hợp chất khác như: dorzolamid, ganciclovir, flurbiprofen axetil, acetazolamid, azithromycin, timolol maleat Các kết nghiên cứu chứng minh cải thiện SKD dạng thuốc NNT so với dạng thuốc thông thường 1.3.3 Đánh giá sinh khả dụng nano nhũ tƣơng mắt 1.3.3.1 Đánh giá giải phóng dược chất in vitro - Màng GP: màng thẩm tích túi thẩm tích có giới hạn KLPT thường 12 - 14 kDa; sử dụng màng lọc cellulose acetat với kích thước lỗ lọc thường 0,2 µm - Môi trường khuếch tán: thường đệm phosphat pH 7,4 DD nước mắt nhân tạo Môi trường khuếch tán điều nhiệt, trì khoảng nhiệt độ thích hợp khuấy trộn với tốc độ định - Nhiệt độ: 34 ± 0,5oC (nhiệt độ bề mặt nhãn cầu) 37 ± 0,5ºC - Thiết bị đánh giá GP thuốc: bình Franz, thiết bị thẩm tách micro thiết bị thử hòa tan khác 1.3.2.2 Đánh giá sinh khả dụng in vivo Với thuốc mà đích tác dụng nhãn cầu định lượng DC dịch tiền phòng phù hợp khu vực trung gian vận chuyển chất đến mô tổ chức mắt Đây phương pháp chọn để đánh giá SKD NNT nhỏ mắt diclofenac 1.3.3.3 Tương quan in vitro – in vivo Mối tương quan in vitro – in vivo mô hình toán học mô tả mối quan hệ đặc tính in vitro dạng bào chế đáp ứng in vivo tương ứng Thông thường, đặc tính in vitro tốc độ và/hoặc mức độ GPDC đáp ứng in vivo nồng độ thuốc máu hay lượng thuốc hấp thu Sau tương quan thiết lập, thông số thu từ kết nghiên cứu in vitro dùng để thay cho thông số thu từ kết nghiên cứu in vivo vốn tiêu tốn nhiều tiền của, thời gian, nhân lực làm tăng giá thành sản phẩm thuốc Kết sở xét miễn nghiên cứu sinh khả dụng tương đương sinh học; sở dùng để đánh giá ứng dụng đặc điểm phương pháp thử hòa tan; sở cho kiểm tra chất lượng sản xuất lựa chọn công thức thuốc thích hợp CHƢƠNG NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu thiết bị 2.1.1 Nguyên liệu Nguyên liệu, hóa chất, tá dược sử dụng nghiên cứu đạt tiêu chuẩn DĐVN IV, tiêu chuẩn nhà sản xuất, tinh khiết phân tích dùng cho HPLC 2.1.2 Thiết bị Sử dụng thiết bị bào chế đánh giá tin cậy: máy siêu âm cầm tay Labsonic®M – Sartorius, máy ĐNH phân cắt Unidriver X1000, máy ĐNH áp suất cao EmulsiFlex – C5, hệ thống đánh giá GP thuốc qua màng Hanson Research, máy sắc ký lỏng hiệu cao Agilent 1260 Infinite, kính hiển vi điện tử truyền qua EMLab – NIHE, máy đo phân bố kích thước tiểu phân zeta Zetasizer Nano ZS90 2.2 Nội dung nghiên cứu - Nghiên cứu xây dựng công thức, quy trình bào chế NNT diclofenac đánh giá số đặc tính chế phẩm - Nâng quy mô bào chế, dự thảo tiêu chuẩn chất lượng NNT nhỏ mắt diclofenac - Bước đầu đánh giá SKD NNT nhỏ mắt diclofenac mắt thỏ thí nghiệm - Thiết lập tương quan in vitro – in vivo xây dựng tiêu chuẩn sở chế phẩm NNT nhỏ mắt diclofenac 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.3.1 Phƣơng pháp bào chế nano nhũ tƣơng diclofenac Bước 1: Hòa tan hoàn toàn DC vào pha dầu (dung môi pha dầu, CDH thân dầu, CĐDH) nhiệt độ 60 – 65oC Bước 2: Hòa tan, đun nóng pha nước (dung môi – nước cất pha tiêm, CDH thân nước, CĐDH thân nước, hệ đệm, chất bảo quản) lên 65 – 70oC Bước 3: Tiến hành nhũ hóa pha dầu vào pha nước thiết bị siêu âm thiết bị siêu âm kết hợp ĐNH áp suất cao thiết bị ĐNH phân cắt tốc độ cao Bước 4: Điều chỉnh pH thể tích Bước 5: Lọc qua màng cellulose acetat 0,2 µm để tiệt khuẩn Bước 6: Đóng lọ thuốc nhỏ mắt xử lý, dán nhãn, hoàn chỉnh thành phẩm 2.3.8 Phƣơng pháp ghi xử lý số liệu Sử dụng phần mềm Microsoft Excel 2013, SPSS, MODDE 8.0, INFORM 3.2, FormRules 2.0 INForm 3.2, Phoenix WinNonlin 6.3, Phoenix IVIVC Toolkit 2.2 Chƣơng KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Thẩm định phƣơng pháp định lƣợng dƣợc chất mẫu nano nhũ tƣơng môi trƣờng giải phóng Kết thẩm định cho thấy phương pháp có tính đặc hiệu diclofenac Trong khoảng nồng độ khảo sát có tương quan tuyến tính giữa diện tích pic nồng độ acid diclofenac Kết khảo sát cho thấy phương pháp có độ cao với khả thu hồi trung bình 100,68% độ lệch chuẩn tương đối 1,59% (< 2%) Với điều kiện sắc ký chọn, phương pháp định lượng acid diclofenac có độ lặp lại cao với độ lệch chuẩn tương đối nồng độ nhỏ 2% 3.2 Xây dựng công thức quy trình bào chế nano nhũ tƣơng Nano nhũ tương tiến hành bào chế theo quy trình mục 2.3.1 kỹ thuật bào chế khác nhau: kỹ thuật siêu âm, kỹ thuật siêu âm kết hợp đồng hóa áp suất cao kỹ thuật phân cắt tốc độ cao 3.2.1 Bào chế nano nhũ tương phương pháp siêu âm 3.2.1.1 Xác định công thức bào chế nano nhũ tương a Lựa chọn thành phần: Dược chất, tá dược tạo pha dầu, pha nước, CDH, CĐDH số thành phần khác b Xác định khoảng tỉ lệ thành phần: Dược chất ADC (0,093%, dung môi pha dầu (2 – 4%), CDH thân nước (2 – 4%), CDH thân dầu (0,5 – 1%), Chất đồng diện hoạt (0,5 – 1,5%), đệm (0,1 – 0,2 mol/l), pH 6,5 – 7,5, glycerin 5%, nước cất pha tiêm vừa đủ 100% c Thiết kế thí nghiệm kết quả: Sử dụng phần mềm MODDE 8.0 để thiết kế thí nghiệm theo nguyên tắc hợp tử tâm: thu bảng thiết kế thí nghiệm gồm 23 công thức 11 3.2.1.2 Khảo sát lựa chọn thời gian siêu âm Qua khảo sát lựa chọn thời gian siêu âm 15 phút để bào chế nano nhũ tương với quy mô mẻ 100 ml 3.2.1.3 Xác định quy trình bào chế phương pháp siêu âm Với công thức, 100 ml NNT bào chế kỹ thuật siêu âm với bước 1, 2, 4, 5, theo quy trình mục 2.3.1, đó: - Bước 3: Tiến hành ĐNH nhũ tương sử dụng máy siêu âm với tần số 30000 Hz, biên độ 100 µm, siêu âm liên tục thời gian 15 phút 3.2.1.4 Đánh giá ảnh hưởng thành phần công thức đến đặc tính vật lý khả giải phóng dược chất in vitro nano nhũ tương Phân tích mối quan hệ nhân biến độc lập biến phụ thuộc, xử lý số liệu phần mềm FormRules 2.0 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả GPDC NNT: Lượng Span 80 tăng lượng Transcutol HP giảm, hỗn hợp Tw 80/Cre EL làm tăng phần trăm giải phóng dược chất Các yếu tố ảnh hưởng tới độ bền NNT: Khi hệ đệm borat NNT ADC ổn định Khoảng pH thấp độ bền hệ cao, pH lớn độ bền hệ giảm Loại dung môi pha dầu Miglyol, Labrafac hay IPM ảnh hưởng tới độ bền hệ; nhiên với pha dầu Miglyol cho thấy hệ độ bền hệ cao Các yếu tố ảnh hưởng tới KTG NNT: thành phần dầu IPM làm ảnh hưởng tới thay đổi KTG, với thành phần dầu Miglyol Labrafac làm tăng kích thước giọt nhiên lượng dầu thay đổi không ảnh hưởng tới KTG Tỉ lệ chất diện hoạt thân nước Tw/Cre tăng làm tăng kích thước giọt Các yếu tố làm ảnh hưởng tới zeta: thành phần đệm borat với lượng đệm nhỏ làm tăng zeta hệ nano nhũ tương làm tăng ổn định hệ Lượng Transcutol HP tăng làm tăng nhẹ zeta hệ không đáng kể 3.2.1.5 Tối ưu hóa công thức bào chế nano nhũ tương Lựa chọn công thức tối ưu thay đổi thành phần dầu: 12 Bảng 3.22: Thành phần công thức NNT đƣợc lựa chọn Stt DC X1 X2 (%) X3 X4 X5 X6 (%) (%) (%) X7 X8 (mol/l) X9 CT1 ADC Tw/Cr : 1/1 Miglyol 0,5 0,5 Borat 0,14 7,5 CT2 ADC Tw/Cr : 1/1 IPM 0,5 0,5 Borat 0,14 7,5 CT3 ADC Tw/Cr : 1/1 Labrafac 0,5 0,5 Borat 0,14 7,5 PG Tiến hành bào chế 100 ml mẫu NNT theo công thức tối ưu 1, 2, có thành phần bảng 3.22 đánh giá số tiêu chất lượng Kết cho thấy CTTƯ mang đặc tính chế phẩm NNT CTTƯ tiến hành lựa chọn để tiến hành thử nghiệm với kỹ thuật bào chế siêu âm kết hợp ĐNH áp suất cao 3.2.2 Bào chế nano nhũ tƣơng kỹ thuật siêu âm kết hợp đồng hóa áp suất cao CT lựa chọn để khảo sát cụ thể sau: CT1, CT 16 CT 20 (Bảng 3.17), CTTƯ1 CTTƯ (Bảng 3.22) để tiến hành khảo sát bào chế thiết bị siêu âm kết hợp ĐNH áp suất cao Mỗi CT bào chế 100 ml kỹ thuật siêu âm theo mục 3.2.1.3, sau tiến hành ĐNH liên tục 50 ml mẫu NNT 12 phút áp suất 500 bar Tiến hành đánh giá số CTCL NNT bào chế thiết bị siêu âm siêu âm + ĐNH sau thời gian 12 phút Kết cho thấy trình đồng hóa sau siêu âm không cần thiết Vì quy trình không lựa chọn để bào chế NNT cho nghiên cứu 3.2.3 Bào chế nano nhũ tƣơng thiết bị phân cắt tốc độ cao 3.2.3.1 Xác định công thức bào chế Các thành phần công thức lựa chọn tương tự phương pháp siêu âm, nhiên trình tham khảo tài liệu có điều chỉnh lại tỷ lệ số thành phần (dầu, chất diện hoạt, chất đồng diện hoạt) thấp so với thành phần công thức bào chế thiết bị siêu âm với mong muốn đạt chế phẩm nano nhũ tương cho phân bố KTTP đồng nhất, đạt tỷ lệ nhũ hóa cao, nhũ tương ổn định, đạt phần trăm giải phóng dược chất cao không gây kích ứng mắt 13 3.2.3.2 Xác định quy trình bào chế máy phân cắt tốc độ cao Bước 1, 2, 4, 5, 6: Tương tự phương pháp siêu âm Bước 3: Tiến hành đồng hóa nhũ tương sử dụng máy phân cắt tốc độ cao với tốc độ phân cắt khảo sát từ 10000 vòng/phút đến 16000 vòng/phút Thời gian phân cắt từ - 10 phút 3.2.3.3 Thiết kế thí nghiệm Sử dụng phần mềm MODDE 8.0 để thiết kế thí nghiệm theo nguyên tắc hợp tử tâm Thiết kế thí nghiệm 30 công thức 3.2.3.4 Đánh giá ảnh hƣởng thành phần công thức đến số đặc tính vật lý nano nhũ tƣơng a Các đặc tính vật lý hệ Phân tích mối quan hệ nhân biến độc lập biến phụ thuộc, xử lý số liệu phần mềm FormRules 2.0 Các yếu tố ảnh hưởng đến KTG NNT: Tỉ lệ Transcutol HP tăng KTG pic NNT tăng Tỉ lệ CDH tăng KTG pic tăng Nếu tỉ lệ CDH nằm khoảng - 1,5 % KTG nhỏ thay đổi Khi CDH tăng đến 2%, KTG pic tăng mạnh KTG giảm thời gian phân cắt tăng Tốc độ phân cắt tăng từ 10000 đến 13000 vòng/ phút cho thấy làm giảm KTG Tốc độ phân cắt khoảng 13000 vòng/phút cho KTG thu từ mẫu NNT nhỏ Nếu tăng tốc độ phân cắt từ 13000 đến 16000 vòng/phút làm KTG tăng dần Các yếu tố ảnh hưởng đến điện tích bề mặt NNT: Tỉ lệ CDH thân nước giảm, Transcutol HP tăng, tỉ lệ Span 80 tăng zeta giảm làm tăng độ ổn định hệ Tỉ lệ CDH thân nước có ảnh hưởng lớn nhất, nhiên tỉ lệ nằm khoảng - 1,5% zeta mức thấp nhất, không thay đổi nhiều Kết nghiên cứu NNT bào chế thiết bị phân cắt tốc độ cao cho thấy mẫu NNT bào chế quy mô nhỏ dễ bị mắc kẹt lại thiết bị cho tỉ lệ nhũ hóa không cao, hệ NNT ổn định (thế zeta < 30 mV) Thiết bị có cấu tạo phức tạp khó đảm bảo tiêu chí vô khuẩn bào chế thuốc nhỏ mắt Vì thiết bị không lựa chọn cho quy trình bào chế NNT nghiên cứu 14 3.3 NÂNG QUY MÔ BÀO CHẾ Kỹ thuật siêu âm kỹ thuật sử dụng trình nhũ hóa bào chế nano nhũ tương diclofenac, kỹ thuật cho thấy nhiều ưu điểm sử dụng quy mô phòng thí nghiệm Do kỹ thuật lựa chọn nghiên cứu nâng quy mô Mẫu nano nhũ tương bào chế theo thành phần CTTƯ có phân bố KTG 200 nm, GTTĐ zeta < 30 mV, PdI < 0,3 bào chế kỹ thuật khác nhau, mẫu NNT bào chế theo thành phần CTTƯ lựa chọn để tiến hành khảo sát thời gian siêu âm phù hợp nâng quy mô lên 1000 ml 3.3.1 Khảo sát lựa chọn thời gian siêu âm nâng quy mô Kết lựa chọn thời gian siêu âm 45 phút cho quy trình nâng quy mô bào chế lên 1000 ml hợp lý có ý nghĩa thống kê 3.3.2 Đánh giá tính lặp lại quy trình nâng quy mô bào chế Bào chế mẫu nano nhũ tương theo thành phần CTTƯ với mẻ (mẻ: 001, 002, 003) quy mô 1000 ml theo quy trình mục 3.2.1.3 mục 3.3.1 Tiến hành đánh giá CTCL theo phương pháp nêu mục 2.3.3 Nhận thấy tiêu nằm giới hạn cho phép Kết cho thấy khác tiêu chất lượng mẻ bào chế quy mô 1000 ml điều kiện nghiên cứu (P > 0,05) 3.4 DỰ THẢO TIÊU CHUẨN CHẤT LƢỢNG CỦA NANO NHŨ TƢƠNG NHỎ MẮT DICLOFENAC Căn vào nghiên cứu trình bày mục 3.2, 3.3 tham khảo “PL 1.14: Thuốc nhỏ mắt” DĐVN IV, dự thảo tiêu chuẩn chất lượng NNT nhỏ mắt diclofenac xây dựng sau: tính chất (NNT màu trắng đục mờ, không mùi); giới hạn cho phép thể tích (nằm giới hạn 100% đến 110% thể tích ghi nhãn); định tính (dương tính với diclofenac); định lượng (phải đạt từ 90,0 đến 110,0% so với hàm lượng ghi nhãn); phần trăm DC GP in vitro theo thời gian qua màng Spectra/Por® Dialysis Membrane (hãng Spectrum Laboratories) 1214 kD Môi trường đệm phosphat pH 7,4 (1 giờ: < 10%, giờ: 10 – 15%, giờ: 15 – 25%); KTG nhũ tương (phải nhỏ 200 nm); số đa phân tán (PdI) (phải nhỏ 0,4); zeta (phải không 30 mV); độ nhớt (độ 15 nhớt chế phẩm phải từ 4,0 đến 6,0 cP); pH (6,0 – 8,0); độ vô khuẩn (đạt vô khuẩn); tỉ lệ DC nhũ tương hoá (không 90%) 3.5 Đánh giá độ ổn định nano nhũ tƣơng nhỏ mắt Kết đánh giá có thay đổi, tiêu chất lượng nằm giới hạn cho phép TCCS sau tháng bảo quản điều kiện Tính toán dự đoán thọ phần mềm Minitab 17.2.1, tuổi thọ chế phẩm bảo quản điều kiện ± 3oC dài 24 tháng Như vậy, nano nhũ tương nhỏ mắt nên bảo quản – 8oC hạn dùng thực tế cần xác định dựa số liệu nghiên cứu dài hạn đầy đủ (dự kiến 24 tháng) 3.6 Khảo sát đặc tính mẫu nano nhũ tƣơng đƣợc lựa chọn để đánh giá sinh khả dụng Mẫu nano nhũ tương theo CTTƯ (bảng 3.22) tiến hành bào chế với quy mô 100 ml theo mục 3.2.1.3 Mẫu nano nhũ tương sau bào chế đánh giá số tiêu chất lượng theo phương pháp nêu mục 2.3.3 Sau số kết thu được: a Hình thức: NNT có màu trắng đục, đồng nhất, để lâu không bị phân lớp b Hình thái hệ Hình 3.31: Ảnh TEM nano nhũ tƣơng diclofenac Nhận xét: Ảnh TEM NNT cho thấy: tiểu phân có hình tròn, tách rời nhau, có lớp CDH CĐDH (màu nhạt hơn) bao xung quanh tiểu phân 16 c Phân bố kích thước giọt: KTG TB NNT 174,4 ± 9,83 nm (n=3) PdI 0,226 ± 0,24 (n = 3) d Thế zeta: Thế zeta TB – 45,3 ± 2,29 mV (n = 3), đảm bảo ổn định, không bị tách lớp trình bảo quản e Độ nhớt: Độ nhớt thuốc nhỏ mắt liên quan đến khả gây kích ứng mắt thời gian lưu giữ mắt Độ nhớt TB sau lần đo NNT 5,08 ± 0,01 cP (n = 3) Độ nhớt tương đối thấp, làm giảm kích ứng mắt f Độ bền: Độ bền NNT đánh giá theo mục 2.3.3.1.e Kết cho thấy NNT không tách lớp bảo quản điều kiện thực phòng thí nghiệm Luộc sôi giờ: NNT không bị tách lớp (độ bền: mức 4) g Định lượng: Định lượng DC có mẫu NNT phương pháp HPLC trình bày mục 2.3.2.3, thu hàm lượng ADC 100,74 ± 3,35 % (n = 3) Đánh giá GP qua màng thời gian giải phóng 1, 2, thu kết sau: Tỉ lệ DC GP (%): (6,59 ± 0,02); (14,58 ± 0,25); (19,24 ± 0,21) Đánh giá phần trăm DC nhũ tương hóa tính toán kết theo mục 2.3.3.4, thu được: phần trăm nhũ hóa DC: 98,87 ± 0,13% (n = 3) Căn dự thảo tiêu chất lượng mục 3.4, kết luận mẫu nano nhũ tương bào chế theo công thức CTTƯ mang đầy đủ tiêu chuẩn chế phẩm NNT lựa chọn để tiếp tục đánh giá thử kích ứng SKD mắt thỏ thí nghiệm 3.7 Thử kích ứng mắt thỏ Kết nghiên cứu nano nhũ tương nhỏ mắt diclofenac dấu hiệu gây kích ứng mắt thỏ 3.8 Nghiên cứu sinh khả dụng nano nhũ tƣơng nhỏ mắt thỏ thí nghiệm 3.8.1 Thẩm định phƣơng pháp định lƣợng diclofenac dịch tiền phòng Kết thẩm định cho thấy phương pháp định lượng có tính đặc hiệu acid diclofenac Trong khoảng nồng độ khảo sát, có tương quan tuyến tính nồng độ diclofenac thủy dịch với diện tích pic thu được, giới hạn định lượng 516,3 ng/ml Phương pháp định 17 lượng đạt độ đúng, độ lặp lại ngày khác ngày Diclofenac thủy dịch mẫu xử lý đạt độ ổn định 24 3.8.2 Đánh giá sinh khả dụng thông số dƣợc động học 3.8.2.1 Xác định nồng độ dược chất dịch tiền phòng Bố trí lô thỏ thí nghiệm theo quy trình mô tả với quy ước mắt trái nhỏ dạng nano nhũ tương mắt phải nhỏ dạng dung dịch Tính toán xử lý số liệu theo phương pháp trình bày thu kết nồng độ dược chất – thời gian hai dạng bào chế hình 3.33 Kết cho thấy đồ thị nồng độ dược chất dịch tiền phòng biến thiên phức tạp có dao động lớn giá trị nồng độ cá thể thỏ Hình 3.33: Đồ thị biểu diễn đƣờng cong nồng độ - thời gian (n = 6) 3.8.2.2 Xây dựng đường biểu diễn mức độ giải phóng in vivo nano nhũ tương so với dung dịch Kết trình bày bảng 3.53 Bảng 3.53 Tỉ lệ giải phóng in vivo NNT so với dung dịch Thời gian(phút) ** 10 20 30 40 50 60 75 90 105 120 150 180 0,949 0,949 1,087 1,229 1,230 1,232 1,232 1,232 1,439 1,649 1,649 1,649 **Tỉ lệ giải phóng in vivo NNT so với dung dịch 18 3.8.2.3 Khảo sát vài thông số dược động học Sử dụng phần mềm Phoenix WinNonlin 6.3, lựa chọn phương pháp không dựa mô hình ngăn để tính toán thông số λz, Cmax, Tmax, AUC0-180, AUC0-∞, MRT Kết thu trình bày bảng 3.54 Bảng 3.54: Các thông số dƣợc động học tính toán nhờ phần mềm Phoenix WinNonlin 6.3 Thông số NNT Dung dịch λz (phút-1) Cmax (ng/ml) Tmax (phút) AUC0-180 (ng/mlphút) AUC0-∞ (ng/mlphút) MRT (phút) 0,016 2191 120 246220 295216 113,81 0,014 1546 10 176440 207575 104,68 Như sơ nhận xét, dạng nano nhũ tương có Cmax AUC cao hơn, Tmax MRT dài so với dung dịch nhỏ mắt 3.9 Xây dựng tƣơng quan in vitro – in vivo thiết kế công thức nano nhũ tƣơng nhỏ mắt diclofenac 3.9.1 Đánh giá giải phóng dƣợc chất in vitro Tiến hành thử nghiệm giải phóng, lựa chọn môi trường giải phóng hệ đệm phosphat có pH 4,0; 4,5; 5,8; 6,8; 7,4 Màng giải phóng màng thẩm tích Kết nhận thấy pH môi trường đệm tăng phần trăm DC GP tăng theo thời gian lẽ ADC tan nước, có độ tan thay đổi theo pH Khi môi trường đệm có tính base làm tăng độ tan ADC từ phần trăm DC GP qua màng thẩm tích tăng cao môi trường đệm có pH cao (môi trường đệm phosphat pH 7,4 sau GP 32,09% DC) môi trường đệm phosphat pH 7,4 có chứa Tw 80 ethanol phần trăm DC GP sau đạt mức cao gần 40% (khi môi trường đệm chứa 30% ethanol 0,2% Tw 80 sau GP 38,86% DC) 19 3.9.2 Mô hình hóa đồ thị giải phóng Kết cho thấy mô hình GP DC môi trường khác tương đối phù hợp với mô hình Double Weibull (với điều kiện thử GP), sau mô hình Hill (với điều kiện thử GP), mô hình Weibull (với điều kiện thử GP) mô hình Makoid-Banakar (với điều kiện thử GP) 3.9.3 Thiết lập tƣơng quan Mô hình tương quan phù hợp mô hình có giá trị AIC nhỏ Môi trường đệm phosphat pH 5,8 tương ứng với mô hình Weibull mô tả tốt GP Mô hình tương quan PT1: (Thời gian: Tvivo = = ) mô hình tương quan in vitro – in vivo NNT diclofenac; mô hình lựa chọn hướng nghiên cứu luận án 3.9.4 Ứng dụng tƣơng quan in vitro – in vivo xây dựng tiêu giải phóng dƣợc chất nano nhũ tƣơng Kết cho thấy thay đổi môi trường giải phóng đệm phosphat pH 7,4 môi trường đệm phosphat pH 5,8; kiểm định t-test cho thấy khác phần trăm giải phóng dược chất mẫu nano nhũ tương bào chế quy mô 100 ml mẻ 001*, 002*, 003* quy mô 1000 ml (* với P > 0,05) điều kiện Phân tích phương sai ANOVA cho thấy khác phần trăm giải phóng dược chất thời điểm nghiên cứu mẻ 001*, 002*, 003* với quy mô 1000 ml (* với Pvalue > 0,05) Căn nghiên cứu thực mục 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, tiêu chuẩn sở cho chế phẩm nano nhũ tương đề xuất Bảng 3.58 Tiêu chuẩn chất lƣợng nano nhũ tƣơng nhỏ mắt diclofenac STT Yêu cầu CTCL Tính chất Lọ chất dẻo HDPE 10 ml, màu trắng, bên có chứa NNT màu trắng đục mờ, không mùi Giới hạn cho phép Thể tích nhũ tương nằm giới hạn thể tích 100% đến 110% thể tích ghi nhãn Định tính Dương tính với diclofenac 20 STT Yêu cầu CTCL Hàm lượng ADC (C14H11Cl2NO2) phải đạt từ 90,0 đến 110,0% so với hàm lượng ghi nhãn Phần trăm DC GP in 1giờ: < 10% vitro theo thời gian giờ: 10 – 15% môi trường pH 5,8* giờ: 15 – 25% KTG nhũ tương KTG nhũ tương TB phải nhỏ 200 nm, số đa phân tán (PdI) phải nhỏ 0,4 Thế zeta Giá trị tuyệt đối zeta phải không 30 mV pH 6,0 – 8,0 Độ vô khuẩn Định lượng Đạt vô khuẩn *Màng giải phóng: màng Spectra/Por® Dialysis Membrane (hãng Spectrum Laboratories) 12-14 kD Chƣơng BÀN LUẬN 4.1 Về acid diclofenac Từ kết nghiên cứu khảo sát ban đầu tham khảo tài liệu nghiên cứu trước đó, acid diclofenac nhóm nghiên cứu lựa chọn để bào chế NNT nhỏ mắt diclofenac Đây coi nghiên cứu lựa chọn DC ADC cho chế phẩm thuốc nhỏ mắt 4.2 Về bào chế nano nhũ tƣơng 4.2.1 Về công thức bào chế Dung môi pha dầu có vai trò quan trọng hệ ảnh hưởng đến việc hình thành nhũ tương độ tan DC Thành phần dầu IPM thay đổi lượng ảnh hưởng tới kích thước giọt nhiên với thành phần dầu Miglyol, Labrafac tăng làm tăng kích thước giọt Trong nghiên cứu, lựa chọn ba CDH không ion hóa là: Cre EL (HLB 12 - 14), Tw 80 (HLB 15), Span 80 (HLB 4,3) – CDH dung hợp tốt với mắt Hơn nữa, chất diện hoạt lựa chọn cho tổng số HLB nằm khoảng từ – 18 dễ dàng tạo NNT dầu/ nước Transcutol HP lựa chọn CĐDH, đồng dung môi (do có khả hòa tan nhiều DC, làm tăng độ tan DC pha dầu) có nhiều ưu điểm: kích ứng, sử dụng cho chế phẩm nhãn khoa, có khả cải thiện tính thấm DC qua giác mạc 21 4.2.2 Về thiết bị bào chế NNT diclofenac bào chế kỹ thuật siêu âm, kỹ thuật siêu âm kết hợp ĐNH áp suất cao, kỹ thuật phân cắt tốc độ cao, kết nghiên cứu quy trình bào chế NNT kỹ thuật siêu âm phù hợp sử dụng quy mô phòng thí nghiệm 4.3 Về khả giải phóng in vitro nano nhũ tƣơng nhỏ mắt diclofenac Lượng dược chất giải phóng từ NNT nhỏ mắt diclofenac phụ thuộc vào toàn yếu tố quy trình bào chế thành phần công thức 4.4 Về nghiên cứu độ ổn định Để hoàn thiện quy trình sản xuất nano nhũ tương diclofenac cần có nghiên cứu độ ổn định thời gian dài nhằm đánh giá xác độ ổn định tuổi thọ chế phẩm 4.5 Về xây dựng tiêu chuẩn sở Tiêu chuẩn sở chế phẩm nhũ tương nano nhỏ mắt đề xuất cho mẻ quy mô nhỏ Do kết nghiên cứu mang tính chất tham khảo cho nghiên cứu quy mô lớn 4.6 Về nghiên cứu tính kích ứng Thử nghiệm theo tiêu chuẩn ISO 10993-10: 2002 (E); B.3 “ Ocular Irritation test” cho thấy chế phẩm không gây kích ứng mắt Thực nghiệm theo thử nghiệm đảm bảo tính đạo đức không gây đau đớn động vật 4.7 Về đánh giá sinh khả dụng in vivo 4.7.1 Về định lƣợng diclofenac dịch tiền phòng Phương pháp định lượng diclofenac HPLC với detector DAD tiến hành nghiên cứu trước đồng thời tăng thể tích tiêm mẫu lên 50 μL thêm chuẩn vào mẫu phân tích lựa chọn Để thực định lượng diclofenac dịch tiền phòng, quy trình thẩm định phương pháp phân tích dịch sinh học theo tiêu chuẩn FDA tính đặc hiệu, độ đúng, độ lặp lại, độ tuyến tính giới hạn định lượng Phương pháp cho kết đủ tin cậy xác phạm vi mục tiêu nghiên cứu 22 4.7.2 Về lựa chọn mô hình dƣợc động học thiết lập tƣơng quan in vitro – in vivo Dữ liệu hòa tan in vitro qua môi trường GP khác thiết lập tương quan với bốn mô hình GP Mô hình Hill, Mô hình Weibull, Mô hình Double Weibull, Mô hình Makoid – Banakar; số AIC nhỏ mô hình GP định mô hình phù hợp cho môi trường Kết nghiên cứu tương quan in vitro – in vivo NNT diclofenac dùng cho nhãn khoa rõ ràng điều kiện thử GP pH 5,8, thiết bị bình Franz, tốc độ 400 vòng/phút theo mô hình Weibull Trong giới hạn luận án, thiết lập tương quan in vitro – in vivo NNT nhỏ mắt diclofenac dừng lại bước lựa chọn điều kiện thiết lập tương quan mô hình động học phù hợp Điều kiện thiết lập tương quan áp dụng việc xây dựng tiêu chuẩn sở cho chế phẩm nano nhũ tương diclofenac Nghiên cứu nhằm định hướng cho nghiên cứu việc ứng dụng tương quan IVIVC để lựa chọn công thức bào chế thích hợp hay tiến tới thay nghiên cứu in vivo tương lai KẾT LUẬN Bào chế nano nhũ tƣơng diclofenac ADC lần sử dụng làm hoạt chất công thức NNT nhỏ mắt Lần đầu tiên, NNT diclofenac 0,1% tiến hành bào chế thiết bị phân cắt tốc độ cao thiết bị siêu âm, thiết bị siêu âm kết hợp với ĐNH áp suất cao với quy trình bào chế Chế phẩm hình thành tiến hành đánh giá khả GP DC in vitro, đánh giá ảnh hưởng thành phần CT đến số đặc tính vật lý NNT, đánh giá ảnh hưởng thành phần đến khả GP in vitro NNT nhỏ mắt Lượng thành phần dầu, chất diện hoạt, chất đồng diện hoạt có ảnh hưởng tới khả giải phóng in vitro chế phẩm Thành phần đệm borat cho điện zeta cao, tạo ổn định cho hệ NNT có thành phần dầu IPM cho thấy đồng ổn định qua thiết bị bào chế khác Quy trình bào chế kỹ thuật siêu âm cho thấy phù hợp sử dụng quy mô phòng thí nghiệm Các mẫu NNT hình thành ổn định có KTG nhỏ 300nm, số đa phân tán PdI ~ 0,3, giá trị tuyệt đối zeta lớn 30 mV tỉ lệ DC nhũ hóa lớn 90% 23 Nâng quy mô, dự thảo TCCS, đánh giá độ ổn định Do điều kiện phòng thí nghiệm, nghiên cứu tiến hành nâng quy mô từ 100 ml lên 1000ml Thiết kế mẻ với quy mô 1000 ml, đánh giá tính lặp lại quy trình bào chế Kết cho thấy sai khác tiêu chất lượng mẻ quy mô 1000 ml điều kiện nghiên cứu Căn kết nghiên cứu thu dự thảo tiêu chuẩn chất lượng NNT nhỏ mắt diclofenac đề xuất với 12 tiêu chí (tính chất, giới hạn cho phép thể tích, định tính, định lượng, phần trăm GP DC, KTG nhũ tương, zeta, độ nhớt, pH, độ vô khuẩn, tỉ lệ dược chất nhũ hóa) Nano nhũ tương sau tiến hành nghiên cứu độ ổn định sau tháng, với trợ giúp phần mềm Mini Tab, tuổi thọ dự đoán 24 tháng Đánh giá sinh khả dụng, thiết lập tƣơng quan in vitro – in vivo Việc đánh giá SKD thuốc nghiên cứu mắt thỏ chứng minh NNT diclofenac có khả kéo dài thời gian lưu thuốc trước giác mạc làm tăng thấm DC qua giác mạc nên cải thiện SKD chế phẩm so với dạng DD đối chiếu Các kết nghiên cứu đánh giá SKD NNT nhỏ mắt diclofenac góp phần định hướng cho nghiên cứu việc đánh giá SKD thuốc có cấu trúc nano NNT nhỏ mắt diclofenac sau đánh giá SKD in vitro, SKD in vivo thiết lập mô hình tương quan in vitro – in vivo Kết nghiên cứu cho thấy tương quan in vitro – in vivo NNT dùng cho nhãn khoa rõ ràng điều kiện thử giải phóng qua môi trường đệm phosphat pH 5,8, thiết bị bình Franz, tốc độ khuấy 400 vòng/phút theo mô hình Weibull Đây môi trường GP thích hợp cho nghiên cứu chế phẩm NNT diclofenac để có mô hình tương quan phù hợp trình GP thuốc in vitro hấp thu thuốc in vivo Môi trường đệm phosphat (0,01 M) pH 5,8 tiến hành lựa chọn để làm môi trường giải phóng xây dựng TCCS cho chế phẩm NNT nhỏ mắt diclofenac ĐỀ XUẤT Hoàn thiện quy trình bào chế nano nhũ tương diclofenac 0,093% quy mô lớn Đánh giá độ ổn định dài hạn để xác định xác tuổi thọ nano nhũ tương diclofenac 0,093% 24 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ Đặng Thị Hiền, Vũ Ngọc Mai, Nguyễn Trần Linh (2012), “Nghiên cứu bào chế bước đầu đánh giá khả giải phóng dược chất in vitro nano nhũ tương nhỏ mắt diclofenac”, Tạp chí Y Dược học Quân sự, tập 37, số 1, tr 27-32 Đặng Thị Hiền, Nguyễn Hồng Vân, Nguyễn Thị Phượng, Nguyễn Trần Linh (2013), “Nghiên cứu bào chế nano nhũ tương nhỏ mắt diclofenac thiết bị phân cắt tốc độ cao”, Tạp chí Y Dược học Quân sự, tập 38, số 1, tr 7-12 Đặng Thị Hiền, An Phương Hà, Quản Duy Quang, Vũ Ngọc Mai, Nguyễn Trần Linh (2015), “Đánh giá sinh khả dụng thuốc nhỏ mắt nano nhũ tương diclofenac mắt thỏ”, Tạp chí Nghiên cứu dược Thông tin thuốc, tập 6, số 4, tr 19-23