Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng diclofenac trong dịch tiền phòng mắt thỏ và bước đầu đánh giá sinh khả dụng của nhũ tương nano nhỏ mắt diclofenac

ĐẶT VẤN ĐỀ NSAIDs – nhóm chống viêm không steroid là một nhóm dược chất quan trọng dùng cho mục đích giảm đau, chống viêm trong các bệnh vềmắt với nhiều ưu điểm so với thuốc chống viêm steroid nhưkhông làm giảm đáp ứng miễn dịch, không gây ra đục thủy tinh thể, tăng nhãn áp và không ức chếsựtái tạo của lớp biểu mô giác mạc. Diclofenac là một dược chất điển hình thuộc nhóm này. Tuy nhiên trên thịtrường hiện chỉcó dạng dung dịch nhỏmắt natri diclofenac 0,1% với nhiều hạn chếcủa dạng bào chếquy ước nhưsinh khảdụng thấp, thời gian tác dụng ngắn, người bệnh phải dùng thuốc ít nhất 3 – 5 lần mỗi ngày. Gần đây, cùng với sựphát triển của công nghệnano, rất nhiều dạng bào chếmới đã ra đời với nỗlực khắc phục những nhược điểm của dạng bào chếcổ điển trong đó có dạng nhũtương nano với nhiều ưu điểm nổi trội. Chính vì vậy, bộmôn Bào chế đã tiến hành nghiên cứu bào chếnhũtương nano nhỏmắt diclofenac nhằm làm tăng tính thấm của dược chất, kiểm soát giải phóng thuốc, duy trì tác dụng kéo dài, hiệu quảvà thuận tiện cho người sửdụng. Hiện tại, công thức cơbản cho chếphẩm cũng nhưphương pháp bào chế đã bắt đầu được xác định 7, 8, 9, 10. Tiếp theo những nghiên cứu trên, chúng tôi tiến hành đềtài: “Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng diclofenac trong dịch tiền phòng mắt thỏvà bước đầu đánh giá sinh khảdụng của nhũtương nano nhỏmắt diclofenac” với các mục tiêu: 1. Xây dựng và thẩm định được phương pháp định lượng diclofenac trong dịch tiền phòng mắt thỏ. 2. Bước đầu đánh giá sinh khảdụng của chếphẩm trên mắt thỏbằng phương pháp trên.

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

QUẢN DUY QUANG

XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG DICLOFENAC TRONG DỊCH TIỀN PHÒNG MẮT THỎ

VÀ BƯỚC ĐẦU ĐÁNH GIÁ SINH KHẢ DỤNG CỦA NHŨ TƯƠNG NANO NHỎ

MẮT DICLOFENAC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2014

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

QUẢN DUY QUANG

XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG DICLOFENAC TRONG DỊCH TIỀN PHÒNG MẮT THỎ

VÀ BƯỚC ĐẦU ĐÁNH GIÁ SINH KHẢ DỤNG CỦA NHŨ TƯƠNG NANO NHỎ

LỜI CẢM ƠN

Trong những dòng đầu tiên này, tôi xin phép được gửi lời cảm ơn sâu sắc tới:

PGS.TS Nguyễn Văn Long

đỡ tôi trong suốt 5 năm học tập tại trường

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè – những người

đã dành cho tôi sự giúp đỡ và động viên quý báu trong suốt thời gian qua

Hà nội, ngày 8 tháng 5 năm 2014

Sinh viên

Quản Duy Quang

MỤC LỤC

Danh mục các kí hiệu, các chữ viết tắt

Danh mục các bảng

Danh mục các hình vẽ, đồ thị

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Thông tin về dược chất diclofenac 2

1.1.1 Công thức hóa học 2

1.1.2 Đặc tính lý hóa 2

1.1.3.Tác dụng dược lí 3

1.2 Thuốc nhỏ mắt 3

1.2.1 Định nghĩa 3

1.2.2 Sinh khả dụng thuốc nhỏ mắt 3

1.2.3 Một số biện pháp cải thiện sinh khả dụng của thuốc nhãn khoa 4

1.3 Nhũ tương nano 4

1.3.1 Định nghĩa 4

1.3.2 Một số ưu điểm của nhũ tương nano 4

1.3.3 Các nghiên cứu nhũ tương nano diclofenac đã thực hiện 5

1.4 Xây dựng, thẩm định phương pháp định lượng dược chất trong dịch sinh học 6 1.4.1 Thẩm định phương pháp phân tích trong dịch sinh học 7

1.4.2 Một số phương pháp định lượng diclofenac trong dịch tiền phòng 10

1.5 Đánh giá sinh khả dụng in vivo của thuốc nhỏ mắt 11

1.5.1 Các phương pháp đánh giá sinh khả dụng in vivo của thuốc nhỏ mắt 11

1.5.2.Một số nghiên cứu đánh giá sinh khả dụng của thuốc nhỏ mắt 13

1.6 Một số mô hình dược động học 14

1.6.1 Mô hình ngăn (Compartmental Modelling) 14

1.6.2 Mô hình không ngăn (Noncompartmental Modelling) 16

1.6.3 Một số nghiên cứu về dược động học của thuốc nhỏ mắt 19

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.1 Nguyên liệu, thiết bị, động vật thí nghiệm 20

2.1.1 Nguyên liệu 20

2.1.2 Thiết bị 20

2.1.3 Động vật thí nghiệm 21

2.2 Nội dung nghiên cứu 21

2.3 Phương pháp nghiên cứu 21

2.3.1 Phương pháp bào chế nhũ tương nano nhỏ mắt diclofenac 21

2.3.2 Phương pháp bào chế dung dịch nhỏ mắt diclofenac so sánh 22

2.3.3 Phương pháp định lượng 23

2.3.4 Thẩm định phương pháp định lượng diclofenac trong dịch tiền phòng 24

2.3.5 Đánh giá sinh khả dụng và các thông số dược động học 26

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 31

3.1 Thẩm định phương pháp định lượng diclofenac trong dịch tiền phòng 31

3.1.1 Tính chọn lọc 31

3.1.2 Tính tuyến tính 32

3.1.3 Giới hạn định lượng dưới 35

3.1.4 Độ đúng, độ chính xác 36

3.1.5 Độ ổn định 38

3.2 Đánh giá sinh khả dụng và các thông số dược động học 40

3.2.1 Xác định khối lượng riêng của các dạng bào chế 40

3.2.2 So sánh nồng độ diclofenac trong dịch tiền phòng của nhũ tương nano và dạng dung dịch 40

3.2.3 Xây dựng đường biểu diễn mức độ giải phóng in vivo của nhũ tương nano so với dung dịch 45

3.2.4 Khảo sát một vài thông số dược động học 47

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 49

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AD Diclofenac

AUC Diện tích dưới đường cong

(Area under curve)

CDH Chất diện hoạt

DAD Detector mảng diod

(Diode Array Detector)

ĐDH Chất đồng diện hoạt

ĐNH Đồng nhất hóa

ECD Detector điện hóa

(Electrochemical detector)

FDA Cơ quan quản lý thực phẩm dược phẩm Mỹ

(Food and Drug Administration)

FLD Detector huỳnh quang

(Flourescent detector)

HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao

(High performance liquid chromatography)

HQC Mẫu kiểm tra nồng độ cao

(High Quality Control)

KTTP Kích thước tiểu phân

LLOQ Giới hạn định lượng dưới

(Lower Limit of Quantitation)

LOD Giới hạn phát hiện

(Limit of detection)

LQC Mẫu kiểm tra nồng độ thấp

(Low Quality Control)

MQC Mẫu kiểm tra nồng độ trung bình

(Medium Quality Control)

MRT Thời gian lưu trung bình

(Mean residence time)

NSAIDs Nhóm thuốc chống viêm không steroid

(Nonsteroidal anti-inflammatory drugs)

NTN Nhũ tương nano

PdI Chỉ số đa phân tán

(Polydispersity index)

SKD Sinh khả dụng USP Dược điển Mỹ

(The United States Pharmacopeia)

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Một số điều kiện chạy sắc ký định lượng AD trong dịch tiền phòng 10

Bảng 1.2 Một số đặc điểm giải phẫu, sinh lý của mắt người và mắt thỏ 12

Bảng 2.1 Nguyên liệu sử dụng 20

Bảng 3.1 Ảnh hưởng của mẫu trắng tại thời điểm trùng với thời gian lưu của AD 32

Bảng 3.2 Tương quan giữa nồng độ AD trong dịch tiền phòng và diện tích peak 33

Bảng 3.3 Nồng độ diclofenac trong các mẫu chuẩn tính theo phương trình hồi quy 34

Bảng 3.4 Xác định giới hạn định lượng dưới (LLOQ) 35

Bảng 3.5 Kết quả thẩm định độ đúng, độ lặp lại trong ngày 36

Bảng 3.6 Kết quả thẩm định độ đúng, độ lặp lại khác ngày 37

Bảng 3.7 Độ ổn định của mẫu sau xử lý bảo quản ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ 39

Bảng 3.8 Khối lượng riêng của dạng NTN và dạng dung dịch 40

Bảng 3.9 Kết quả thí nghiệm và tính toán các lô 41

Bảng 3.10 Kết quả thí nghiệm và tính toán trung bình 3 lô 43

Bảng 3.11 Mức độ giải phóng in vivo của NTN so với dung dịch 45

Bảng 3.12 Các thông số dược động học tính toán nhờ phần mềm Phoenix 48

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Công thức cấu tạo acid diclofenac 2

Hình 1.2 Mô hình đánh giá khả năng thấm của dược chất qua giác mạc bằng phương pháp vi thẩm tích 13

Hình 1.3 Một số mô hình ngăn cho thuốc nhỏ mắt 14

Hình 1.4 Đường cong thực nghiệm C p – t trong mô hình không ngăn 17

Hình 3.1 Sắc ký đồ của dịch tiền phòng trắng 31

Hình 3.2 Sắc ký đồ của dịch tiền phòng có chứa diclofenac ở nồng độ 500 ng/mL 31

Hình 3.3 Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa nồng độ diclofenac trong dịch tiền phòng và diện tích peak 33

Hình 3.4 Đồ thị biểu diễn đường cong nồng độ - thời gian trung bình 3 lô 43

Hình 3.5 Đồ thị biểu diễn mức độ giải phóng in vivo của NTN so với dung dịch 46

ĐẶT VẤN ĐỀ

NSAIDs – nhóm chống viêm không steroid là một nhóm dược chất quan trọng dùng cho mục đích giảm đau, chống viêm trong các bệnh về mắt với nhiều ưu điểm so với thuốc chống viêm steroid như không làm giảm đáp ứng miễn dịch, không gây ra đục thủy tinh thể, tăng nhãn áp và không ức chế sự tái tạo của lớp biểu mô giác mạc Diclofenac là một dược chất điển hình thuộc nhóm này Tuy nhiên trên thị trường hiện chỉ có dạng dung dịch nhỏ mắt natri diclofenac 0,1% với nhiều hạn chế của dạng bào chế quy ước như sinh khả dụng thấp, thời gian tác dụng ngắn, người bệnh phải dùng thuốc ít nhất 3 – 5 lần mỗi ngày

Gần đây, cùng với sự phát triển của công nghệ nano, rất nhiều dạng bào chế mới đã

ra đời với nỗ lực khắc phục những nhược điểm của dạng bào chế cổ điển trong đó có dạng nhũ tương nano với nhiều ưu điểm nổi trội Chính vì vậy, bộ môn Bào chế đã tiến hành nghiên cứu bào chế nhũ tương nano nhỏ mắt diclofenac nhằm làm tăng tính thấm của dược chất, kiểm soát giải phóng thuốc, duy trì tác dụng kéo dài, hiệu quả và thuận tiện cho người sử dụng Hiện tại, công thức cơ bản cho chế phẩm cũng như phương pháp bào chế đã bắt đầu được xác định [7], [8], [9], [10]

Tiếp theo những nghiên cứu trên, chúng tôi tiến hành đề tài:

“Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng diclofenac trong dịch tiền phòng mắt thỏ và bước đầu đánh giá sinh khả dụng của nhũ tương nano nhỏ mắt diclofenac” với các mục tiêu:

1 Xây dựng và thẩm định được phương pháp định lượng diclofenac trong dịch tiền phòng mắt thỏ

2 Bước đầu đánh giá sinh khả dụng của chế phẩm trên mắt thỏ bằng phương pháp trên

 Hệ số phân bố dầu nước (n-octanol/nước): log P = 1,69 [33]

 Hấp thụ UV: λmax (methanol) = 285 nm λmax (acetonitril) = 278 nm [35]

Tính chất hóa học:

Là một dẫn chất của anilin, diclofenac có thể bị oxy hóa:

 Dung dịch trong methanol, thêm acid nitric đặc sẽ có màu đỏ nâu [4], [5]

 Dung dịch trong ethanol cho phản ứng với các dung dịch kali fericyanid, sắt (III) clorid, và acid hydrocloric sẽ cho màu xanh và có tủa [4], [5]

Định tính:

 Dựa trên các phản ứng đặc trưng trình bày ở mục tính chất hóa học

 Đo phổ hồng ngoại và sắc kí lớp mỏng: so sánh với chất chuẩn [5]

1.2 Thuốc nhỏ mắt

1.2.1 Định nghĩa

Thuốc nhỏ mắt là những chế phẩm lỏng, có thể là dung dịch hay hỗn dịch vô khuẩn, có chứa một hay nhiều dược chất, được nhỏ vào túi kết mạc với mục đích chẩn đoán hay điều trị bệnh ở mắt Thuốc nhỏ mắt cũng có thể được bào chế dưới dạng bột

vô khuẩn và pha với một chất lỏng vô khuẩn thích hợp ngay trước khi dùng [1]

1.2.2 Sinh khả dụng thuốc nhỏ mắt

Sinh khả dụng của thuốc nhỏ mắt qui ước thường rất thấp (khoảng 1% - 3%) bởi hai nguyên nhân chính là cơ chế bảo vệ sinh lý và cấu tạo giải phẫu của mắt Cơ chế bảo vệ sinh lý có thể kể đến như chớp mắt, tiết nước mắt, trào ra má hoặc tháo rút theo ống mũi – lệ nếu quá thể tích sinh lý bình thường của màng nước mắt Cấu tạo giải phẫu của giác mạc với các lớp thân lipid và thân nước đan xen làm dược chất rất khó

thấm Ngoài ra, hấp thu qua hệ thống mạch máu ở kết mạc vào vòng tuần hoàn chung cũng là một nguyên nhân làm giảm sinh khả dụng của thuốc nhỏ mắt [1], [20]

1.2.3 Một số biện pháp cải thiện sinh khả dụng của thuốc nhãn khoa

Tăng thời gian lưu thuốc ở vùng trước giác mạc: hạn chế gây kích ứng mắt, tăng độ nhớt, kết dính sinh học, bào chế hỗn dịch, thuốc mỡ, hệ cài đặt ở mắt…[1], [20]

Tăng tính thấm của giác mạc với dược chất: sử dụng các chất làm tăng tính thấm của biểu mô giác mạc với dược chất: chất tạo phức chelat với ion calci (natri edetat), chất diện hoạt (Tween 80, Brij…), thay đổi tính thấm của dược chất với biểu mô giác mạc (tiền thuốc) [1], [20]

Hiện nay các hệ tiểu phân như: vi cầu, vi nang, hỗn dịch, nhũ tương, liposome, niosome, dendrime, … có kích thước nm đến µm sử dụng cho nhãn khoa đang được tập trung nghiên cứu nhiều, trong đó nhũ tương nano với đặc điểm riêng về cấu trúc, tính chất đã được chứng minh là có khả năng kéo dài thời gian tác dụng của thuốc, thấm sâu hơn vào các tổ chức bên trong mắt, tăng sinh khả dụng và hiệu lực điều trị, giảm số lần sử dụng thuốc cho người bệnh [20], [29]

1.3 Nhũ tương nano

1.3.1 Định nghĩa

Nhũ tương là một hệ phân tán cơ học vi dị thể, được tạo bởi hai chất lỏng không đồng tan, trong đó một chất lỏng được phân tán đồng đều vào chất lỏng thứ hai (môi trường phân tán) dưới dạng các tiểu phân có đường kính từ 0,1 đến hàng chục micromet [1]

Nhũ tương nano (còn được gọi là nhũ tương siêu mịn, nhũ tương dưới micro), thường có KTTP từ 50-200 nm, và có chỉ số đa phân tán thấp [17], [36]

1.3.2 Một số ưu điểm của nhũ tương nano

Sử dụng đơn giản và tiện lợi như dung dịch nhỏ mắt, tránh cảm giác cộm mắt khi sử dụng hệ tiểu phân rắn, hệ cài đặt, tránh mờ mắt của dạng thuốc mỡ…[29]

Giảm kích ứng mắt với các dược chất dễ gây kích ứng do dược chất được hòa tan trong pha nội [29]

Các tiểu phân nano như một kho chứa thuốc, khuếch tán từ từ, kiểm soát và duy trì giải phóng, thích hợp với các bệnh mạn tính, cải thiện sinh khả dụng của các thuốc

có thời gian bán thải ngắn, thuốc được giải phóng kéo dài, giảm số lần dùng thuốc trong ngày so với dạng thuốc nhỏ mắt, hạn chế tác dụng phụ và tổn thương tế bào biểu mô mắt [29]

Các tiểu phân có sức căng bề mặt nhỏ làm tăng khả năng thấm ướt, giúp hệ phân tán rộng và tăng thời gian tiếp xúc của thuốc với giác mạc [29]

Dễ tiệt khuẩn [29]

Độ ổn định cao, ít bị lên bông, kết tụ, sa lắng như các nhũ tương micro [29]

1.3.3 Các nghiên cứu nhũ tương nano diclofenac đã thực hiện

Cùng với xu hướng chung của thế giới, tại Việt nam các hệ siêu vi tiểu phân cũng

đã được triển khai nghiên cứu rất nhiều Tuy nhiên, dạng nano nhũ tương nhỏ mắt chứa diclofenac chỉ mới lần đầu tiên được nghiên cứu bắt đầu ở bộ môn Bào chế - trường Đại học Dược Hà nội từ năm 2011

Đầu tiên, Vũ Ngọc Mai (2011) sử dụng phương pháp siêu âm đã bào chế thành công NTN diclofenac (cả dạng acid và dạng muối) với ba loại pha dầu là isopropyl myristat, Labrafac PG và Miglyol cùng với CDH Tween 80, Cremophor EL, Span 80, ĐDH Transcutol HP Đồng thời, tác giả cũng đánh giá được ảnh hưởng của các loại hệ đệm, lượng pha dầu, nồng độ CDH và ĐDH đến độ ổn định vật lý và khả năng giải

phóng dược chất in vitro [7]

Trên cơ sở đó, Nguyễn Thị Phượng (2012) lựa chọn dạng acid của diclofenac, pha dầu isopropyl myristat với tỉ lệ các CDH và ĐDH thích hợp để so sánh phương pháp bào chế siêu âm và siêu âm kết hợp đồng nhất hóa áp suất cao Kết quả cho thấy, tuy không có sự khác biệt về độ ổn định và tỉ lệ dược chất được nhũ hóa nhưng phương

pháp siêu âm kết hợp đồng nhất hóa có KTTP nhỏ hơn, lượng dược chất giải phóng in

vitro trong 2 giờ đầu là tương tự nhưng các giờ tiếp theo siêu âm kết hợp đồng nhất hóa giải phóng nhiều hơn [8]

Nguyễn Hồng Vân (2012) tiếp tục thay đổi công thức bằng cách kết hợp cả hai pha dầu Miglyol và isopropyl myristat, thay đổi các tỉ lệ CDH và ĐDH, bổ sung thêm PG

và bào chế bằng phương pháp phân cắt tốc độ cao Sau đó tương tự các nghiên cứu trên đánh giá độ ổn định vật lý, các đặc tính vật lý (KTTP, PdI, thế zeta, độ nhớt) và khả

năng giải phóng dược chất in vitro, qua đó đã lựa chọn ra 3 công thức tối ưu để nghiên

cứu độ ổn định trong 6 tháng Sau 6 tháng KTTP, thế zeta, tỉ lệ dược chất trong pha dầu, hàm lượng dược chất và phần trăm dược chất giải phóng tại các thời điểm có thay đổi, nhưng vẫn có khả năng tác dụng kéo dài Tác giả đã đi đến kết luận NTN nhỏ mắt diclofenac bảo quản tốt nhất ở 2 – 80C [10]

Qua ba nghiên cứu trên, Nguyễn Thị Thúy (2013) lựa chọn ra 4 công thức, sử dụng phương pháp siêu âm kết hợp phân cắt tốc độ cao hoặc đồng nhất hóa áp suất cao để khảo sát nâng quy mô bào chế từ 100 mL lên 1000 mL Tác giả đã tìm được thời gian siêu âm cũng như đồng nhất hóa thích hợp thông qua đánh giá các đặc tính vật lý

(KTTP, PdI, thế zeta, độ nhớt) và khả năng giải phóng dược chất in vitro [9]

Với những kết quả đã đạt được, nghiên cứu đánh giá sinh khả dụng in vivo ở giai

đoạn tiếp theo là cần thiết để có những đánh giá, lựa chọn giá trị hơn trong việc tìm ra công thức và phương pháp bào chế tối ưu

1.4 Xây dựng, thẩm định phương pháp định lượng dược chất trong dịch sinh học

Để thực hiện các nghiên cứu đánh giá sinh khả dụng in vivo, một trong những nội dung quan trọng là xây dựng được quy trình chiết tách, xử lý mẫu và định lượng thuốc trong dịch sinh học Với các thuốc nhỏ mắt, nội dung này chủ yếu đề cập đến việc xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng dược chất trong dịch tiền phòng

1.4.1 Thẩm định phương pháp phân tích trong dịch sinh học

Để có khả năng áp dụng và đảm bảo chính xác, bất kì một phương pháp phân tích nào cũng cần thẩm định Theo hướng dẫn của FDA [18], quá trình thẩm định phương pháp phân tích trong dịch sinh học được tiến hành qua ba giai đoạn:

 Chuẩn bị chất chuẩn

 Xây dựng và thẩm định phương pháp phân tích

 Áp dụng phương pháp thẩm định cho các mẫu phân tích thường qui và các tiêu chuẩn chấp nhận cho lô mẻ phân tích

1.4.1.1 Chuẩn bị chất chuẩn

Để kết quả phân tích có giá trị trước hết phải hiệu chuẩn được phép đo bằng các mẫu thử chứa chất chuẩn với nồng độ biết trước Mức độ tinh khiết của chất chuẩn dùng để pha mẫu thử sẽ ảnh hưởng đến quá trình hiệu chuẩn Chính vì vậy mà cần phải biết chính xác tỉ lệ các thành phần trong chất chuẩn (phần trăm dạng acid, base tự do, phần trăm dạng muối, este…) [18]

Có 3 loại chất chuẩn thường được sử dụng:

 Chuẩn được cấp chứng chỉ (Vd: chuẩn USP)

 Chuẩn thương mại từ các công ty sản xuất có uy tín

đo đạc giữa mẫu chuẩn và mẫu trắng (với cùng quy trình xử lý) để chứng minh được rằng chất định lượng được chính là chất cần phân tích [18]

 Mẫu chuẩn nên được pha ở nồng độ giới hạn định lượng dưới [18]

 Mẫu trắng phải có ít nhất 6 mẫu lấy từ 6 nguồn khác nhau (khi chưa sử dụng

đánh giá và cũng không cần nhất thiết phải đạt tới 100% nhưng cũng không nên quá thấp [18]

 Độ tìm lại thường được khảo sát với các quy trình có xử lý mẫu bằng chiết lỏng – lỏng hay chiết pha rắn Để xác định độ tìm lại cần chuẩn bị ít nhất 3 lô mẫu ở nồng độ thấp, trung bình và cao trong khoảng khảo sát [18]

c- Xây dựng đường chuẩn (Calibration Curve)

Đường chuẩn là đường biểu diễn mối quan hệ giữa diện tích peak và nồng độ thuốc trong dịch sinh học

 Xây dựng đường chuẩn cần chuẩn bị ít nhất 6 mẫu chuẩn khác nhau với các nồng độ biết trước trong khoảng cần khảo sát trong đó có nồng độ LLOQ [18]

 Đa phần đường chuẩn được thiết lập theo mô hình hồi quy tuyến tính Hiện tại, không có một quy định cụ thể nào cho hệ số tin cậy R Tuy nhiên để có tính tuyến tính cao, phân tích chính xác, giá trị R nên ít nhất lớn hơn 0,98

 Sau khi xây dựng được đường chuẩn, tính lại nồng độ dược chất có trong mẫu theo phương trình hồi quy đã xây dựng Yêu cầu phải có ít nhất 75% số mẫu có

độ đúng so với giá trị nồng độ thực đạt từ 85 – 115% Độ đúng của mẫu có nồng

độ thấp nhất được phép trong khoảng từ 80 – 120% [18]

d- Giới hạn định lượng dưới (LLOQ)

Giới hạn định lượng dưới (LLOQ) là nồng độ thấp nhất có khả năng định lượng Giới hạn định lượng dưới phải thỏa mãn yêu cầu:

 Đáp ứng ở nồng độ này ít nhất phải bằng 5 lần đáp ứng của mẫu trắng [18]

 Độ đúng phải bằng 80 -120 % so với giá trị nồng độ thực [18]

 Độ chính xác tính theo hệ số biến thiên CV của ít nhất 5 mẫu không được vượt quá 20% [18]

e- Độ ổn định (Stability)

Trên thực tế, các mẫu sinh học thu được thường ít khi được phân tích ngay lập tức

Do vậy, cần phải nghiên cứu xem chất phân tích có bị biến đổi không trong quá trình bảo quản cũng như quá trình tiến hành thí nghiệm ở nhiệt độ phòng

Đánh giá độ ổn định với ít nhất 2 nồng độ (nồng độ thấp và nồng độ cao trong khoảng nồng độ đã khảo sát), mỗi nồng độ ít nhất 3 mẫu Chênh lệch kết quả phân tích trung bình trước và sau khi bảo quản không được vượt quá 15% [18]

1.4.2 Một số phương pháp định lượng diclofenac trong dịch tiền phòng

Nồng độ dược chất nói chung và diclofenac nói riêng trong dịch tiền phòng thường rất thấp Chính vì vậy, các nghiên cứu hiện nay chủ yếu sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao để định lượng bởi ưu điểm có độ nhạy cao Một số điều kiện chạy sắc ký cho định lượng diclofenac trong dịch tiền phòng có thể tham khảo được trình bày ở bảng 1.1

Bảng 1.1 Một số điều kiện chạy sắc ký định lượng AD trong dịch tiền phòng

Ultrasphere octyl

(5 µm, 150 x 4,5 mm i.d.)

Tốc độ dòng

1 mL/phút

Acid acetic băng 1,65% :

Acetonitril (chứa 0,065%

Regis SPS

100 RP-8

(5 µm, 150 x 4,6 mm i.d.)

Tốc độ dòng 1,3 mL/phút

Acetonitril :

Sodium acetat (30mM) pH 3

= 40:60 hoặc 50:50

Nucleosil 100-5 C18

(5 µm, 250 x 4,6 mm i.d.)

Tốc độ dòng

1 mL/phút

Acid acetic băng 1,65% :

Acetonitril (chứa 0,065%

Tốc độ dòng

1 mL/phút

Acetonitril :

Sodium acetat (30mM) pH 3

1.5 Đánh giá sinh khả dụng in vivo của thuốc nhỏ mắt

1.5.1 Các phương pháp đánh giá sinh khả dụng in vivo của thuốc nhỏ mắt

Để đánh giá sinh khả dụng, dược động học hay tác dụng dược lý của một thuốc bất

kì trước hết phải tiến hành các thử nghiệm đánh giá trên động vật Với thuốc nhỏ mắt, thỏ là động vật thường được lựa chọn bởi có sự giống nhau tương đối giữa cấu tạo giải phẫu và các thông số sinh lý cơ bản giữa mắt người và mắt thỏ (bảng 1.2) [25]

Bảng 1.2 Một số đặc điểm giải phẫu, sinh lý của mắt người và mắt thỏ [25]

Thể tích nước mắt (µL) 5 – 10 7 – 30 Tốc độ thay thế nước mắt (µL/phút) 0,6 – 0,8 0,5 – 2,2 Tốc độ chớp mắt tự phát 4 – 5 lần/giờ 6 – 15 lần/phút

Hiện tại, có khá nhiều phương pháp để đánh giá sinh khả dụng của thuốc nhỏ mắt trên thỏ tuy nhiên đều gặp phải hạn chế bởi lượng mẫu lấy được từ mỗi thời điểm rất ít

và rất khó lấy mẫu Các phương pháp phổ biến có thể kể đến là:

 Định lượng dược chất trong dịch tiền phòng

 Định lượng dược chất ở một số mô trong mắt (giác mạc, kết mạc …)

 Đo các đáp ứng trên lâm sàng (đếm số bạch cầu với thuốc chống viêm, đo nhãn

áp với thuốc chống tăng nhãn áp…)

Mỗi phương pháp đánh giá đều có những ưu, nhược điểm riêng và được áp dụng tùy theo mục đích nghiên cứu Tuy nhiên, với những thuốc mà đích tác dụng là trong nhãn cầu thì định lượng dược chất trong dịch tiền phòng là phù hợp nhất bởi đây là khu vực trung gian vận chuyển các chất đến các mô và tổ chức trong mắt [28] Vì vậy phương pháp này đã được lựa chọn để đánh giá sinh khả dụng nhũ tương nano nhỏ mắt diclofenac

1.5.2.Một số nghiên cứu đánh giá sinh khả dụng của thuốc nhỏ mắt

Alia A.Badawi đã nghiên cứu đánh giá sinh khả dụng giữa các dạng hỗn dịch nano, nhũ tương nano và dung dịch nhỏ mắt indomethacin bằng nhiều phương pháp [13]

 So sánh hỗn dịch nano và NTN: Mắt thỏ được gây viêm bằng dung dịch natri hydroxyd, sau đó sẽ được điều trị bằng một trong hai dạng bào chế trên Sau 21 ngày giết thỏ, lấy giác mạc, nhuộm và soi dưới kính hiển vi So sánh số lượng bạch cầu có trong mỗi mẫu Kết quả cho thấy mẫu lấy từ mắt được điều trị bằng NTN ít bạch cầu hơn mẫu lấy từ mắt được điều trị bằng dạng hỗn dịch nano Điều đó có nghĩa là NTN có khả năng chống viêm tốt hơn [13]

 So sánh NTN với dạng dung dịch: mỗi thỏ lần lượt được nhỏ vảo mắt trái dạng nhũ tương nano, mắt phải nhỏ dạng dung dịch Sau một khoảng thời gian nhất định, giết thỏ, hút lấy dịch tiền phòng và cắt lấy phần giác mạc Đem định lượng dược chất trong dịch tiền phòng và giác mạc thu được ở trên Kết quả cho thấy các mẫu lấy từ mắt được điều trị bằng NTN cho nồng độ dược chất cao hơn hẳn

so với các mẫu lấy từ mắt được điều trị bằng dạng dung dịch [13]

Xiang Li và cộng sự cũng đánh giá sinh khả dụng dựa vào định lượng nồng độ dược chất trong dịch tiền phòng nhưng với kĩ thuật đặt màng vi thẩm tích vào mắt thỏ, loại bỏ được đáng kể dao động cá thể so với các phương pháp khác (hình 1.2) [23]

Hình 1.2 Mô hình đánh giá khả năng thấm của dược chất qua giác mạc bằng

phương pháp vi thẩm tích [23]

1.6 Một số mô hình dược động học

Những nghiên cứu về dược động học đều phải dựa trên giả thuyết nhất định, điển hình là các giả thuyết về mô hình dược động học Các thuốc nhỏ mắt bởi các đặc thù về quá trình hấp thu, phân bố, chuyển hóa và thải trừ cần phải có mô hình cụ thể riêng nhưng hiện tại mới chỉ được nghiên cứu dựa trên các mô hình dành cho thuốc uống

1.6.1 Mô hình ngăn (Compartmental Modelling)

1.6.1.1 Mô hình ngăn

Mô hình ngăn coi cơ thể như là một hay nhiều ngăn đồng nhất, trong đó thuốc được hấp thu, phân bố, chuyển hóa và thải trừ theo những quy luật nhất định [3] Áp dụng với các thuốc nhỏ mắt, tiền phòng thường được coi là ngăn trung tâm và/hoặc có thể được coi là ngăn chứa thuốc [28] Giả thiết này phù hợp đặc điểm cấu tạo sinh lý bởi dịch tiền phòng chứa trong tiền phòng được vận chuyển tuần hoàn tới tất cả các mô

và tổ chức của mắt Giác mạc, kết mạc, thủy tinh thể, mống mắt, màng mạch, hậu phòng có thể được tách rời hoặc kết hợp thành một hay nhiều ngăn ngoại vi [28] Một

số mô hình ngăn đã được áp dụng có thể tham khảo ở hình 1.3

Hình 1.3 Một số mô hình ngăn cho thuốc nhỏ mắt [28]

Trong các nghiên cứu, tuy mô hình một ngăn (duy nhất ngăn tiền phòng) là mô hình không giống với sự phân bố thực của thuốc nhất nhưng lại hay được sử dụng vì

đơn giản Giả sử thuốc được hấp thu và thải trừ theo động học bậc nhất Diễn biến nồng độ thuốc theo thời gian sẽ là:

1.6.1.2 Phương pháp tính toán Wagner – Nelson

Cách tính toán trên nếu áp dụng với các dạng thuốc uống quy ước thì có thể đúng Tuy nhiên với thuốc nhỏ mắt, do cơ chế bảo vệ sinh lý của cơ thể làm thuốc bị rửa trôi pha loãng, lượng thuốc cũng như nồng độ ở ngăn số 0 (ngăn bên ngoài tiền phòng) không ổn định nên khó có thể được hấp thu theo động học bậc nhất Vẫn dựa trên mô hình một ngăn, Wagner – Nelson đã đề ra phương pháp tính phần trăm hấp thu nhưng chỉ với giả thiết là quá trình thải trừ của thuốc tuân theo động học bậc nhất (mà điều này thì đúng với đa số trường hợp) Ưu điểm của nó là cho phép xác định cơ chế hấp thu và so sánh đồng thời tốc độ và mức độ hấp thu [19]

Cơ sở tính toán của phương pháp

 Theo nguyên lý bảo toàn khối lượng:

A = W + E (*)

W: lượng thuốc hiện có trong cơ thể

E: lượng thuốc đã thải trừ

 Thuốc thải trừ theo động học bậc 1 nên:

W = Vd Cp → dW = Vd dCp

݀ܧ

݀ݐ = ܹ ܭ௘ → ݀ܧ݀ݐ = ܭ௘ ܸௗ ܥ௣

Trong đó: Vd: thể tích thuốc phân bố

Cp: nồng độ thuốc trong ngăn

Ngoài ra, từ phương trình (2) còn có thể so sánh SKD tương đối của hai dạng bào chế của cùng một hoạt chất trên cùng một nhóm đối tượng tham gia thử nghiệm:

ܣஶଵ

ܣஶଶ = ܣܷܥ

∞ଵ

ܣܷܥ∞ଶ

1.6.2 Mô hình không ngăn (Noncompartmental Modelling)

1.6.2.1 Mô hình không ngăn

Để có được mô hình ngăn sát với mô hình sinh lý của mắt thì số ngăn phải nhiều

và rất chi tiết, lấy mẫu và tính toán sẽ vô cùng phức tạp Tuy nhiên vẫn còn có một cách tiếp cận khác để nghiên cứu dược động học của thuốc nhỏ mắt Đó là mô hình không ngăn hay còn gọi là phương pháp mô hình độc lập

Cơ sở lý thuyết của phương pháp dựa trên quan điểm “Sự độc lập ngẫu nhiên của các phân tử” (Molecular Stochastic Independence – MSI) coi sự tồn tại của từng phân

tử thuốc trong cơ thể là độc lập với nhau và thời gian tồn tại của một phân tử thuốc trong cơ thể được xem như là một biến ngẫu nhiên [14], [31], [38]

Ưu điểm của loại mô hình này là đơn giản hơn vì không phải lập phương trình diễn biến Cp – t Trong mô hình này, người ta sử dụng các thông số đo được như Cp – nồng

độ thuốc trong dịch tiền phòng, Cmax – nồng độ dược chất cực đại, tmax – thời gian đạt nồng độ dược chất cực đại để miêu tả động học của thuốc không kể đến số ngăn với giả thuyết thuốc được bài xuất theo phương trình động học bậc nhất [3]

Hình 1.4 Đường cong thực nghiệm C p – t trong mô hình không ngăn

Các thông số dược động học cơ bản có thể tính toán được là:

 AUC – diện tích dưới đường cong nồng độ – thời gian

Ci: nồng độ dược chất tại thời điểm i

Cn: nồng độ dược chất tại thời điểm cuối cùng

λz : độ dốc của đường thẳng biểu diễn logarit nồng độ dược chất theo thời gian tại các điểm lấy mẫu cuối cùng của pha thải trừ

 AUMC – diện tích dưới đường cong nồng độ x thời gian – thời gian

 MRT – thời gian lưu trú thuốc trung bình

1.6.2.2 Phương pháp giải tích chập (deconvolution)

Trong nghiên cứu dược động học dựa trên mô hình không ngăn, giải tích chập là một phương pháp tin cậy được nhiều nghiên cứu sử dụng để tính toán tốc độ và mức độ hấp thu thuốc [31]

Nếu gọi:

 C(t) là hàm số biểu thị nồng độ thuốc trong huyết tương theo thời gian khi dùng đường ngoài tĩnh mạch

 rabs(t) là hàm số biểu thị tốc độ hấp thu theo thời gian

 Cδ(t) là hàm số biểu thị nồng độ thuốc trong huyết tương theo thời gian khi dùng đường tĩnh mạch bolus

thì:

 Tại một thời điểm τ bất kì, có một lượng rabs(τ).dτ được hấp thu

 Đến thời điểm t, một khoảng thời gian ứng với (t –τ) đã trôi qua Lượng thuốc hấp thu đó sẽ thải trừ tương ứng như với quá trình thuốc được tiêm tĩnh mạch Nghĩa là lượng thuốc còn lại trong cơ thể sẽ chỉ là Cδ (t – τ) rabs(τ).dτ

 Nồng độ thuốc trong máu tại thời điểm t sẽ bằng tổng cộng các vi phân Cδ (t– τ)

rabs(τ).dτ trong khoảng từ 0→t

࡯(࢚) = න ࡯࢚ ࢾ

૙ (࢚ − ࣎) ࢘ࢇ࢈࢙(࣎) ࢊ࣎

Nếu biết hai hàm C(t) và Cδ(t) ta sẽ tính được rabs(t) Kết quả có thể được tối ưu hóa thông qua tái tích chập (WLS Reconvolution) Tổng lượng dược chất được hấp thu tới thời điểm t (At) sẽ được tính theo công thức:

࡭࢚ = න ࢚࢘ ࢇ࢈࢙(࢛)ࢊ࢛

૙

Phương trình trên có thể cho phép xác định phần trăm hấp thu At/A∞ theo thời gian

và cơ chế của động học hấp thu

1.6.3 Một số nghiên cứu về dược động học của thuốc nhỏ mắt

Nghiên cứu về dược động học của thuốc nhỏ mắt đã được tiến hành khá nhiều trên thế giới Vào những năm 90, đa phần các tác giả sử dụng mô hình ngăn để làm cơ

sở [12], [16], [26], [30] Gần đây, do những hạn chế, mô hình ngăn ít khi còn được

sử dụng mà chủ yếu đều áp dụng phương pháp không dựa trên mô hình ngăn [34], [37]

 Aldana (1992) sử dụng mô hình ngăn để nghiên cứu dược động học của thiamphenicol trên mắt thỏ với lựa chọn 1 ngăn duy nhất là tiền phòng Kết quả cho thấy thiamphenicol đạt đỉnh 110 ng/mL sau 45 phút nhỏ thuốc [12]

 Oh (1995) cũng dùng mô hình ngăn để nghiên cứu dược động học của cyclosporin nhưng chia mắt thỏ thành tới 6 ngăn: tiền phòng, giác mạc, thể mi, thủy tinh thể, màng cứng và kết mạc Kết quả cho thấy dược chất nhanh chóng

bị đào thải khỏi tiền phòng nhưng thuốc vẫn còn tồn tại rất lâu trong các mô của mắt, kéo dài tới 48 giờ đặc biệt là ở giác mạc và thể mi [30]

 Trong nghiên cứu dược động học của ketanserin (2000), Schoenwald sử dụng

mô hình không ngăn và các phần mềm tính toán để nghiên cứu đã xác định được thể tích phân bố của chất này ở trạng thái cân bằng là 0,972 mL lớn hơn thể tích thực của tiền phòng là 0,311 mL Điều này cho thấy, ketanserin không chỉ được phân bố ở tiền phòng mà còn vào rất nhiều mô và tổ chức khác trong mắt [34]

Qua các nghiên cứu trên có thể nhận thấy, nếu sử dụng mô hình ngăn thì cần phải thiết kế mô hình nhiều ngăn mới có thể phản ánh được đúng bản chất của quá trình phân bố và bài xuất của thuốc trong mắt Tuy nhiên điều này rất khó thực hiện bởi mắt là tổ chức có kích thước nhỏ, không đơn giản để có thể bóc tách và định lượng dược chất ở từng bộ phận Hơn nữa, chia làm nhiều ngăn sẽ khiến việc tính toán trở nên vô cùng phức tạp Mô hình không ngăn rõ ràng là chiếm ưu thế hơn bởi cách tiếp cận đơn giản, xử lý kết quả dễ dàng Chính vì vậy, đây cũng là mô hình được lựa chọn để bước đầu đánh giá sinh khả dụng của NTN nhỏ mắt diclofenac

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên liệu, thiết bị, động vật thí nghiệm

2.1.1 Nguyên liệu

Bảng 2.1 Nguyên liệu sử dụng

1 Acid diclofenac Trung Quốc Nhà sản xuất

2 Isopropyl myristat Singapore Nhà sản xuất

4 Transcutol HP Pháp Nhà sản xuất

5 Span 80 Singapore Nhà sản xuất

6 Cremophor RH40 Pháp Nhà sản xuất

7 Tween 80 Singapore Nhà sản xuất

8 Glycerin Trung Quốc Nhà sản xuất

9 Acid boric Trung Quốc Nhà sản xuất

10 Natri hydroxyd Trung Quốc Nhà sản xuất

11 Natri diclofenac Trung Quốc Nhà sản xuất

12 Dinatri edetat Trung Quốc Nhà sản xuất

13 Natri clorid Trung Quốc Nhà sản xuất

14 Benzalkonium clorid Trung Quốc Nhà sản xuất

15 Acid phosphoric Merck Dùng cho HPLC

16 Dinatri hydrophosphat Trung Quốc Nhà sản xuất

17 Methanol Baker Dùng cho HPLC

18 Nước cất Việt Nam DĐVN IV

2.1.2 Thiết bị

 Thiết bị lọc nén Sartorius SM 16249 (Đức); màng lọc cellulose acetat, kích thước lỗ lọc 0,2 µm; 0,45 µm

 Máy đo pH Eutech Instruments pH 510

 Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Agilent 1260 Infinite (Mỹ)

 Bể siêu âm Ultrasonic LC_60H

 Máy siêu âm cầm tay Labsonic®M –Sartorius (Đức)

 Máy ly tâm lạnh Universal 320R (Anh)

 Máy lắc xoáy Vortex

 Máy lọc nước PURELAB Classic UV, ELGA (Anh)

 Cân phân tích, cân kỹ thuật, các dụng cụ thủy tinh khác…

2.1.3 Động vật thí nghiệm

 Động vật thí nghiệm được lựa chọn là thỏ đực, cân nặng khoảng 2,5 – 3,0 kg, được nuôi dưỡng trong điều kiện thí nghiệm với chế độ ăn uống đầy đủ và được kiểm soát

2.2 Nội dung nghiên cứu

 Xây dựng và thẩm định phương pháp HPLC để định lượng diclofenac trong dịch tiền phòng của mắt thỏ

 Bước đầu đánh giá sinh khả dụng của nhũ tương nano nhỏ mắt diclofenac trên mắt thỏ

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp bào chế nhũ tương nano nhỏ mắt diclofenac

Dựa trên các kết quả nghiên cứu đã thực hiện [7], [8], [9], [10] công thức chứa acid diclofenac được lựa chọn do tỉ lệ nhũ hóa cao hơn dạng muối, isopropyl myristat làm pha dầu bởi không chỉ làm dung môi hòa tan tốt AD mà còn có khả năng làm tăng tính

thấm Tỉ lệ các tá dược được lựa chọn theo mẫu có tỉ lệ giải phóng in vitro cao nhất

Phương pháp bào chế được sử dụng là siêu âm bởi phương pháp ĐNH phân cắt tốc độ cao tạo nhiều bọt khi bào chế mẫu, KTTP thay đổi không đáng kể so với siêu âm Phương pháp ĐNH áp suất cao tuy có giảm được KTTP nhưng tốn khí nitrogen, khó vệ sinh thiết bị và không cần thiết vì mục đích của nghiên cứu tiếp theo chỉ là tìm phương

pháp đánh giá sinh khả dụng in vivo và sơ bộ so sánh với một dạng dung dịch tự pha

Công thức

Acid diclofenac 0,093 g (≈ 0,1 g natri diclofenac) Isopropyl myristat 2,000 g

Transcutol HP 1,500 g Span 80 1,000 g Cremophor RH40 1,000 g Tween 80 1,000 g Glycerin 5,000 g Đệm borat 0,1M; pH 7,5 Nước cất pha tiêm vừa đủ 100 mL

Nhũ tương nano được bào chế bằng phương pháp siêu âm

 Bước 1: Hòa tan hoàn toàn dược chất vào pha dầu (isopropyl myristat, Span 80,

Transcutol HP), đun nóng lên 60 - 650C

 Bước 2: Hòa tan, đun nóng pha nước (nước cất, glycerin, Cremophor RH40,

Tween 80, hệ đệm) lên 65 - 700C

 Bước 3: Kết hợp hai pha Siêu âm 15 phút bằng máy siêu âm cầm tay

Labsonic®M –Sartorius (tần số 30000 Hz, biên độ 100 µm, siêu âm liên tục)

 Bước 4: Điều chỉnh pH về 7,5 bằng dung dịch natri hydroxyd 0,1 mol/L Thêm

nước vừa đủ thể tích

 Bước 5: Tiệt khuẩn: lọc qua màng cellulose acetat 0,2 µm

 Bước 6: Đóng gói vào bao bì đã xử lý, dán nhãn, hoàn chỉnh thành phẩm

2.3.2 Phương pháp bào chế dung dịch nhỏ mắt diclofenac so sánh

Dạng dung dịch được pha theo công thức bào chế dung dịch nhỏ mắt diclofenac tham khảo trong Thực tập bào chế [2]