CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.5. Đánh giá sinh khả dụng và các thông số dược động học
Chuẩn bị
Nhũ tương nano nhỏ mắt acid diclofenac 0,093% theo quy trình ở mục 2.3.1.
Dung dịch nhỏ mắt natri diclofenac 0,1% theo quy trình ở mục 2.3.2.
Một lô gồm 12 con thỏ, trọng lượng tương đối bằng nhau khoảng 2,5 – 3,0 kg.
Nhỏ thuốc Với mỗi con thỏ:
Lần lượt nhỏ vào mắt trái 1 giọt nhũ tương nano, nhỏ vào mắt phải 1 giọt dung dịch (pha theo công thức và quy trình ở mục 2.3.1 và 2.3.2).
Ghi lại thời điểm nhỏ thuốc.
Ghi lại khối lượng mỗi chế phẩm nhỏ vào mắt thỏ (bằng hiệu khối lượng của lọ đựng chế phẩm trước và sau khi nhỏ) để tính toán hệ số quy đổi theo mục 2.3.5.2.b.
Lấy mẫu
Mỗi con thỏ chỉ được lấy mẫu 1 lần tại một thời điểm nhất định.
12 thời điểm lựa chọn tương ứng với 12 con thỏ lần lượt là 10, 20, 30, 40, 50, 60, 75, 90, 105, 120, 150 và 180 phút.
Trước thời điểm lấy mẫu khoảng 2 phút, gây mê thỏ bằng cloroform.
Tại thời điểm lấy mẫu, dùng kim tiêm đường kính 30 gauge đâm xuyên qua giác mạc, hỳt lấy khoảng 100 àL dịch tiền phũng.
Xử lý mẫu và phân tích
Vì nồng độ AD trong dịch tiền phòng quá thấp nên phải thêm chuẩn để AD trong mẫu đạt nồng độ trong khoảng tuyến tính đã khảo sát.
Cân chính xác khoảng 0,02 g acid diclofenac vào bình định mức 10 mL, thêm methanol, lắc đều cho tan. Bổ sung methanol vừa đủ đến vạch.
Pha loãng 1000 lần bằng methanol để thu được nồng độ 2000 ng/mL.
Trộn đồng lượng dịch tiền phòng thu được và dung dịch ở trên bằng máy lắc xoáy vortex trong 2 phút.
Ly tâm với tốc độ 12000 vòng/phút trong 10 phút. Lấy dịch trong.
Phân tích các mẫu bằng phương pháp HPLC theo quy trình ở mục 2.3.3.
Tiến hành lặp lại các thí nghiệm trên 3 lần.
2.3.5.2. Tính toán và xử lý số liệu sau thí nghiệm
a- Xác định nồng độ thực của diclofenac trong dịch tiền phòng Nồng độ diclofenac của mẫu sau xử lý là:
࢞ = ࡿ࢚
ࡿࢉ ∙ ࢉ∙
Trong đó:
Cxl: Nồng độ diclofenac trong mẫu xử lý (ng/mL) mc: Khối lượng acid diclofenac pha chuẩn (mg) St: Diện tích peak của mẫu xử lý (mAU.s) Sc: Diện tích peak của mẫu chuẩn (mAU.s) Nồng độ thực của diclofenac trong dịch tiền phòng là:
࢚ࢎựࢉ = . ࢞− ࢉ .
Cthực: Nồng độ thực của diclofenac trong dịch tiền phòng (ng/mL) b- Xác định hệ số quy đổi
Công thức pha chế cho nhũ tương nano acid diclofenac 0,093% và dung dịch natri diclofenac 0,1% đã đảm bảo rằng với cùng một thể tích, hai dạng bào chế đều có số mol dược chất tương tự nhau. Tuy nhiên, không giống như các dạng bào chế khác như dùng theo đường tiêm hay đường uống có khả năng phân liều chính xác, thuốc nhỏ mắt chỉ có thể phân liều tương đối theo “giọt”.
Vì vậy để khách quan và chính xác, cần phải quy đổi về cùng một thể tích nhỏ thuốc bằng hệ số quy đổi, sau đó mới tiến hành so sánh nồng độ thuốc trong dịch tiền phòng giữa dạng nhũ tương nano và dạng dung dịch.
Hệ số quy đổi:
= ࢂ࢛࢟ đổ
ࢂࢎỏ
Thể tích nhỏ (Vnhỏ) được xác định bằng khối lượng nhỏ và khối lượng riêng của dạng bào chế qua phương pháp dưới đây.
Xác định khối lượng riêng của các dạng thuốc.
Dạng nhũ tương nano:
- Bình định mức 10 mL rửa sạch, sấy khô.
- Cân chính xác khối lượng bình khô.
- Thêm nhũ tương nano vừa đủ đến vạch.
- Cân chính xác lại khối lượng bình sau khi thêm nhũ tương nano.
ࡰࢇ = ࢙ࢇ࢛ ࢚ࢎê− ࢚࢘ướࢉ ࢚ࢎê
Dnano: khối lượng riêng của dạng nhũ tương nano (mg/mL).
- Lặp lại các bước như trên 3 lần, lấy kết quả trung bình.
Dạng dung dịch:
- Tiến hành tương tự như trên.
Xác định thể tích nhỏ của từng dạng thuốc đã nhỏ vào mắt thỏ.
Nếu gọi:
mnhỏ là khối lượng thuốc đã nhỏ.
- Thể tích đã nhỏ của dạng nhũ tương nano là:
ࢂࢎỏ ࢇ = ࢎỏ
ࡰࢇ (ࡸ) - Thể tích đã nhỏ của dạng dung dịch là:
ࢂࢎỏ ࢊࢊ = ࢎỏ
ࡰࢊࢊ (ࡸ)
c- So sánh nồng độ thuốc trong dịch tiền phòng giữa dạng nhũ tương nano và dạng dung dịch.
Thể tích quy đổi được lựa chọn để so sánh là 0,05 mL (chứa ≈ 46500 ng acid diclofenac).
Thể tích này tương ứng gần đúng với chỉ định cho mỗi lần nhỏ thuốc của các chế phẩm nhỏ mắt chứa diclofenac hiện nay (mỗi lần nhỏ 1 giọt).
Nồng độ dược chất trong dịch tiền phòng khi nhỏ đúng 0,05 mL là:
, = ࢚ࢎựࢉ × = ࢎỏ
ࢂࢎỏ × ,
Trong đó:
C0,05: nồng độ dược chất trong dịch tiền phòng khi nhỏ 0,05 mL (ng/mL).
Cthực: nồng độ dược chất phân tích được khi nhỏ Vnhỏ mL thuốc (ng/mL).
Vnhỏ : thể tích nhỏ thuốc (mL).
2.3.5.3. Xây dựng đường biểu diễn mức độ giải phóng in vivo của nhũ tương nano so với dung dịch và khảo sát một vài thông số dược động học
Lập bảng kết quả trung bình nồng độ dược chất – thời gian của hai dạng thuốc qua ba lần thử.
Sử dụng phần mềm Kinbes, lựa chọn phương pháp giải tích chập số (numerical deconvolution) và tối ưu hóa thông qua tái tích chập theo phép bình phương tối thiểu có trọng số (WLS Reconvolution) tính toán mức độ giải phóng in vivo của thuốc thử (dạng NTN) so với thuốc đối chiếu (dạng dung dịch).
Sử dụng phần mềm Phoenix WinNolin 6.3, lựa chọn phương pháp không dựa trên mô hình ngăn tính toán các thông số sau:
λz : độ dốc của đường thẳng biểu diễn logarit nồng độ dược chất theo thời gian tại các điểm lấy mẫu cuối cùng của pha thải trừ.
Cmax: Nồng độ AD cực đại trong dịch tiền phòng.
tmax: thời gian để AD đạt nồng độ cực đại trong dịch tiền phòng.
AUC0-180: Diện tích dưới đường cong nồng độ - thời gian từ 0 tới 180 phút - thời điểm lấy mẫu cuối cùng
AUC0-∞: Diện tích dưới đường cong nồng độ - thời gian từ 0 tới ∞.
MRT: Thời gian lưu trung bình của thuốc trong dịch tiền phòng.