NGHIÊN cứu ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP sắc ký để PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN ALKALOID, FLAVONOID của lá, tâm SEN và các CHẾ PHẨM (TT)

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH ĐỖ CHÂU MINH VĨNH THỌ NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ ĐỂ PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN ALKALOID, FLAVONOID CỦA LÁ, TÂM SEN VÀ CÁC CHẾ PHẨM Chuyên n

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

ĐỖ CHÂU MINH VĨNH THỌ

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ

ĐỂ PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN ALKALOID, FLAVONOID

CỦA LÁ, TÂM SEN VÀ CÁC CHẾ PHẨM

Chuyên ngành: KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT

Mã số: 62720410

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC

Thành phố Hồ Chí Minh- Năm 2015

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

Người hướng dẫn khoa học :

1 PGS.TS TRẦN HÙNG

2 PGS.TS NGUYỄN ĐỨC TUẤN

Phản biện 1: PGS.TS Trịnh Văn Quỳ

Hội Đồng Dược Điển Việt Nam

Phản biện 2: PGS.TS Trần Việt Hùng

Viện Kiểm Nghiệm Thuốc Trung Ương

Phản biện 3: PGS.TS Hoàng Minh Châu

Đại Học Y-Dược TP.HCM

Luận án được bảo vệ tại hội đồng chấm luận án cấp Trường Họp tại :……… Vào lúc :……giờ………ngày…….tháng…….năm………

Có thể tìm hiểu luận án tại :

- Thư viện Quốc gia Việt Nam

- Thư viện Khoa học Tổng hợp TP Hồ Chí Minh

- Thư viện Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh

1 Đỗ Châu Minh Vĩnh Thọ, Nguyễn Đức Tuấn, Trần Hùng (2011), “Nghiên cứu thành phần

alkaloid trong tâm sen (Nelumbo nucifera Gaertn Nelumbonaceae)”, Tạp chí Y học Tp.HCM,

Tập 15 phụ bản của số 1, 2011, 606 - 611

2 Đỗ Châu Minh Vĩnh Thọ, Nguyễn Đức Tuấn, Trần Hùng (2011), “Xây dựng qui trình định

lượng neferin trong cao chiết alkaloid toàn phần từ tâm sen (Nelumbo nucifera Gaertn

Nelumbonaceae) bằng HPLC với đầu dò dãy diod quang”, Tạp chí Y học Tp.HCM, Tập 15 phụ

bản của số 1, 2011, 628 - 632

3 Đỗ Châu Minh Vĩnh Thọ, Lữ Thiện Phúc, Mạch Khắc Duy (2012), “Xây dựng qui trình định

lượng, định tính điểm chỉ một số alkaloid chính có trong tâm sen Việt Nam (Nelumbo nucifera

Gaertn) bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao với đầu dò dãy diod quang”, Tạp chí Y học thực

hành, số 852+853, 303-307

4 Đỗ Châu Minh Vĩnh Thọ, Nguyễn Thị Tường Vi, Nguyễn Thị Phương Cúc (2012), “Xây dựng

qui trình chiết cao chuẩn alkaloid lá sen (Nelumbo nucifera Gaertn)” Tạp chí Y học thực hành,

số 852+853, 315-319

5 Đỗ Châu Minh Vĩnh Thọ, Nguyễn Thị Xuân Thương, Trần Hùng, Nguyễn Đức Tuấn (2012),

“Xây dựng quy trình định lượng đồng thời quercetin, kaempferol, catechin và quercetin

O-β-D-glucuronid trong lá sen bằng phương pháp HPLC với đầu dò PDA”, Tạp chí Dược học số

3-2012, 17-21

6 Do Chau Minh Vinh Tho, Nguyen Duc Tuan, Tran Hung, Markus Ganzera, Hermann Stuppner

(2012), “Quantitative determination of phenolic compounds in Lotus (Nelumbo nucifera) leaves

by capillary zone electrophoresis”, Planta Medica, 78, 1796-1799

7 Do Chau Minh Vinh Tho, Nguyen Duc Tuan, Tran Hung, Markus Ganzera, Hermann Stuppner

(2013), “Analysis of alkaloids in Lotus (Nelumbo nucifera) leaves by non aqueous capillary

electrophoresis using ultraviolett and mass spectrometric detection”, Journal of

Chromatography A, 1302, 174-180

8 Đỗ Châu Minh Vĩnh Thọ, Tô Yến Ngọc, Trần Hùng, Nguyễn Đức Tuấn (2013), “Xây dựng quy

trình định lượng đồng thời nuciferin, pronuciferin, o-nornuciferin và isoliensinin trong lá sen

bằng phương pháp HPLC với đầu dò PDA”, Tạp chí Dược học số 5-2013, 27-31

9 Do Chau Minh Vinh Tho, Nguyen Duc Tuan, Tran Hung, Markus Ganzera, Hermann Stuppner

(2013), “Analysis of alkaloids in lotus (nelumbo nucifera gaertn.) embryo by non-aqueous

capillary electrophoresis using ultraviolet and mass spectrometric detection”, Proceeding of the

eighth Indochina Conference on Pharmaceutical Sciences, Ho Chi Minh city, Vietnam,

December 4-5, 2013, 316-321

10 Đỗ Châu Minh Vĩnh Thọ, Huỳnh Phương Thảo, Trần Hùng (2014) “Nghiên cứu phân lập các

alkaloid có tác dụng sinh học trong lá sen (Nelumbo nucifera Gaertn.)” Tạp chí Y học

thực hành, số 944-2014, 49-52.

GIỚI THIỆU LUẬN ÁN

1 Đặt vấn đề

Cây Sen (Nelumbo nucifera Gaertn Nelumbonaceae) là

cây thuốc quí, có giá trị sinh cao, đang được sử dụng phổ biến dưới dạng thuốc hay thực phẩm chức năng để điều trị mất ngủ, cao huyết áp, giảm cân, điều hòa đường huyết, Các hoạt tính sinh học

này đã được chứng minh liên quan đến sự hiện diện của thành phần

alkaloid và flavonoid có trong lá, tâm Sen

Trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu về thành phần

hóa học, tác dụng sinh học của lá và tâm Sen Tuy nhiên, các nghiên cứu về lĩnh vực kiểm nghiệm còn nhiều hạn chế mà nguyên

nhân chủ yếu là do hai thành phần có tác dụng sinh học chính trong lá,

tâm Sen là alkaloid và flavonoid vẫn chưa được nghiên cứu và

công bố toàn diện; chưa có công trình khoa học nào khẳng định chất

đánh dấu trong nguyên liệu và hoàn toàn chưa có chất đối chiếu

có nguồn gốc từ dược liệu này được phân phối trên thị trường

Do đó, việc nghiên cứu về thành phần alkaloid và flavonoid,

phân lập và thiết lập các chất đối chiếu phục vụ cho việc định tính,

định lượng alkaloid, flavonoid có tác dụng sinh học trong lá, tâm Sen

Nhằm nâng cao tiêu chuẩn chất lượng của một dược liệu đang được

sử dụng rộng rãi, cũng như ứng dụng trong công tác đảm bảo

chất lượng dược liệu và các chế phẩm từ Sen là một việc làm cấp thiết

Với những lý do trên, đề tài “Nghiên cứu ứng dụng các phương

pháp sắc ký để phân tích thành phần alkaloid, flavonoid của lá, tâm

Sen và các chế phẩm” được thực hiện với các nội dung nghiên cứu sau:

1 Chiết xuất, phân lập, xác định cấu trúc các alkaloid, flavonoid từ

lá và tâm Sen bằng phương pháp sắc ký và phổ nghiệm

2 Thiết lập và xây dựng tiêu chuẩn một số alkaloid, flavonoid có tác

dụng sinh học để dùng làm chất đối chiếu phục vụ cho công tác

kiểm nghiệm

3 Xây dựng các qui trình định tính điểm chỉ, định lượng đồng thời

một số alkaloid, flavonoid chính có trong lá, tâm Sen bằng phương

pháp HPLC và CE

4 Áp dụng qui trình để đánh giá thành phần, hàm lượng các alkaloid

và flavonoid trong lá, tâm Sen được thu hái từ các tỉnh, thành khác

nhau và trong chế phẩm từ Sen có trên thị trường

2 Tính cấp thiết của đề tài:

Lá và tâm Sen (Nelumbo nucifera Gaertn., Nelumbonaceae)

đã và đang được sử dụng rất phổ biến trên thị trường dưới dạng thuốc,

thực phẩm chức năng để điều trị hoặc hỗ trợ điều trị trong các bệnh lý

khó ngủ, béo phì, mỡ máu cao, cao huyết áp, loạn nhịp tim…

Tuy nhiên, công tác đảm bảo chất lượng cho nguồn nguyên liệu

và các chế phẩm này hiện vẫn chưa được thực hiện chặt chẽ mà nguyên

nhân là do các nghiên cứu toàn diện, chi tiết về hai thành phần chính

alkaloid, flavonoid còn rất hạn chế cũng như việc kiểm soát chất lượng

nguồn nguyên liệu thông qua việc định tính, định lượng các thành phần

đánh dấu sinh học này hầu như chưa được thực hiện vì sự khan hiếm

các chất đối chiếu từ dược liệu này Do đó, việc nghiên cứu chiết xuất,

phân lập, xác định cấu trúc các nhóm alkaloid, flavonoid có tác dụng sinh học trong lá, tâm Sen nhằm thiết lập các chất đối chiếu ứng dụng

cho việc nâng cao tiêu chuẩn chất lượng của dược liệu Sen và các chế

phẩm từ Sen là rất cần thiết, có ý nghĩa khoa học và có giá trị thực tiễn

3 Những đóng góp mới của luận án:

Luận án đã đạt được một số kết quả mới, đóng góp vào công trình

nghiên cứu cho cây Sen như sau:

3.1 Thành phần hóa học

Phân lập được 35 hợp chất (21 alkaloid và 14 flavonoid) với 28

cấu trúc được xác định từ lá và tâm Sen Trong đó có:

- 02 alkaloid là hợp chất mới (EN-4 và EN-5), lần đầu tiên được

công bố phân lập từ thực vật, cấu trúc đã xác định và được đề nghị

đặt tên là isoliensinin N 2’ -oxyd và isoliensinin N 2 -oxyd

- 05 hợp chất đã được công bố có trong những dược liệu khác nhưng

lần đầu tiên được phân lập từ cây Sen: 02 alkaloid (pronuciferin

N-oxyd và apoglaziovin); 03 flavonoid (calycosin, scutellarein

7-O-β-D-GlcA methyl ester, vitexin)

- 02 alkaloid lần đầu tiên được phân lập từ lá Sen (isoliensinin,

norarmepavin); 03 alkaloid (nuciferin, armepavin, norarmepavin)

và 03 flavonoid (isorhamnetin, quercitrin, quercetin

3-O-β-D-GlcA) lần đầu tiên được công bố từ tâm Sen

3.2 Thiết lập chất đối chiếu

Thiết lập 06 chất đối chiếu (nuciferin, o-nornuciferin, liensinin,

isoliensinin, neferin, quercetin 3-O-β-D-GlcA) Hiện tại, các CĐC này

đều chưa được phân phối bởi hệ thống kiểm nghiệm thuốc quốc gia

3.3 Quy trình định tính điểm chỉ, định lượng đồng thời các

alcaloid, flavonoid có trong lá, tâm Sen

Xây dựng và thẩm định đạt yêu cầu 08 quy trình phân tích đồng thời các alkaloid hay flavonoid bằng phương pháp HPLC-PDA

và CE-PDA-MS Các quy trình này đều chưa được công bố bởi bất cứ

công trình nào trong nước và thế giới

Các qui trình định tính, định lượng sau khi thẩm định đã được áp

dụng để kiểm soát chất lượng 32 mẫu nguyên liệu lá Sen và 32 mẫu

nguyên liệu tâm Sen (Nelumbo nucifera) được thu hái vào mùa thu hái

khác nhau từ ba vùng miền khác nhau của Việt Nam cũng như các chế

phẩm bào chế từ lá, tâm Sen đang lưu hành trên thị trường

Xây dựng được các sắc ký đồ, điện di đồ dấu vân tay bằng phương

pháp SKLM, HPLC-PDA, CE-PDA/MS giúp xác định đặc tính điểm

chỉ, nhận dạng lá, tâm Sen của từng vùng miền tại Việt Nam

4 Bố cục luận án: có 131 trang chính: Đặt vấn đề (2); chương 1:

Tổng quan tài liệu (24); chương 2: Phương pháp nghiên cứu (22);

chương 3: Kết quả nghiên cứu (62), chương 4: Bàn luận (23); kết luận

(3); kiến nghị (1) Danh mục công trình (2); Tài liệu tham khảo (9)

NỘI DUNG LUẬN ÁN

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Thực vật học cây TNHC

Tên khoa học: Nelumbo nucifera Gaertn, họ Sen - Nelumbonaceae

1.2 Hóa học về Sen

Có 15 alkaloid, 16 flavonoid trong lá Sen và 12 alkaloid, 4 flavonoid

trong tâm Sen đã được công bố Các alkaloid này thuộc các khung

aporphin, proaporphin, benzylisoquinolin và bisbenzylisoquinolin

Các flavonoid có khung euflavonoid và thuộc nhóm flavonol

Các nghiên cứu về chiết xuất- phân lập- xác định cấu trúc

- Các alkaloid, flavonoid trong lá, tâm Sen được chiết bằng phương

pháp: ngâm lạnh, ngấm kiệt, chiết hỗ trợ vi sóng, chiết siêu tới hạn

- Các hợp chất tinh khiết được phân lập bằng các phương pháp sắc

ký: sắc ký pha thuận, rây phân tử, sắc ký ngược dòng tốc độ cao

- Cấu trúc các hợp chất phân lập được biện giải bằng các phép phổ nghiệm: UV, IR, MS, NMR

Các nghiên cứu về định tính, định lượng Thành phần alkaloid,

flavonoid trong lá và tâm Sen: sử dụng các phương pháp

HPLC-PDA-MS/MS và CE-PDA

1.3 Tác dụng sinh học

Các tác dụng chính là an thần, hạ cholesterol, hạ đường huyết, hạ huyết

áp, loạn nhịp tim, kháng khuẩn, kháng viêm, chống oxi hóa và

kích thích miễn dịch

1.4 Phương pháp thiết lập chất đối chiếu: hướng dẫn của ASEAN

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu: đối tượng nghiên cứu là các alkaloid và

flavonoid trong lá, tâm Sen

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Các phương pháp chiết xuất: Chiết ngâm lạnh, chiết với sự hỗ

trợ của sóng siêu âm: nghiên cứu các điều kiện dung môi,

tỷ lệ dung môi/dược liệu

2.2.2 Phương pháp phân lập, xác định độ tinh khiết, cấu trúc hợp chất

tinh khiết: Sử dụng phương pháp sắc ký cột pha thuận, pha đảo

Sephadex LH-20, sắc ký lỏng bán điều chế, sắc ký phân bố

ly tâm nhanh Xác định độ tinh khiết bằng phương pháp SKLM,

HPLC/PDA, quét nhiệt vi sai Biện giải cấu trúc bằng phép phổ nghiệm:

UV, IR, MS, NMR

2.2.3 Qui trình định tính, định lượng các alkaloid, flavonoid bằng

phương pháp HPLC, CE

Qui trình định lượng: phải đạt các yêu cầu về thẩm định theo

hướng dẫn của ICH

- Quy trình xử lý mẫu: khảo sát quy trình chiết alcaloid và flavonoid

từ lá, tâm Sen (dung môi chiết, số lần chiết) và dung môi pha mẫu

- Phương pháp HPLC: khảo sát thành phần pha động, tỷ lệ và pH pha

động, kỹ thuật rửa giải

- Phương pháp CE: kỹ thuật điện di, dung dịch đệm (hệ đệm, nồng độ

đệm, pH dung dịch đệm ); loại chất diện hoạt, nồng độ chất

diện hoạt; điều kiện của đầu dò: bước sóng phân tích với đầu dò

PDA; kiểu ion hóa, áp suất khí bao, nhiệt độ buồng ion hóa, thế áp

dụng, chất lỏng bao với đầu dò MS

Định tính điểm chỉ:

Phương pháp SKLM: khảo sát dung môi để xác định các đặc trưng cơ

bản của hai nhóm hoạt chất chính alcaloid và flavonoid của lá, tâm Sen

qua hệ số Rf và màu sắc của các vết đặc trưng

Phương pháp HPLC và CE: dựa trên sắc ký đồ (SKĐ), điện di đồ

(ĐDĐ) xác định thời gian lưu (tR-HPLC) hay thời gian dịch chuyển (tM-CE) và diện tích đỉnh của các pic chính cũng như tỷ lệ diện tích pic

giữa các pic chính của alkaloid và flavonoid trong mẫu nguyên liệu

2.2.4 Phương pháp thiết lập CĐC: Thực hiện theo hướng dẫn của

WHO, ASEAN, ấn bản về quy trình thiết lập CĐC

2.2.5 Ứng dụng qui trình định tính, định lượng

Đánh giá đặc tính điểm chỉ và hàm lượng các alkaloid và flavonoid có

trong nguyên liệu lá, tâm Sen được thu hái từ những vùng thu hái khác

nhau về thổ nhưỡng, khí hậu và các chế phẩm thuốc hay thực phẩm

chức năng được bào chế từ hai nguyên liệu này

Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1 Chiết cao chiết toàn phần alkaloid, flavonoid từ lá và tâm Sen

Chiết cao cồn: dược liệu được làm ẩm bằng dung môi khoảng 6 giờ

Cho dung môi ngập dược liệu 1- 2 cm, ngâm khoảng 48 giờ Rút dịch

chiết đến khi âm tính với thuốc thử (TT) Dragendorff và FeCl3 1% Tỷ

lệ dung môi/dược liệu là (10:1) Gộp dịch chiết, lọc và cô đến cao đặc

Chiết flavonoid: cao cồn được acid hóa bằng H2SO4 2% đến pH 1-2

Loại tạp bằng n-hexan, sau đó lắc với ethyl acetat đến khi âm tính với

TT FeCl3 1% Gộp các dịch chiết ethyl acetat, thu hồi dung môi đến

cao đặc chứa flavonoid tủa F từ lá Sen và cao EF từ tâm Sen

Chiết alcaloid: dịch acid sau khi chiết flavonoid được kiềm hóa bằng

amoniac 25% theo gradient pH Lắc với cloroform đến khi âm tính với

TT Dragendorff, thu hồi dung môi đến cao đặc chứa alkaloid A1, A2,

A3 từ lá Sen và NP5, NP8, P và n-Bu từ tâm Sen tương ứng

Từ tủa B thu được trong quá trình thu hồi dung môi để thu cao cồn

được acid hóa bằng H2SO4 2% và cho phản ứng đặc hiệu với TT Bertrand, tủa thu được rửa loại tạp lần lượt với CHCl3, EtOAc, sau đó hòa trong NaOH 2% và chiết bằng CHCl3 để thu cao N

3.2 Phân lập các hợp chất tinh khiết từ cao chiết lá, tâm Sen

Cao A2 và tủa F được tách phân đoạn bằng sắc ký cột chân không;

cao A3, cao N, NP5, NP8, EF được tách phân đoạn bằng cột pha thuận

Các phân đoạn tinh khiết hơn thu được này được tiếp tục phân lập bằng sắc ký cột Sephadex LH-20, sắc ký lỏng bán điều chế pha đảo, sắc ký phân bố ly tâm nhanh để phân lập được 35 hợp chất với 28 cấu trúc được biện giải và so sánh các dữ liệu phổ nghiệm UV, IR, MS, NMR với các tài liệu đã công bố như đã trình bày ở mục 3 Cấu trúc hóa học

và độ dịch chuyển hóa học của C, H của 16 alkaloid và 12 flavonoid phân lập từ lá, tâm Sen được trình bày ở các Hình 3.7-3.15

3.3 Thiết lập chất đối chiếu (CĐC)

3.3.1 Xây dựng qui trình xác định độ tinh khiết của nguyên liệu thiết lập CĐC

Các alkaloid, flavonoid được lựa chọn để thiết lập CĐC là những

hợp chất đại diện, chiếm hàm lượng lớn trong cây, khối lượng phân lập

được nhiều (> 500 mg) với độ tinh khiết sắc ký cao (> 95%) để thiết

lập CĐC 06 nguyên liệu được chọn để thiết lập CĐC: nuciferin,

2-O-nornuciferin, isoliensinin, liensinin, neferin, quercetin 3-O-β-D-GlcA

Bảng 3.49 Kết quả khảo sát hàm ẩm bằng phương pháp TGA và

điểm nóng chảy, độ tinh khiết bằng phương pháp DSC (n=3)

Xác định độ tinh khiết bằng HPLC/PDA

Dựa trên cấu trúc hóa học của các hợp chất nghiên cứu, khảo sát các

thông số: bản chất pha tĩnh, pha động, pH, nhiệt độ, tốc độ dòng, bước

sóng phát hiện, nhằm tìm ra các điều kiện sắc ký thích hợp xác định độ

tinh khiết sắc ký các mẫu nguyên liệu thiết lập chất đối chiếu

Bảng 3.50 Tóm tắt điều kiện sắc ký thích hợp kiểm tra độ tinh khiết

HPLC-PDA của 06 CĐC

ACN-TEA 0,1%

Nhiệt độ cột ( o C)

λ (nm)

F (ml/phút) Nuciferin Gemini C18

(150 mm x 4,6; 5µm)

Quercetin 3-

O-β-D-glcA

ACN- acid formic 0,1 % (20:80)

Xác định tính phù hợp hệ thống: các thông số sắc ký đều đạt yêu cầu

qui định sau 06 lần tiêm liên tiếp, quy trình đạt tính phù hợp hệ thống

Thẩm định quy trình xác định độ tinh khiết sắc ký các nguyên liệu

làm CĐC bằng HPLC

Tính đặc hiệu: SKĐ mẫu trắng không có tín hiệu tại vị trí thời gian lưu

của pic chính trên SKĐ mẫu thử CĐC

Bảng 3.52 Kết quả xác định tính tuyến tính, miền giá trị, độ đúng,

độ chính xác của qui trình phân tích các nguyên liệu thiết lập CĐC

99,8- 102,8

98,3- 103,5

97,6- 102,2

98,8- 103,4

*: Tỉ lệ hồi phục trung bình (%) (1) : nuciferin; (2): 2-O-nornuciferin; (3) : isoliensinin (4) :

liensinin; (5) : neferin; (6) : quercetin-3-O-D-GlcA

Nhận xét: Quy trình xác định độ tinh khiết 06 nguyên liệu làm chất đối

chiếu bằng phương pháp HPLC có tính đặc hiệu, miền giá trị rộng,

độ chính xác và độ đúng cao Do đó có thể áp dụng quy trình này để

tiến hành xác định độ tinh khiết của các nguyên liệu thiết lập CĐC

Kiểm tra độ tinh khiết sắc ký 06 nguyên liệu thiết lập CĐC

Bảng 3.53 Kết quả xác định độ tinh khiết sắc ký (%) các nguyên liệu

thiết lập CĐC

HPLC/PDA

RSD (n=3)

Tạp (%)