LA20 023 nghiên cứu ứng dụng phương pháp sắc ký để phân tích thành phần alkaloid, flavonoid của lá, tâm sen và các chế phẩm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH ĐỖ CHÂU MINH VĨNH THỌ NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ ĐỂ PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN ALKALOID, FLAVONOID CỦA LÁ, TÂM SEN VÀ CÁC CHẾ PHẨM LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC TP Hồ Chí Minh – Năm 2015 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH ĐỖ CHÂU MINH VĨNH THỌ NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ ĐỂ PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN ALKALOID, FLAVONOID CỦA LÁ, TÂM SEN VÀ CÁC CHẾ PHẨM Chuyên ngành: KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT Mã số: 62.72.04.10 LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS TRẦN HÙNG PGS.TS NGUYỄN ĐỨC TUẤN TP Hồ Chí Minh – Năm 2015 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu Các số liệu kết trình bày luận án trung thực chưa công bố công trình khác Người cam đoan, Đỗ Châu Minh Vĩnh Thọ i MỤC LỤC TRANG PHỤ BÌA LỜI CAM ĐOAN MỤC LỤC i DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT iii DANH MỤC CÁC BẢNG v DANH MỤC CÁC HÌNH, BIỂU ĐỒ, SƠ ĐỒ viii MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Thực vật học Sen 1.2 Hóa học Sen 1.3 Chiết xuất- phân lập alkaloid, flavonoid tâm Sen 12 1.4 Các phương pháp phân tích thành phần alkaloid, flavonoid lá, tâm Sen 16 1.5 Tác dụng sinh học lá, tâm Sen 19 1.6 Công dụng Sen 21 1.7 Chất đối chiếu 22 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.1 Đối tượng nghiên cứu 25 2.2 Nguyên vật liệu – Dung môi, hóa chất, thuốc thử – Trang thiết bị 25 2.3 Địa điểm nghiên cứu 28 2.4 Phương pháp nghiên cứu 29 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 47 3.1 Chiết xuất, phân lập, xác định cấu trúc alkaloid, flavonoid từ tâm Sen 47 3.1.1 Phân tích sơ thành phần hóa học tâm Sen 47 3.1.2 Chiết cao chiết toàn phần alkaloid, flavonoid từ tâm Sen 48 3.1.3 Phân lập alkaloid, flavonoid từ tâm Sen 48 3.1.4 Xác định độ tinh khiết alkaloid, flavonoid phân lập từ tâm Sen 60 3.1.5 Xác định cấu trúc chất phân lập 61 3.2 Thiết lập số chất đối chiếu alkaloid, flavonoid phân lập từ lá, tâm Sen 80 ii 3.3 Xây dựng qui trình định tính điểm chỉ, định lượng đồng thời alkaloid, flavonoid có tâm Sen 85 3.4 Ứng dụng qui trình định tính, định lượng để phân tích alkaloid, flavonoid có mẫu nguyên liệu chế phẩm bào chế từ lá, tâm Sen 104 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 108 4.1 Chiết xuất, phân lập, xác định cấu trúc cấu trúc alkaloid, flavonoid phân lập từ tâm Sen 108 4.2 Qui trình định tính, định lượng đồng thời alkaloid, flavonoid có tâm Sen 117 4.3 Ứng dụng qui trình định tính, định lượng để phân tích alkaloid, flavonoid có mẫu nguyên liệu chế phẩm từ lá, tâm Sen 124 4.4 Đặc tính điểm tâm Sen 127 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC iii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ACN Acetonitrile ASEAN Association of Southeast Asian Nations (Hiệp hội quốc gia Đông Nam Á) CĐC Chất đối chiếu CE Capillary electrophoresis (Điện di mao quản) Corr Area Corrected Area (Diện tích pic chuẩn hóa) CTAB Cetyltrimethylammonium bromide CZE Capillary Zone Electrophoresis (Điện di mao quản vùng) d doublet (đỉnh đôi) DVT Dấu vân tay DĐVN IV Dược điển Việt Nam xuất lần thứ IV DEPT Distortionless Enhancement by Polarization Transfer DSC Differential Scanning Calorimetry (Quét nhiệt vi sai) DMSO Dimethylsulfoxide ĐDĐ Điện di đồ DTAB Dodecyltrimethylammonium bromide ESI Electrospray Ionization (Ion hóa phun mù electron) EOF Electro-osmotic flow (Dòng điện thẩm) FCPC Fast centrifugal partition chromatography (Sắc ký phân bố ly tâm nhanh) GLP Good Laboratory Practices (Thực hành tốt phòng kiểm nghiệm thuốc) HPLC High Performance Liquid Chromatography hiệu cao) HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation HSQC Heteronuclear Single Quantum Correlation ICH International Conference on Harmonization IR Infrared (Hồng ngoại) i-ProOH Isopropanol (Sắc ký lỏng iv J Coupling constant (Hằng số ghép) LC-MS Liquid Chromatography–Mass Spectrometry (Sắc ký lỏng ghép khối phổ) LDL Low density lipoprotein LOD Limit of detection LOQ Limit of quantitation MEKC Micellar Electrokinetic Chromatography (Sắc ký mixen điện động) MCF-7 Michigan Cancer Foundation-7 (Tế bào ung thư vú dòng MCF-7) MS Mass Spectrometry (Khối phổ) NACE Non aqueous capillary electrophoresis NMR Nuclear Magnetic Resonance (Cộng hưởng từ hạt nhân) PDA Photo Diode Array (Dãy diod quang) PE Petroleum ether (ether dầu hỏa) PCRS Primary Chemical Reference Standard (Chất đối chiếu hóa học sơ cấp) PTN Phòng thí nghiệm RSD Relative Standard Deviation (Độ lệch chuẩn tương đối) s singlet (Đỉnh đơn) SKĐ Sắc ký đồ SCRS Secondary Chemical Reference Standard (Chất đối chiếu hóa học thứ cấp) SDS Sodium Dodecyl Sulfate SFE Supercritical Fluid Extraction (Chiết bằng lưu chất siêu tới hạn) SKLM Sắc ký lớp mỏng TEA Triethylamin TGA Thermogravimetric Analysis (Phân tích nhiệt trọng lượng) THF Tetrahydrofuran TLTK Tài liệu tham khảo TT Thuốc thử UV-Vis Ultraviolet-Visible (Tử ngoại khả kiến) VLC Vacuum Liquid Chromatography (Sắc ký cột chân không) v DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Vị trí phân loại chi Nelumbo Bảng 1.2 Các alkaloid khung aporphin có Sen Bảng 1.3 Các alkaloid khung benzylisoquinolin có Sen Bảng 1.4 Các alkaloid khung benzylisoquinolin có tâm Sen 10 Bảng 1.5 Các alkaloid khung bisbenzylisoquinolin có tâm Sen 11 Bảng 1.6 Tóm tắt nghiên cứu phân lập alkaloid, flavonoid lá, tâm Sen 12 Bảng 1.7 Tóm tắt nghiên cứu định lượng alkaloid, flavonoid tâm Sen 16 Bảng 2.1 Nơi thu hái nguyên liệu tâm Sen loài Nelumbo nucifera G 26 Bảng 2.2 Nơi thu hái nguyên liệu Sen loài N Lutea Willd Victoria regia 26 Bảng 2.3 Các chế phẩm có chứa tâm Sen 26 Bảng 2.4 Khảo sát dung môi chiết alkaloid, flavonoid từ lá, tâm Sen 30 Bảng 2.5 Điều kiện tiến hành VLC phân đoạn A2 tủa F từ Sen 33 Bảng 2.6 Điều kiện tiến hành sắc ký cột cao A3, cao N Sen 34 Bảng 2.7 Điều kiện tiến hành sắc ký cột phân đoạn NP5, NP8, cao EF tâm Sen 34 Bảng 2.8 Điều kiện tiến hành sắc ký cột Sephadex LH-20 phân đoạn F1, F6, F8 35 Bảng 2.9 Các điều kiện dung môi hai pha không đồng tan dự kiến thăm dò cho FCPC phân đoạn P-2 36 Bảng 3.1 Kết chiết cắn toàn phần từ lá, tâm Sen 47 Bảng 3.2 Kết chiết alkaloid, flavonoid toàn phần từ lá, tâm Sen 47 Bảng 3.3 Tổng kết alkaloid, flavonoid tinh khiết phân lập từ Sen 48 Bảng 3.4 Kết sắc ký cột silica gel cao A2, Sen 50 Bảng 3.5 Kết thu hứng LN-1 từ phân đoạn A2-1 50 Bảng 3.6 Kết thu hứng LN-2, LN-8 từ phân đoạn A2-2 50 Bảng 3.7 Kết thu hứng LN-2, LN-3 từ phân đoạn A2-3 51 Bảng 3.8 Kết thu hứng LN-4 từ phân đoạn A2-8 51 Bảng 3.9 Kết thu hứng LN-6, LN-7 từ phân đoạn A2-6 51 Bảng 3.10 Kết thu hứng LN-5 từ phân đoạn A2-11 A2-12 52 Bảng 3.11 Kết sắc ký cột silica gel cao A3 Sen 52 vi Bảng 3.12 Kết sắc ký cột silica gel cao N Sen 52 Bảng 3.13 Kết sắc ký cột silica gel tủa F, Sen 53 Bảng 3.14 Kết sắc ký rây phân tử phân đoạn F1 53 Bảng 3.15 Kết sắc ký rây phân tử phân đoạn F-2,3 54 Bảng 3.16 Kết sắc ký rây phân tử phân đoạn F-7 54 Bảng 3.17 Kết thu hứng LF-2 LF-4 từ F7-3 54 Bảng 3.18 Kết sắc ký rây phân tử phân đoạn F8 54 Bảng 3.19 Tổng kết alkaloid, flavonoid tinh khiết phân lập từ Sen 55 Bảng 3.20 Kết sắc ký cột silica gel phân đoạn NP5, tâm Sen 57 Bảng 3.21 Kết sắc ký cột silica gel phân đoạn NP8, tâm Sen 57 Bảng 3.22 Kết sắc ký rây phân tử phân đoạn P 58 Bảng 3.23 Kết FCPC phân đoạn P-2 58 Bảng 3.24 Kết Sephadex LH-20 phân đoạn n-Bu 58 Bảng 3.25 Kết phân đoạn sau SPE từ n-Bu II 59 Bảng 3.26 Kết sắc ký cột silica gel cao EF, tâm Sen 59 Bảng 3.27 Kết sắc ký rây phân tử phân đoạn EF-8, tâm Sen 59 Bảng 3.28 Độ tinh khiết alkaloid, flavonoid phân lập từ tâm Sen 60 Bảng 3.29 Dữ liệu phổ UV, MS LN-1, LN-2, LN-3, LN-4 61 Bảng 3.30 Dữ liệu phổ 13C- NMR LN-1, LN-2, LN-3, LN-4 61 Bảng 3.31 Dữ liệu phổ 1H- NMR LN-1, LN-2, LN-3, LN-4 62 Bảng 3.32 Dữ liệu phổ 13C 1H-NMR LN-5 63 Bảng 3.33 Dữ liệu phổ UV, MS LN-8, LN-9 64 Bảng 3.34 Dữ liệu phổ 13C 1H- NMR LN-8, LN-9 64 Bảng 3.35 Dữ liệu phổ UV, IR, MS EN-1, EN-2, EN-3 65 Bảng 3.36 Dữ liệu phổ 13C 1H- NMR EN-1, EN-2, EN-3 66 Bảng 3.37 Dữ liệu phổ UV, IR, MS alkaloid EN-4, EN-5 67 Bảng 3.38 Dữ liệu phổ 1D 2D-NMR EN-4 67 Bảng 3.39 Dữ liệu phổ 1D 2D-NMR EN-5 69 Bảng 3.40 Dữ liệu phổ UV, IR, MS EN-6, EN-7, EN-8, EN-9 74 Bảng 3.41 Dữ liệu phổ 13C-NMR EN-6, EN-7, EN-8, EN-9 75 vii Bảng 3.42 Dữ liệu phổ 1H-NMR EN-6, EN-7, EN-8, EN-9 75 Bảng 3.43 Dữ liệu phổ UV, MS LF-1, LF-5, LF-6, LF-8, TF-1 76 Bảng 3.44 Dữ liệu phổ 13C-NMR LF-1, LF-5, LF-6, LF-8, TF-1 76 Bảng 3.45 Dữ liệu phổ 1H-NMR LF-1, LF-5, LF-6, LF-8, TF-1 77 Bảng 3.46 Dữ liệu phổ UV, MS LF-2, LF-3, LF-4, TF-5, TF-4, TF-3 78 Bảng 3.47 Dữ liệu phổ 13C-NMR LF-2, LF-3, LF-4, TF-5, TF-4, TF-3 78 Bảng 3.48 Dữ liệu phổ 1H-NMR LF-2, LF-3, LF-4, TF-5, TF-4, TF-3 79 Bảng 3.49 Kết khảo sát hàm ẩm phương pháp TGA nhiệt độ nóng chảy, độ tinh khiết phương pháp DSC (n=3) 81 Bảng 3.50 Bảng tóm tắt điều kiện sắc ký thích hợp kiểm tra độ tinh khiết HPLC-PDA 06 CĐC 82 Bảng 3.51 Kết khảo sát tính phù hợp hệ thống quy trình phân tích HPLC 06 CĐC 82 Bảng 3.52 Kết xác định miền giá trị, độ đúng, độ xác qui trình phân tích nguyên liệu thiết lập CĐC 82 Bảng 3.53 Kết xác định độ tinh khiết sắc ký nguyên liệu thiết lập CĐC 83 Bảng 3.54 Tóm tắt tiêu chất lượng phương pháp thử CĐC 84 Bảng 3.55 Kết đánh giá đồng lô trình đóng lọ CĐC 84 Bảng 3.56 Kết đánh giá liên PTN nguyên liệu thiết lập CĐC 85 Bảng 3.57 Kết xác định giá trị ấn định CĐC sau đóng gói 85 Bảng 3.58 Kết khảo sát tính tuyến tính, LOD, LOQ, độ xác trung gian, độ qui trình phân tích đồng thời 07 alkaloid mẫu nguyên liệu sen (NN-1a) phương pháp CE-PDA/MS 90 Bảng 3.58 Kết khảo sát đặc tính điểm alkaloid, flavonoid có lá, tâm Sen phương pháp SKLM 100 Bảng 3.59 Kết khảo sát đặc tính điểm alkaloid, flavonoid có lá, tâm Sen phương pháp SKLM 101 Bảng 3.60 Kết xác định đặc tính điểm Sen dựa thành phần alkaloid có nguyên liệu Sen phương pháp HPLC-PDA 102 PHỤ LỤC ĐẶC TÍNH ĐIỂM CHỈ VÀ QUI TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG CÁC ALAKLOID, FLAVONID TRONG LÁ, TÂM SEN PL- 4.1 Điện di đồ minh họa chiết kiệt đồng thời 07 alkaloid (1: caaverin, 2: isoliensinin, 3: armepavin, 4: nor-armepavin, 5: nuciferin, 6: 2-O-nornuciferin, 7: pronuciferin) có mẫu nguyên liệu Sen (NN-1a) phương pháp CE-PDA/MS PL- 4.2 Kết độ lệch chuẩn tương đối (%) qua sáu lần tiêm liên tiếp mẫu nguyên liệu Sen (NN-1a) qui trình phân tích đồng thời 07 alkaloid sen phương pháp CE-PDA/MS Thông số Diện tích pic hiệu chỉnh* Thời gian dịch chuyển (tM) Độ phân giải (RS) * TB RSD (%) TB RSD (%) TB RSD (%) 39,6 0,43 10,6 1,22 1,75 2,01 74,6 0,87 10,9 1,34 1,80 1,43 83,5 1,41 11,4 1,14 3,15 1,64 Alkaloid 74,6 228,7 1,75 0,98 11,7 12,3 1,59 1,79 1,63 3,45 1,98 2,03 92,4 1,04 12,6 0,76 1,65 0,97 43,9 1,56 15,0 1,82 7,92 0,75 Tỉ lệ diện tích đỉnh thời gian dịch chuyển PL- 4.3 Điện di đồ minh họa chiết kiệt 08 flavonoid (1: catechin, 2: isorhamnetin, 3: kaempferol, 4: rutin, 5: isoquercitrin, 6: hyperoside, 7: quercetin, 3-O-β-D-GlcA) có mẫu nguyên phương pháp CE-PDA PL-79 liệu 8: quercetin Sen (NN-1a) PL- 4.4 Kết kiểm tra độ tinh khiết pic catechin, qui trình phân tích đồng thời 08 flavonoid mẫu thử Sen (NN-1a) phương pháp CZE-PDA PL- 4.5 Kết khảo sát tính tuyến tính, LOD, LOQ, độ xác trung gian, độ qui trình phân tích đồng thời 08 flavonoid mẫu nguyên liệu Sen (NN-1a) phương pháp CZE-PDA PL-80 a Độ lệch vòng ngày dựa diện tích pic tính theo (n=5) b Độ lệch vòng ngày dựa diện tích pic tính theo (n=3) PL- 4.6 SKĐ minh họa chiết kiệt 04 alkaloid (1: nuciferin, 2: 2-O-nornuciferin, 3: pronuciferin, 4: isoliensinin) có mẫu nguyên liệu Sen (NN-1a) phương pháp HPLC-PDA PL- 4.7 Kết khảo sát tính tuyến tính, độ xác trung gian, độ đúng, LOD LOQ qui trình phân tích đồng thời 04 alkaloid mẫu thử Sen (NN-1a) phương pháp HPLC-PDA PL-81 Alkaloid Yêu cầu thẩm định y= 40778x 0,9997 6,1-40 0,095 0,37 2,84 1,64 102,6 Phương trình hồi qui Hệ số tương quan Khoảng tuyến tính (µg mL-1) LOD (µg mL-1) LOQ (µg mL-1) Độ xác ngày (n=6) Độ xác liên ngày (n=3) Độ đúng* (n=9) y= 35873x 0,9998 3,1-200 0,25 0,83 2,74 3,12 98,3 y= 28864x 0,9998 12,2-580 0,13 0,45 5,38 2,25 97,23 y= 40057x 0,9995 5,7-368 0,10 0,33 7,19 1,67 106,17 PL- 4.8 SKĐ minh họa chiết kiệt 06 flavonoid (1: catechin, 2: quercetin 3-O-βD-GlcA, 3: rutin, 4: quercetin, 5: kaempferol, 6: isorhamnetin) có mẫu nguyên liệu Sen (NN-1a) HPLC-PDA PL- 4.9 Kết kiểm tra độ tinh khiết pic quercetin-3-O-β-D-GlcA, qui trình phân tích đồng thời 06 flavonoid mẫu nguyên liệu Sen (NN-1a) phương pháp CZE-PDA (c) (b) (a) Sắc ký đồ mẫu hỗn hợp chuẩn (a), mẫu dịch chiết flavonoid sen (b), mẫu thử thêm chuẩn (c) PL-82 (3) (2) (1) Phổ UV-vis LF-3 (quercetin 3-O-β-D-GlcA): (1) phổ chuẩn, (2) phổ mẫu thử, (3) phổ mẫu thử thêm chuẩn kiểm tra độ tinh khiết pic PL- 4.10 Kết khảo sát tính tuyến tính, độ xác trung gian, độ đúng, LOD LOQ qui trình phân tích đồng thời 06 flavonoid có mẫu nguyên liệu Sen (NN-1a) phương pháp HPLC-PDA (NN-1a) (n = 6) Yêu cầu thẩm định y= Phương trình hồi qui 1,91x + 4,12 Hệ số tương quan 0,9996 6,3Khoảng tuyến tính (µg mL-1) 400 LOD (µg mL-1) 3,2 -1 LOQ (µg mL ) 10,7 Độ xác ngày (n=6) 2,18 Độ xác liên ngày (n=3) 1,46 Độ đúng* (n=9) 97,8 y= 1,78x + 8,43 0,9997 9,31200 2,4 7,8 1,64 1,58 98,5 y= 1,27x + 3,96 0,9995 12,6400 6,1 20,3 3,19 2,66 103,3 y= 0,53x +1,86 0,9994 6,3400 3,2 10,7 2,65 3,17 102,6 y= 1,42x +5,25 0,9995 9,3300 4,7 15,7 3,28 3,74 103,7 y= 1,04x +3,24 0,9993 9,3300 4,7 15,7 3,83 3,13 97,4 PL- 4.11 Điện di đồ minh họa chiết kiệt 09 alkaloid (1: neferin, 2: liensinin, 3: isoliensinin, 4: nor-armepavin, 5: armepavin, 6: nuciferin, 7: isoliensinin N2’-oxid, 8: isoliensinin N2’-oxid, 9: pronuciferin) có mẫu nguyên liệu tâm Sen (NE-1a) phương pháp CE-PDA/MS PL-83 PL- 4.12 Kết kiểm tra độ tinh khiết pic isoliensinin N2-oxid qui trình phân tích đồng thời 09 alkaloid có mẫu nguyên liệu tâm Sen (NE-1a) phương pháp CZE-PDA-MS | | ' ' | | ' Calculated ++++++++++++++++++++++++++++++++++++ 13.4 13.45 13.5 13.55 200 250 300 350 400 450 500 550 nm PL- 4.13 Kết khảo sát tính tuyến tính, độ xác trung gian, độ đúng, LOD LOQ qui trình phân tích đồng thời 09 alkaloid có mẫu thử tâm Sen (NN-1a) phương pháp CE-PDA/MS (n = 6) Yêu cầu thẩm định Hệ số tương quan Khoảng tuyến tính (µg mL-1) LOD (µg mL-1) LOQ (µg mL-1) Độ xác ngày (n=5) Độ xác liên ngày (n=3) Độ đúng* (n=9) Alkaloid (1→ 9) 0,9992 → 0,9998 2,50 → 655,0 1,25 → 4,30 4,16 → 14,32 0,98 → 3,05 1,25 → 2,45 98,3 → 103,5 PL- 4.14 Điện di đồ minh họa chiết kiệt 06 flavonoid (1: isorhamnetin, 2: calycosin; 3: quercetin 3-O-β-D-glucuronid; 4: scutellarein 7-O-β-D-glucuronid metyl ester; 5: vitexin; 6: quercitrin) có mẫu nguyên liệu tâm Sen (NE-1a) phương pháp CE-PDA PL-84 PL- 4.15 Kết kiểm tra độ tinh khiết pic calycosin (2) qui trình phân tích đồng thời 06 flavonoid có mẫu nguyên liệu tâm Sen (NE-1a) phương pháp CZE-PDA PL- 4.16 Kết khảo sát tính tuyến tính, độ xác trung gian, độ đúng, LOD LOQ qui trình phân tích đồng thời 06 flavonoid mẫu nguyên liệu tâm Sen (NE-1a) phương pháp CE-PDA (n = 6) Yêu cầu thẩm định Hệ số tương quan Khoảng tuyến tính (µg mL-1) LOD (µg mL-1) LOQ (µg mL-1) Độ xác ngày (n=5) Độ xác liên ngày (n=3) Độ đúng* (n=9) Flavonoid (1→ 6) 0,9990 → 0,9998 25,00 → 75,00 6,25 → 15,75 19,00 → 49,20 1,38 → 3,18 1,63 → 3,42 97,70 → 104,20 PL-85 PL- 4.17 SKĐ minh họa chiết kiệt 07 alkaloid (1: isoliensinin N2’-oxid, 2: isoliensinin N2-oxid, 3: neferin, 4: liensinin, 5: isoliensinin, 6: armepavin, 7: nuciferin) có mẫu thử nguyên liệu tâm Sen (NE-1a) phương pháp HPLC-PDA PL- 4.18 Kết kiểm tra độ tinh khiết pic isoliensinin (5) qui trình phân tích đồng thời 07 alkaloid có mẫu thử nguyên liệu tâm Sen (NE-1a) phương pháp HPLC-PDA (3) (2) (1) (1) phổ UV chuẩn isoliensinin, (2) phổ mẫu thử, (3) phổ mẫu thử thêm chuẩn kiểm tra độ tinh khiết pic isoliensinin Sắc ký đồ mẫu pha động, dung môi pha mẫu, mẫu hỗn hợp chuẩn, mẫu thử, mẫu thử thêm chuẩn (e) PL-86 PL- 4.19 Kết khảo sát tính tuyến tính, độ xác trung gian, độ đúng, LOD LOQ qui trình phân tích đồng thời 07 alkaloid tâm Sen phương pháp HPLC-PDA (NN-1a) (n = 6) Alkaloid (1→ ) 0,9994 → 0,9997 3,125 → 1000 1,56 → 9,75 10,40 → 32,46 1,72 → 4,05 1,58 → 3,31 97,0 → 103,8 Yêu cầu thẩm định Hệ số tương quan Khoảng tuyến tính (µg mL-1) LOD (µg mL-1) LOQ (µg mL-1) Độ xác ngày (n=5) Độ xác liên ngày (n=3) Độ đúng* (n=9) PL- 4.20 SKĐ minh họa chiết kiệt 06 flavonoid (1: quercitrin, 2: vitexin, 3: scutellarein 7-O-β-D-glcA methyl ester, 4: quercetin 3-O-β-D-glcA, 5: calycosin, 6: isorhamnetin) có mẫu nguyên liệu tâm Sen (NE-1a) phương pháp HPLC-PDA PL- 4.21 Kết khảo sát tính tuyến tính, độ xác trung gian, độ đúng, LOD LOQ qui trình phân tích đồng thời 06 flavonoid tâm Sen phương pháp HPLC-PDA (NE-1a) (n = 6) Yêu cầu thẩm định Hệ số tương quan Khoảng tuyến tính (µg mL-1) LOD (µg mL-1) LOQ (µg mL-1) Độ xác ngày (n=5) Độ xác liên ngày (n=3) Độ đúng* (n=9) Flavonoid (1→ ) 0,9995 → 0,9999 6,25 → 800 3,125 → 12,5 10,40 → 41,63 1,56 → 3,82 1,79 → 3,56 97,3 → 104,5 PL-87 PL- 4.22 ĐDĐ phân tích đồng thời 07 alkaloid (1: caaverin, 2: isoliensinin, 3: armepavin, 4: norarmepavin, 5: nuciferin, 6: 2-O-nornuciferin, 7: pronuciferin) có ba mẫu nguyên liệu Sen: LS-10 (NN-2a), LS-2 (NN-2a), LS-13 (NN-3a) đại diện cho ba vùng thu hái khác vào mùa Sen (07.2011) phương pháp CE-PDA PL- 4.23 ĐDĐ phân tích đồng thời 07 alkaloid (1: caaverin, 2: isoliensinin, 3: armepavin, 4: norarmepavin, 5: nuciferin, 6: 2-O-nornuciferin, 7: pronuciferin) có mẫu nguyên liệu Sen: LS-1 (NN-1a) mùa Sen (07.2011) LS-1 (NN-1b) nghịch mùa Sen (10.2012) phương pháp CE-PDA PL-88 PL- 4.24 ĐDĐ phân tích đồng thời 07 alkaloid (1: caaverin, 2: isoliensinin, 3: armepavin, 4: norarmepavin, 5: nuciferin, 6: 2-O-nornuciferin, 7: pronuciferin) có mẫu nguyên liệu Sen: LS-10 (NN-1a) mùa Sen phương pháp CE-MS Intens x10 Lotus032.d: EIC 268 +All MS, Smoothed (2.0,1, GA) x10 Lotus032.d: EIC 611 +All MS, Smoothed (2.0,1, GA) x10 2.5 Lotus032.d: EIC 300 +All MS, Smoothed (2.0,1, GA) 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 x10 Lotus032.d: EIC 314 +All MS, Smoothed (2.0,1, GA) 1.5 1.0 0.5 0.0 x10 Lotus032.d: EIC 296 +All MS, Smoothed (2.0,1, GA) 1.5 1.0 0.5 0.0 x10 Lotus032.d: EIC 282 +All MS, Smoothed (2.0,1, GA) 1.00 0.75 0.50 0.25 0.00 x10 Lotus032.d: EIC 312 +All MS, Smoothed (2.0,1, GA) 1.00 0.75 0.50 0.25 0.00 10 15 PL-89 20 25 Time [min] PL- 4.25 ĐDĐ phân tích đồng thời 07 alkaloid (1: caaverin, 2: isoliensinin, 3: armepavin, 4: norarmepavin, 5: nuciferin, 6: 2-O-nornuciferin, 7: pronuciferin) có hai mẫu chế phẩm M-6 M-9 phương pháp CE-PDA PL- 4.26 ĐDĐ phân tích đồng thời 08 flavonoid (1: catechin, 2: isorhamnetin, 3: kaempferol, 4: rutin, 5: isoquercitrin, 6: hyperin, 7: quercetin, 8: quercetin 3-O-βD-GlcA) có 04 mẫu nguyên liệu Sen: LS-1 (NN-1a), LS-6 (NN-1a), LS-11 (NN-2a) LS-13 (NN-1a) đại diện cho ba vùng thu hái khác vào mùa Sen (07.2011) phương pháp CE-PDA PL-90 PL- 4.27 ĐDĐ phân tích đồng thời 08 flavonoid (1: catechin, 2: isorhamnetin, 3: kaempferol, 4: rutin, 5: isoquercitrin, 6: hyperin, 7: quercetin, 8: quercetin 3-O-βD-GlcA) có 02 mẫu nguyên liệu Sen: LS-3, LS-4 (NN-1a,b) thu hái vào mùa Sen (07.2011) nghịch mùa Sen (10.2012) phương pháp CE-PDA PL- 4.28 Kết xác định hàm lượng alkaloid (mg/100mg) có mẫu nguyên liệu tâm Sen (Nelumbo nucifera) phương pháp CE-PDA/MS HPLC-PDA NE-3a CE Mẫu tâm Sen loài N, Nucifera NE-1a NE-1b NE-2a NE-2b 0,40 (1,29) 0,39 (1,26) 0,37 (1,25) 0,32 (2,01) 0,41(2,16) NE-3b 0,4 (1,05) HPLC CE HPLC CE HPLC CE CE HPLC CE HPLC CE HPLC CE HPLC CE 0,37 (1,05) 0,21 (1,45) 0,20 (1,02) 0,51 (2,05) 0,52 (1,32) 0,14 (0,52) 0,17 (1,45) 0,16 (1,26) 0,07 (2,04) 0,05 (1,56) 0,09 (1,13) 0,10 (0,65) 0,15 (2,12) 0,15 (0,93) 0,07 (2,14) 0,39 (1,14) 0,16 (2,25) 0,17 (1,18) 0,42 (2,15) 0,40 (1,26) 0,10 (1,98) 0,20 (2,25) 0,18 (1,35) 0,05 (1,65) 0,03 (1,09) 0,12 (1,56) 0,13 (1,21) 0,10(1,21) 0,08(1,03) 0,08 (3,12) 0,32 (0,87) 0,13 (1,42) 0,15 (1,04) 0,40 (1,64) 0,36 (1,07) 0,06 (1,67) 0,17 (1,42) 0,13 (0,81) 0,00 (2,41) 0,00 (1,32) 0,08 (1,51) 0,06 (1,35) 0,06 (1,45) 0,07(0,56) 0,04(2,13) Alkaloid neferin liensinin isoliensinin norarmepavin armepavin nuciferin isoliensinin N2’- oxyd isoliensinin N2- oxyd pronuciferin 0,28 (0,72) 0,17 (2,14) 0,17 (1,13) 0,47 (0,78) 0,46 (056) 0,08 (1,36) 0,15 (2,14) 0,12 (1,05) 0,05 (1,87) 0,03 (1,02) 0,06 (2,57) 0,06 (1,59) 0,10 (2,25) 0,08 (1,07) 0,05 (1,28) 0,29 (0,43) 0,18 (1,34) 0,17 (1,09) 0,40 (1,39) 0,43 (2,31) 0,11 (0,56) 0,25 (1,34) 0,22 (0,75) 0,05 (2,41) 0,03 (1,12) 0,09 (1,45) 0,10 (1,03) 0,11 (2,46) 0,12(1,34) 0,04 (3,21) 0,21 (1,01) 0,15 (1,45) 0,14 (1,03) 0,32 (0,57) 0,40 (3,14) 0,07 (1,89) 0,22 (1,45) 0,18 (0,89) 0,03 (2,23) 0,01 (1,17) 0,07 (1,70) 0,05 (1,05) 0,09 (3,21) 0,05 (1,87) 0,00 NE1,2,3: Nguyên liệu tâm Sen thu hái miền Nam, Trung miền Bắc Việt Nam, theo thứ tự a : Thu hái vào mùa sen tháng 07/2011; b: thu hái nghịch mùa sen tháng 12/2010 PL-91 PL- 4.29 Kết xác định hàm lượng alkaloid (mg/100mg) có 05 mẫu chế phẩm bào chế từ tâm Sen (Nelumbo nucifera) phương pháp CE-PDA/MS HPLC-PDA Alkaloid CE HPLC CE HPLC CE HPLC CE CE CE HPLC CE HPLC CE HPLC CE HPLC neferin liensinin isoliensinin norarmepavin armepavin nuciferin isoliensinin N2’ -oxid isoliensinin N2-oxid pronuciferin M-1 0,11 (2,42) 0,09 (2,07) 0,11 (2,41) 0,10 (1,67) 0,11 (2,13) 0,10 (1,25) - Mẫu bào chế từ Sen M-2 M-3 M-4 0,13 (2,36) 0,21 (1,93) 0,14 (1,75) 0,23 (2,51) 0,13 (1,98) 0,17 (2,05) 0,11 (0,83) 0,15 (1,34) 0,18 (1,83) 0,25 (2,34) 0,00 (2,67) 0,15 (0,79) 0,28 (1,13) 0,00 (1,62) 0,06 (2,54) 0,09 (2,22) 0,05 (2,18) 0,07 (1,87) 0,05 (2,09) 0,06 (1,25) 0,04 (1,86) 0,05 (0,94) - M-5 0,08 (1,88) 0,10 (0,72) - PL- 4.30 Kết xác định hàm lượng flavonoid (mg/100mg) có mẫu nguyên liệu tâm Sen (Nelumbo nucifera) phương pháp CE-PDA HPLC-PDA Flavonoid Mẫu Sen loài N, Nucifera NE-2a NE-2b NE-3a 0,11 (1,67) 0,07 (1,79) 0,09 (2,34) CE NE-1b 0,10 (1,86) HPLC 0,11 (1,23) 0,11 (1,22) 0,10 (0,43) 0,08 (1,01) 0,07 (1,25) 0,09 (0,98) CE 0,08 (2,15) 0,06 (2,06) 0,07 (1,26) 0,04 (1,72) - 0,00 (1,87) HPLC calycosin NE-1a 0,12 (2,32) NE-3b 0,08 (2,08) 0,07 (1,85) 0,04 (1,06) 0,05 (1,54) 0,00 (1,22) - 0,00 (1,06) CE HPLC CE HPLC CE HPLC CE HPLC 0,34 (2,22) 0,36 (1,38) 0,19 (1,92) 0,17 (1,07) 0,20 (2,23) 0,19 (1,35) 0,23 (2,12) 0,22 (1,34) 0,25 (0,78) 0,24 (0,69) 0,11 (1,89) 0,14 (1,18) 0,14 (1,98) 0,16 (1,02) 0,18 (1,97) 0,17 (1,08) 0,38 (2,39) 0,37 (1,57) 0,16 (2,56) 0,13 (1,39) 0,15 (2,32) 0,15 (1,24) 0,17 (2,32) 0,17 (1,23) 0,27 (2,57) 0,28 (1,14) 0,12 (1,89) 0,09 (1,45) 0,08 (2,13) 0,09 (1,09) 0,10 (2,14) 0,09 (1,19) 0,31 (2,15) 0,30 (1,26) 0,17 (2,05) 0,15 (1,21) 0,23 (1,65) 0,24 (1,09) 0,20 (1,65) 0,19 (1,09) 0,22 (1,85) 0,21 (1,08) 0,10 (2,17) 0,13 (1,53) 0,16 (2,44) 0,17 (1,25) 0,12 (2,04) 0,10 (1,52) isorhamnetin vitexin scutellarein7-O-β-D-GlcA quercitrin quercetin3-O-β-D-GlcA PL-92 PL- 4.31 Kết xác định hàm lượng flavonoid (mg/100mg) có 05 mẫu chế phẩm bào chế từ tâm Sen (Nelumbo nucifera) phương pháp CE-PDA HPLC-PDA Alkaloid calycosin isorhamnetin vitexin scutellarein7-O-β-D-GlcA quercitrin quercetin3-O-β-D-GlcA CE HPLC CE HPLC CE HPLC CE HPLC CE HPLC CE HPLC M-1 0,07 (1,83) 0,08 (0,79) 0,06 (2,09) 0,07 (1,07) - Mẫu bào chế từ Sen M-2 M-3 M-4 0,10 (1,97) 0,08 (1,28) 0,04 (2,05) 0,12 (1,83) 0,19 (2,06) 0,11 (0,79) 0,17 (1,35) 0,09 (1,77) 0,15 (2,42) 0,08 (1,04) 0,17 (1,65) 0,10 (2,23) 0,17 (1,89) 0,08 (0,88) 0,16 (1,24) 0,10 (2,08) 0,13 (2,27) 0,08 (1,06) 0,11 (1,45) - PL-93 M-5 -