nghiên cứu ứng dụng phương pháp sắc ký để phân tích thành phần alkaloid, flavonoid của lá, tâm sen và các chế phẩm( bản đầy đủ )

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH ĐỖ CHÂU MINH VĨNH THỌ NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ ĐỂ PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN ALKALOID, FLAVONOID CỦA LÁ, TÂM SEN VÀ CÁC CHẾ PHẨM LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC TP Hồ Chí Minh – Năm 2015 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH ĐỖ CHÂU MINH VĨNH THỌ NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ ĐỂ PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN ALKALOID, FLAVONOID CỦA LÁ, TÂM SEN VÀ CÁC CHẾ PHẨM Chuyên ngành: KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT Mã số: 62.72.04.10 LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS TRẦN HÙNG PGS.TS NGUYỄN ĐỨC TUẤN TP Hồ Chí Minh – Năm 2015 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu Các số liệu kết trình bày luận án trung thực chưa công bố công trình khác Người cam đoan, Đỗ Châu Minh Vĩnh Thọ i MỤC LỤC TRANG PHỤ BÌA LỜI CAM ĐOAN MỤC LỤC i DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT iii DANH MỤC CÁC BẢNG v DANH MỤC CÁC HÌNH, BIỂU ĐỒ, SƠ ĐỒ viii MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Thực vật học Sen 1.2 Hóa học Sen 1.3 Chiết xuất- phân lập alkaloid, flavonoid tâm Sen 12 1.4 Các phương pháp phân tích thành phần alkaloid, flavonoid lá, tâm Sen 16 1.5 Tác dụng sinh học lá, tâm Sen 19 1.6 Công dụng Sen 21 1.7 Chất đối chiếu 22 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.1 Đối tượng nghiên cứu 25 2.2 Nguyên vật liệu – Dung môi, hóa chất, thuốc thử – Trang thiết bị 25 2.3 Địa điểm nghiên cứu 28 2.4 Phương pháp nghiên cứu 29 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 47 3.1 Chiết xuất, phân lập, xác định cấu trúc alkaloid, flavonoid từ tâm Sen 47 3.1.1 Phân tích sơ thành phần hóa học tâm Sen 47 3.1.2 Chiết cao chiết toàn phần alkaloid, flavonoid từ tâm Sen 48 3.1.3 Phân lập alkaloid, flavonoid từ tâm Sen 48 3.1.4 Xác định độ tinh khiết alkaloid, flavonoid phân lập từ tâm Sen 60 3.1.5 Xác định cấu trúc chất phân lập 61 3.2 Thiết lập số chất đối chiếu alkaloid, flavonoid phân lập từ lá, tâm Sen 80 ii 3.3 Xây dựng qui trình định tính điểm chỉ, định lượng đồng thời alkaloid, flavonoid có tâm Sen 85 3.4 Ứng dụng qui trình định tính, định lượng để phân tích alkaloid, flavonoid có mẫu nguyên liệu chế phẩm bào chế từ lá, tâm Sen 104 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 108 4.1 Chiết xuất, phân lập, xác định cấu trúc cấu trúc alkaloid, flavonoid phân lập từ tâm Sen 108 4.2 Qui trình định tính, định lượng đồng thời alkaloid, flavonoid có tâm Sen 117 4.3 Ứng dụng qui trình định tính, định lượng để phân tích alkaloid, flavonoid có mẫu nguyên liệu chế phẩm từ lá, tâm Sen 124 4.4 Đặc tính điểm tâm Sen 127 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC iii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ACN Acetonitrile ASEAN Association of Southeast Asian Nations ( Hiệp hội quốc gia Đông Nam Á) CĐC Chất đối chiếu CE Capillary electrophoresis ( Điện di mao quản) Corr Area Corrected Area ( Diện tích pic chuẩn hóa) CTAB Cetyltrimethylammonium bromide CZE Capillary Zone Electrophoresis ( Điện di mao quản vùng) d doublet ( đỉnh đôi) DVT Dấu vân tay DĐVN IV Dược điển Việt Nam xuất lần thứ IV DEPT Distortionless Enhancement by Polarization Transfer DSC Differential Scanning Calorimetry ( Quét nhiệt vi sai) DMSO Dimethylsulfoxide ĐDĐ Điện di đồ DTAB Dodecyltrimethylammonium bromide ESI Electrospray Ionization ( Ion hóa phun mù electron) EOF Electro-osmotic flow ( Dòng điện thẩm) FCPC Fast centrifugal partition chromatography ( Sắc ký phân bố ly tâm nhanh) GLP Good Laboratory Practices ( Thực hành tốt phòng kiểm nghiệm thuốc) HPLC High Performance Liquid Chromatography ( Sắc ký lỏng hiệu cao) HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation HSQC Heteronuclear Single Quantum Correlation ICH International Conference on Harmonization IR Infrared ( Hồng ngoại) iv ILMAE Ionic liquids based microwave- assisted extraction ( chiết hỗ trợ vi sóng dựa pha lỏng ionic) J Coupling constant ( Hằng số ghép) LC-MS Liquid Chromatography–Mass Spectrometry ( Sắc ký lỏng ghép khối phổ) LDL Low density lipoprotein LOD Limit of detection LOQ Limit of quantitation MEKC Micellar Electrokinetic Chromatography ( Sắc ký mixen điện động) MCF-7 Michigan Cancer Foundation-7 ( Tế bào ung thư vú dòng MCF-7) MS Mass Spectrometry ( Khối phổ) NACE Non aqueous capillary electrophoresis NMR Nuclear Magnetic Resonance ( Cộng hưởng từ hạt nhân) PDA Photo Diode Array ( Dãy diod quang) PE Petroleum ether ( ether dầu hỏa) PCRS Primary Chemical Reference Standard ( Chất đối chiếu hóa học sơ cấp) PTN Phòng thí nghiệm RSD Relative Standard Deviation ( Độ lệch chuẩn tương đối) s singlet ( Đỉnh đơn) SKĐ Sắc ký đồ SCRS Secondary Chemical Reference Standard ( Chất đối chiếu hóa học thứ cấp) SDS Sodium Dodecyl Sulfate SFE Supercritical Fluid Extraction ( Chiết lưu chất siêu tới hạn) SKLM Sắc ký lớp mỏng TEA Triethylamin TGA Thermogravimetric Analysis ( Phân tích nhiệt trọng lượng) THF Tetrahydrofuran UV-Vis Ultraviolet-Visible ( Tử ngoại khả kiến) VLC Vacuum Liquid Chromatography ( Sắc ký cột chân không) v DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Vị trí phân loại chi Nelumbo Bảng 1.2 Các alkaloid khung aporphin có Sen Bảng 1.3 Các alkaloid khung benzylisoquinolin có Sen Bảng 1.4 Các alkaloid khung benzylisoquinolin có tâm Sen 10 Bảng 1.5 Các alkaloid khung bisbenzylisoquinolin có tâm Sen 11 Bảng 1.6 Tóm tắt nghiên cứu phân lập alkaloid, flavonoid lá, tâm Sen 12 Bảng 1.7 Tóm tắt nghiên cứu định lượng alkaloid, flavonoid tâm Sen 16 Bảng 2.1 Nơi thu hái nguyên liệu tâm Sen loài Nelumbo nucifera G 26 Bảng 2.2 Nơi thu hái nguyên liệu Sen loài N Lutea Willd Victoria regia 26 Bảng 2.3 Các chế phẩm có chứa tâm Sen 26 Bảng 2.4 Khảo sát dung môi chiết alkaloid, flavonoid từ lá, tâm Sen 30 Bảng 2.5 Điều kiện tiến hành VLC phân đoạn A2 tủa F từ Sen 33 Bảng 2.6 Điều kiện tiến hành sắc ký cột cao A3, cao N Sen 34 Bảng 2.7 Điều kiện tiến hành sắc ký cột phân đoạn NP5, NP8, cao EF tâm Sen 34 Bảng 2.8 Điều kiện tiến hành sắc ký cột Sephadex LH-20 phân đoạn F1, F6, F8 35 Bảng 2.9 Các điều kiện dung môi hai pha không đồng tan dự kiến thăm dò cho FCPC phân đoạn P-2 36 Bảng 3.1 Kết chiết cắn toàn phần từ lá, tâm Sen 47 Bảng 3.2 Kết chiết alkaloid, flavonoid toàn phần từ lá, tâm Sen 47 Bảng 3.3 Tổng kết alkaloid, flavonoid tinh khiết phân lập từ Sen 48 Bảng 3.4 Kết sắc ký cột silica gel cao A2, Sen 50 Bảng 3.5 Kết thu hứng LN-1 từ phân đoạn A2-1 50 Bảng 3.6 Kết thu hứng LN-2, LN-8 từ phân đoạn A2-2 50 Bảng 3.7 Kết thu hứng LN-2, LN-3 từ phân đoạn A2-3 51 Bảng 3.8 Kết thu hứng LN-4 từ phân đoạn A2-8 51 Bảng 3.9 Kết thu hứng LN-6, LN-7 từ phân đoạn A2-6 51 Bảng 3.10 Kết thu hứng LN-5 từ phân đoạn A2-11 A2-12 52 Bảng 3.11 Kết sắc ký cột silica gel cao A3 Sen 52 vi Bảng 3.12 Kết sắc ký cột silica gel cao N Sen 52 Bảng 3.13 Kết sắc ký cột silica gel tủa F, Sen 53 0,12(1,34) 0,05 (1,87) 0,08(1,03) 0,07(0,56) pronuciferin CE 0,07 (2,14) 0,05 (1,28) 0,04 (3,21) 0,00 0,08 (3,12) 0,04(2,13) NE1,2,3: Nguyên liệu tâm Sen thu hái miền Nam, Trung miền Bắc Việt Nam, theo thứ tự a: Thu hái vào mùa sen tháng 07/2011; b: thu hái nghịch mùa sen tháng 12/2010 PL-91 PL- 4.29 Kết xác định hàm lượng alkaloid (mg/100mg) có 05 mẫu chế phẩm bào chế từ tâm Sen ( Nelumbo nucifera) phương pháp CE-PDA/MS HPLC-PDA Mẫu bào chế từ Sen Alkaloid M-1 M-2 M-3 M-4 M-5 CE 0,11 (2,42) 0,13 (2,36) 0,21 (1,93) neferin HPLC 0,09 (2,07) 0,14 (1,75) 0,23 (2,51) CE 0,11 (2,41) 0,13 (1,98) 0,17 (2,05) liensinin HPLC 0,10 (1,67) 0,11 (0,83) 0,15 (1,34) CE 0,11 (2,13) 0,18 (1,83) 0,25 (2,34) 0,00 (2,67) 0,08 (1,88) isoliensinin HPLC 0,10 (1,25) 0,15 (0,79) 0,28 (1,13) 0,00 (1,62) 0,10 (0,72) norarmepavin CE 0,06 (2,54) armepavin CE 0,09 (2,22) CE 0,05 (2,18) nuciferin HPLC 0,07 (1,87) isoliensinin CE - N2’ -oxid HPLC isoliensinin CE 0,05 (2,09) N2-oxid HPLC 0,06 (1,25) CE - 0,04 (1,86) pronuciferin HPLC 0,05 (0,94) PL- 4.30 Kết xác định hàm lượng flavonoid (mg/100mg) có mẫu nguyên liệu tâm Sen ( Nelumbo nucifera) phương pháp CE-PDA HPLC-PDA Mẫu Sen loài N, Nucifera Flavonoid NE-1a NE-1b NE-2a NE-2b NE-3a NE-3b CE 0,12 (2,32) 0,10 (1,86) 0,11 (1,67) 0,07 (1,79) 0,09 (2,34) 0,08 (2,08) calycosin HPLC 0,11 (1,23) 0,11 (1,22) 0,10 (0,43) 0,08 (1,01) 0,07 (1,25) 0,09 (0,98) CE 0,08 (2,15) 0,06 (2,06) 0,07 (1,26) 0,04 (1,72) 0,00 (1,87) isorhamnetin HPLC 0,07 (1,85) 0,04 (1,06) 0,05 (1,54) 0,00 (1,22) 0,00 (1,06) CE 0,34 (2,22) 0,25 (0,78) 0,38 (2,39) 0,27 (2,57) 0,31 (2,15) 0,22 (1,85) vitexin HPLC 0,36 (1,38) 0,24 (0,69) 0,37 (1,57) 0,28 (1,14) 0,30 (1,26) 0,21 (1,08) scutellareinCE 0,19 (1,92) 0,11 (1,89) 0,16 (2,56) 0,12 (1,89) 0,17 (2,05) 0,10 (2,17) 7- O-β-D-GlcA HPLC 0,17 (1,07) 0,14 (1,18) 0,13 (1,39) 0,09 (1,45) 0,15 (1,21) 0,13 (1,53) CE 0,20 (2,23) 0,14 (1,98) 0,15 (2,32) 0,08 (2,13) 0,23 (1,65) 0,16 (2,44) quercitrin HPLC 0,19 (1,35) 0,16 (1,02) 0,15 (1,24) 0,09 (1,09) 0,24 (1,09) 0,17 (1,25) quercetinCE 0,23 (2,12) 0,18 (1,97) 0,17 (2,32) 0,10 (2,14) 0,20 (1,65) 0,12 (2,04) 3- O-β-D-GlcA HPLC 0,22 (1,34) 0,17 (1,08) 0,17 (1,23) 0,09 (1,19) 0,19 (1,09) 0,10 (1,52) PL-92 PL- 4.31 Kết xác định hàm lượng flavonoid (mg/100mg) có 05 mẫu chế phẩm bào chế từ tâm Sen ( Nelumbo nucifera) phương pháp CE-PDA HPLC-PDA Mẫu bào chế từ Sen Alkaloid M-1 M-2 M-3 M-4 M-5 CE 0,10 (1,97) calycosin HPLC 0,08 (1,28) CE 0,04 (2,05) isorhamnetin HPLC vitexin CE 0,07 (1,83) 0,12 (1,83) 0,19 (2,06) HPLC 0,08 (0,79) 0,11 (0,79) 0,17 (1,35) scutellareinCE 0,06 (2,09) 0,09 (1,77) 0,15 (2,42) - 7- O-β-D-GlcA HPLC 0,07 (1,07) 0,08 (1,04) 0,17 (1,65) CE 0,10 (2,23) 0,17 (1,89) quercitrin HPLC 0,08 (0,88) 0,16 (1,24) quercetin- CE 0,10 (2,08) 0,13 (2,27) 3- O-β-D-GlcA HPLC 0,08 (1,06) 0,11 (1,45) PL-93 Document Outline So 1_Chi in trang so 2.pdf (p.1-2) So 2_LỜI CAM ĐOAN.pdf (p.3) So 3_ Muc luc_ Danh muc viet tat va hinh bang 23112015_ dieu chinh theo y kien hoi dong cap nha nuoc.pdf (p.4-15) So 4_DVD va TQTL_26_23112015_ dieu chinh theo y kien hoi dong cap nha nuoc.pdf (p.16-41) So 5_DTPPNC_23 trang_23122015_ chinh sua theo y kien cua hoi dong nha nuoc.pdf (p.42-64) So 6_Phan KET QUA BAN LUAN_chinh theo gop y hoi dong cap nha nuoc 23112015_dong quyen nhu vang.pdf (p.65-155) So 7_TÀI LIỆU THAM KHẢO 23112015_chinh sua theo yeu cau Thay MY.pdf (p.156-164) So 8_DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC_chinh theo y kien hoi dong cap nha nuoc_23112015.pdf (p.165-257) [...]... lượng các chất chính có trong lá, tâm Sen bằng các phương pháp phân tích hóa lý hiện còn rất hạn chế Do đó, việc nghiên cứu thành phần hóa học alkaloid, flavonoid và thiết lập các chất đối chiếu phục vụ cho việc định tính, định lượng alkaloid, flavonoid có tác dụng sinh học trong lá, tâm Sen Việt Nam là một việc làm cấp thiết Với những lý do trên, đề tài Nghiên cứu ứng dụng phương pháp sắc ký để phân tích. .. lĩnh vực phân tích cũng đã có một vài nghiên cứu của các tác giả Trung quốc và Ấn độ ứng dụng phương pháp HPLC, CE để định lượng một vài chất trong số các thành phần chính của Sen trong dược liệu, chế phẩm hay dịch sinh học Tại Việt Nam hiện nay, việc sử dụng lá, tâm Sen trong điều trị bệnh ngày càng trở nên phổ biến Thế nhưng các công trình nghiên cứu về thành phần hóa học, cũng như các phương pháp định...Bảng 3.14 Kết quả sắc ký rây phân tử phân đoạn F1 53 Bảng 3.15 Kết quả sắc ký rây phân tử phân đoạn F-2,3 54 Bảng 3.16 Kết quả sắc ký rây phân tử phân đoạn F-7 54 Bảng 3.17 Kết quả thu hứng LF-2 và LF-4 từ F7-3 54 Bảng 3.18 Kết quả sắc ký rây phân tử phân đoạn F8 54 Bảng 3.19 Tổng kết các alkaloid, flavonoid tinh khiết phân lập từ lá Sen 55 Bảng 3.20 Kết quả sắc ký. .. phân tích thành phần alkaloid, flavonoid của lá, tâm Sen và các chế phẩm” được thực hiện với các mục tiêu nghiên cứu sau: 1 Chiết xuất, phân lập, xác định cấu trúc các alkaloid, flavonoid từ lá và tâm Sen bằng phương pháp sắc ký và phổ nghiệm 2 Thiết lập và xây dựng tiêu chuẩn một số alkaloid, flavonoid có tác dụng sinh học để dùng làm chất đối chiếu phục vụ cho công tác kiểm nghiệm 2 3 Xây dựng các qui... đồng thời các alkaloid, flavonoid có trong lá, tâm Sen bằng các phương pháp HPLC và CE 4 Áp dụng các phương pháp đã xây dựng để định tính, đánh giá thành phần, hàm lượng các alkaloid và flavonoid trong lá, tâm Sen được thu hái từ các tỉnh, thành khác nhau và trong chế phẩm từ Sen có trên thị trường 3 CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 THỰC VẬT HỌC VỀ SEN 1.1.1 Chi Nelumbo và vị trí phân loại của chi Chi... tâm Sen đều tập trung vào các alkaloid, là thành phần chính chiếm tỉ lệ lớn và được cho là có nhiều tác dụng sinh học nhất trong tâm Sen Chỉ có một vài công trình nghiên cứu về thành phần flavonoid và các chất khác trong tâm Sen như: asparagin, tanin, triterpen, đường khử, các acid hữu cơ [7], [8] 1.2.2.1 Thành phần alkaloid của tâm Sen Tâm Sen có hàm lượng alkaloid toàn phần khoảng từ 0,85 - 0,96 % và. .. của lá Sen dựa trên thành phần flavonoid có trong nguyên liệu lá Sen bằng phương pháp HPLC/PDA 102 Bảng 3.62 Kết quả xác định đặc tính điểm chỉ của tâm Sen dựa trên thành phần alkaloid có trong nguyên liệu tâm Sen bằng phương pháp HPLC-PDA 103 Bảng 3.63 Kết quả xác định đặc tính điểm chỉ của tâm Sen dựa trên thành phần flavonoid có trong nguyên liệu tâm Sen bằng phương pháp HPLC/PDA 103 Bảng 3.64... [30],[108], ức chế kết tập tiểu cầu [100], kháng HIV [99] Các hoạt tính sinh học này ít nhiều đều liên quan đến sự hiện diện của thành phần alkaloid và flavonoid có trong lá, tâm Sen Ngày nay, với sự tiến bộ của khoa học chiết tách và phân tích, trên thế giới đã có những công trình nghiên cứu về thành phần hóa học và phân tích định tính, định lượng một số thành phần alkaloid, flavonoid trong lá, tâm Sen Trong... trên phân đoạn NP5, tâm Sen 57 Bảng 3.21 Kết quả sắc ký cột silica gel trên phân đoạn NP8, tâm Sen 57 Bảng 3.22 Kết quả sắc ký rây phân tử phân đoạn P 58 Bảng 3.23 Kết quả FCPC phân đoạn P-2 58 Bảng 3.24 Kết quả Sephadex LH-20 của phân đoạn n-Bu 58 Bảng 3.25 Kết quả các phân đoạn sau SPE từ n-Bu II 59 Bảng 3.26 Kết quả sắc ký cột silica gel trên cao EF, tâm Sen 59 Bảng... chỉ của lá Sen dựa trên thành phần flavonoid có trong nguyên liệu lá Sen bằng phương pháp CE/PDA 104 Bảng 3.65 Kết quả xác định đặc tính điểm chỉ của tâm Sen dựa trên thành phần flavonoid có trong nguyên liệu tâm Sen bằng phương pháp CE/PDA 104 Bảng 3.66 Kết quả xác định đặc tính điểm chỉ của lá Sen dựa trên thành phần alkaloid có trong nguyên liệu lá Sen bằng phương pháp CE-PDA/MS 104 Bảng ... DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH ĐỖ CHÂU MINH VĨNH THỌ NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ ĐỂ PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN ALKALOID, FLAVONOID CỦA LÁ, TÂM SEN VÀ CÁC CHẾ... DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH ĐỖ CHÂU MINH VĨNH THỌ NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ ĐỂ PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN ALKALOID, FLAVONOID CỦA LÁ, TÂM SEN VÀ CÁC CHẾ... Nghiên cứu ứng dụng phương pháp sắc ký để phân tích thành phần alkaloid, flavonoid lá, tâm Sen chế phẩm” thực với mục tiêu nghiên cứu sau: Chiết xuất, phân lập, xác định cấu trúc alkaloid, flavonoid