nghiên cứu ứng dụng phương pháp sắc ký để phân tích thành phần alkaloid, flavonoid của lá, tâm sen và các chế phẩm( bản đầy đủ )

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH ĐỖ CHÂU MINH VĨNH THỌ NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ ĐỂ PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN ALKALOID, FLAVONOID CỦA LÁ, TÂM SE

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

ĐỖ CHÂU MINH VĨNH THỌ

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ

ĐỂ PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN ALKALOID, FLAVONOID

CỦA LÁ, TÂM SEN VÀ CÁC CHẾ PHẨM

LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC

TP Hồ Chí Minh – Năm 2015

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

ĐỖ CHÂU MINH VĨNH THỌ

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ

ĐỂ PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN ALKALOID, FLAVONOID

CỦA LÁ, TÂM SEN VÀ CÁC CHẾ PHẨM

Chuyên ngành: KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT

Mã số: 62.72.04.10

LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC

Người hướng dẫn khoa học:

1 PGS.TS TRẦN HÙNG

2 PGS.TS NGUYỄN ĐỨC TUẤN

TP Hồ Chí Minh – Năm 2015

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi Các số liệu và kết quả đượctrình bày trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kì công

trình nào khác.

Người cam đoan,

Đỗ Châu Minh Vĩnh Thọ

i

MỤC LỤC

TRANG PHỤ BÌA

LỜI CAM ĐOAN

MỤC LỤC i

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT iii

DANH MỤC CÁC BẢNG v

DANH MỤC CÁC HÌNH, BIỂU ĐỒ, SƠ ĐỒ viii

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Thực vật học về Sen 4

1.2 Hóa học về Sen 7

1.3 Chiết xuất- phân lập các alkaloid, flavonoid trong lá và tâm Sen 12

1.4 Các phương pháp phân tích thành phần alkaloid, flavonoid trong lá, tâm Sen 16 1.5 Tác dụng sinh học của lá, tâm Sen 19

1.6 Công dụng của Sen 21

1.7 Chất đối chiếu 22

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

2.1 Đối tượng nghiên cứu 25

2.2 Nguyên vật liệu – Dung môi, hóa chất, thuốc thử – Trang thiết bị 25

2.3 Địa điểm nghiên cứu 28

2.4 Phương pháp nghiên cứu 29

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 47

3.1 Chiết xuất, phân lập, xác định cấu trúc alkaloid, flavonoid từ lá và tâm Sen 47

3.1.1 Phân tích sơ bộ thành phần hóa học của lá và tâm Sen 47

3.1.2 Chiết cao chiết toàn phần alkaloid, flavonoid từ lá và tâm Sen 48

3.1.3 Phân lập alkaloid, flavonoid từ lá và tâm Sen 48

3.1.4 Xác định độ tinh khiết các alkaloid, flavonoid phân lập từ lá và tâm Sen 60

3.1.5 Xác định cấu trúc các chất phân lập được 61

3.2 Thiết lập một số chất đối chiếu alkaloid, flavonoid phân lập từ lá, tâm Sen 80

ii 3.3 Xây dựng qui trình định tính điểm chỉ, định lượng đồng thời alkaloid, flavonoid có trong lá và tâm Sen 85

3.4 Ứng dụng các qui trình định tính, định lượng để phân tích các alkaloid, flavonoid có trong các mẫu nguyên liệu và chế phẩm bào chế từ lá, tâm Sen 104

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 108

4.1 Chiết xuất, phân lập, xác định cấu trúc cấu trúc các alkaloid, flavonoid phân lập từ lá và tâm Sen 108

4.2 Qui trình định tính, định lượng đồng thời alkaloid, flavonoid có trong lá và tâm Sen 117

4.3 Ứng dụng qui trình định tính, định lượng để phân tích các alkaloid, flavonoid có trong các mẫu nguyên liệu và chế phẩm từ lá, tâm Sen 124

4.4 Đặc tính điểm chỉ của lá và tâm Sen 127

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Association of Southeast Asian Nations

( Hiệp hội các quốc gia Đông Nam Á)

Corrected Area ( Diện tích pic được chuẩn hóa)

CTAB Cetyltrimethylammonium bromide

Dấu vân tay

DĐVN IV Dược điển Việt Nam xuất bản lần thứ IV

DEPT

Distortionless Enhancement by Polarization Transfer

hiệu năng cao)

HMBC

Heteronuclear Multiple Bond Correlation

HSQC

Heteronuclear Single Quantum Correlation

ICH International Conference on Harmonization

Low density lipoprotein

LOD Limit of detection

LOQ Limit of quantitation

MEKC

Micellar Electrokinetic Chromatography ( Sắc ký mixen điện động)

MCF-7

Michigan Cancer Foundation-7 ( Tế bào ung thư vú dòng MCF-7)

MS

Mass Spectrometry ( Khối phổ)

NACE Non aqueous capillary electrophoresis

Secondary Chemical Reference Standard

( Chất đối chiếu hóa học thứ cấp)

SDS

Sodium Dodecyl Sulfate

SFE

Supercritical Fluid Extraction ( Chiết bằng lưu chất siêu tới hạn)

SKLM

Sắc ký lớp mỏng

TEA

Triethylamin

TGA

Thermogravimetric Analysis ( Phân tích nhiệt trọng lượng)

THF

Tetrahydrofuran

UV-Vis

Ultraviolet-Visible ( Tử ngoại khả kiến)

VLC

Vacuum Liquid Chromatography ( Sắc ký cột chân không)

v

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Vị trí phân loại của chi Nelumbo 4

Bảng 1.2 Các alkaloid khung aporphin có trong lá Sen 8

Bảng 1.3 Các alkaloid khung benzylisoquinolin có trong lá Sen 8

Bảng 1.4 Các alkaloid khung benzylisoquinolin có trong tâm Sen 10

Bảng 1.5 Các alkaloid khung bisbenzylisoquinolin có trong tâm Sen 11

Bảng 1.6 Tóm tắt các nghiên cứu phân lập alkaloid, flavonoid lá, tâm Sen 12

Bảng 1.7 Tóm tắt các nghiên cứu định lượng alkaloid, flavonoid lá và tâm Sen 16

Bảng 2.1 Nơi thu hái nguyên liệu lá và tâm Sen loài Nelumbo nucifera G 26

Bảng 2.2 Nơi thu hái nguyên liệu lá Sen loài N Lutea Willd và Victoria regia 26

Bảng 2.3 Các chế phẩm có chứa lá và tâm Sen 26

Bảng 2.4 Khảo sát dung môi chiết alkaloid, flavonoid từ lá, tâm Sen 30

Bảng 2.5 Điều kiện tiến hành VLC phân đoạn A2 và tủa F từ lá Sen 33

Bảng 2.6 Điều kiện tiến hành sắc ký cột cao A3, cao N lá Sen 34

Bảng 2.7 Điều kiện tiến hành sắc ký cột phân đoạn NP5, NP8, cao EF tâm Sen 34

Bảng 2.8 Điều kiện tiến hành sắc ký cột Sephadex LH-20 phân đoạn F1, F6, F8 35 Bảng 2.9 Các điều kiện dung môi hai pha không đồng tan dự kiến thăm dò cho FCPC phân đoạn P-2 36

Bảng 3.1 Kết quả chiết cắn toàn phần từ lá, tâm Sen 47

Bảng 3.2 Kết quả chiết alkaloid, flavonoid toàn phần từ lá, tâm Sen 47

Bảng 3.3 Tổng kết các alkaloid, flavonoid tinh khiết phân lập từ lá Sen 48

Bảng 3.4 Kết quả sắc ký cột silica gel trên cao A2, lá Sen 50

Bảng 3.5 Kết quả thu hứng LN-1 từ phân đoạn A2-1 50

Bảng 3.6 Kết quả thu hứng LN-2, LN-8 từ phân đoạn A2-2 50

Bảng 3.7 Kết quả thu hứng LN-2, LN-3 từ phân đoạn A2-3 51

Bảng 3.8 Kết quả thu hứng LN-4 từ phân đoạn A2-8 51

Bảng 3.9 Kết quả thu hứng LN-6, LN-7 từ phân đoạn A2-6 51

Bảng 3.10 Kết quả thu hứng LN-5 từ phân đoạn A2-11 và A2-12 52

Bảng 3.11 Kết quả sắc ký cột silica gel trên cao A3 lá Sen 52

vi Bảng 3.12 Kết quả sắc ký cột silica gel trên cao N lá Sen 52

Bảng 3.13 Kết quả sắc ký cột silica gel trên tủa F, lá Sen 53

Bảng 3.14 Kết quả sắc ký rây phân tử phân đoạn F1 53

Bảng 3.15 Kết quả sắc ký rây phân tử phân đoạn F-2,3 54

Bảng 3.16 Kết quả sắc ký rây phân tử phân đoạn F-7 54

Bảng 3.17 Kết quả thu hứng LF-2 và LF-4 từ F7-3 54

Bảng 3.18 Kết quả sắc ký rây phân tử phân đoạn F8 54

Bảng 3.19 Tổng kết các alkaloid, flavonoid tinh khiết phân lập từ lá Sen 55

Bảng 3.20 Kết quả sắc ký cột silica gel trên phân đoạn NP5, tâm Sen 57

Bảng 3.21 Kết quả sắc ký cột silica gel trên phân đoạn NP8, tâm Sen 57

Bảng 3.22 Kết quả sắc ký rây phân tử phân đoạn P 58

Bảng 3.23 Kết quả FCPC phân đoạn P-2 58

Bảng 3.24 Kết quả Sephadex LH-20 của phân đoạn n-Bu 58

Bảng 3.25 Kết quả các phân đoạn sau SPE từ n-Bu II 59

Bảng 3.26 Kết quả sắc ký cột silica gel trên cao EF, tâm Sen 59

Bảng 3.27 Kết quả sắc ký rây phân tử phân đoạn EF-8, tâm Sen 59

Bảng 3.28 Độ tinh khiết các alkaloid, flavonoid phân lập từ lá và tâm Sen 60

Bảng 3.29 Dữ liệu phổ UV, MS của LN-1, LN-2, LN-3, LN-4 61

Bảng 3.30 Dữ liệu phổ 13C- NMR của LN-1, LN-2, LN-3, LN-4 61

Bảng 3.31 Dữ liệu phổ 1H- NMR của LN-1, LN-2, LN-3, LN-4 62

Bảng 3.32 Dữ liệu phổ 13C và 1H-NMR của LN-5 63

Bảng 3.33 Dữ liệu phổ UV, MS của LN-8, LN-9 64

Bảng 3.34 Dữ liệu phổ 13C và 1H- NMR của LN-8, LN-9 64

Bảng 3.35 Dữ liệu phổ UV, IR, MS của EN-1, EN-2, EN-3 65

Bảng 3.36 Dữ liệu phổ 13C và 1H- NMR của EN-1, EN-2, EN-3 66

Bảng 3.37 Dữ liệu phổ UV, IR, MS của các alkaloid EN-4, EN-5 67

Bảng 3.38 Dữ liệu phổ 1D và 2D-NMR của EN-4 67

Bảng 3.39 Dữ liệu phổ 1D và 2D-NMR của EN-5 69

Bảng 3.40 Dữ liệu phổ UV, IR, MS của EN-6, EN-7, EN-8, EN-9 74

Bảng 3.41 Dữ liệu phổ 13C-NMR của EN-6, EN-7, EN-8, EN-9 75

vii Bảng 3.42 Dữ liệu phổ 1H-NMR của EN-6, EN-7, EN-8, EN-9 75

Bảng 3.43 Dữ liệu phổ UV, MS của LF-1, LF-5, LF-6, LF-8, TF-1 76

Bảng 3.44 Dữ liệu phổ 13C-NMR của LF-1, LF-5, LF-6, LF-8, TF-1 76

Bảng 3.45 Dữ liệu phổ 1H-NMR của LF-1, LF-5, LF-6, LF-8, TF-1 77

Bảng 3.46 Dữ liệu phổ UV, MS của LF-2, LF-3, LF-4, TF-5, TF-4, TF-3 78

Bảng 3.47 Dữ liệu phổ 13C-NMR của LF-2, LF-3, LF-4, TF-5, TF-4, TF-3 78

Bảng 3.48 Dữ liệu phổ 1H-NMR của LF-2, LF-3, LF-4, TF-5, TF-4, TF-3 79

Bảng 3.49 Kết quả khảo sát hàm ẩm bằng phương pháp TGA và nhiệt độ nóng chảy, độ tinh khiết bằng phương pháp DSC (n=3) 81

Bảng 3.50 Bảng tóm tắt điều kiện sắc ký thích hợp kiểm tra độ tinh khiết HPLC-PDA của 06 CĐC 82

Bảng 3.51 Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống quy trình phân tích HPLC của 06 CĐC 82

Bảng 3.52 Kết quả xác định miền giá trị, độ đúng, độ chính xác của qui trình phân tích các nguyên liệu thiết lập CĐC 82

Bảng 3.53 Kết quả xác định độ tinh khiết sắc ký các nguyên liệu thiết lập CĐC 83

Bảng 3.54 Tóm tắt các chỉ tiêu chất lượng và phương pháp thử của các CĐC 84

Bảng 3.55 Kết quả đánh giá đồng nhất lô của quá trình đóng lọ các CĐC 84

Bảng 3.56 Kết quả đánh giá liên PTN của các nguyên liệu thiết lập CĐC 85

Bảng 3.57 Kết quả xác định giá trị ấn định của các CĐC sau khi đóng gói 85 Bảng 3.58 Kết quả khảo sát tính tuyến tính, LOD, LOQ, độ chính xác trung gian,

độ đúng qui trình phân tích đồng thời 07 alkaloid trong mẫu nguyên liệu lá sen

(NN-1a) bằng phương pháp CE-PDA/MS 90

Bảng 3.58 Kết quả khảo sát đặc tính điểm chỉ các alkaloid, flavonoid có trong

lá, tâm Sen bằng phương pháp SKLM 100

Bảng 3.59 Kết quả khảo sát đặc tính điểm chỉ các alkaloid, flavonoid có trong

lá, tâm Sen bằng phương pháp SKLM 101

Bảng 3.60 Kết quả xác định đặc tính điểm chỉ của lá Sen dựa trên thành phần

alkaloid có trong nguyên liệu lá Sen bằng phương pháp HPLC-PDA 102viii

Bảng 3.61 Kết quả xác định đặc tính điểm chỉ của lá Sen dựa trên thành phần

flavonoid có trong nguyên liệu lá Sen bằng phương pháp HPLC/PDA 102

Bảng 3.62 Kết quả xác định đặc tính điểm chỉ của tâm Sen dựa trên thành phần

alkaloid có trong nguyên liệu tâm Sen bằng phương pháp HPLC-PDA 103

Bảng 3.63 Kết quả xác định đặc tính điểm chỉ của tâm Sen dựa trên thành phần

flavonoid có trong nguyên liệu tâm Sen bằng phương pháp HPLC/PDA 103

Bảng 3.64 Kết quả xác định đặc tính điểm chỉ của lá Sen dựa trên thành phần

flavonoid có trong nguyên liệu lá Sen bằng phương pháp CE/PDA 104

Bảng 3.65 Kết quả xác định đặc tính điểm chỉ của tâm Sen dựa trên thành phần

flavonoid có trong nguyên liệu tâm Sen bằng phương pháp CE/PDA 104

Bảng 3.66 Kết quả xác định đặc tính điểm chỉ của lá Sen dựa trên thành phần

alkaloid có trong nguyên liệu lá Sen bằng phương pháp CE-PDA/MS 104

Bảng 3.67 Kết quả xác định đặc tính điểm chỉ của tâm Sen dựa trên thành phần

alkaloid có trong nguyên liệu tâm Sen bằng phương pháp CE-PDA/MS 105

Bảng 3.68 Kết quả xác định hàm lượng các alkaloid (mg/100 mg) có trong mẫu

nguyên liệu lá Sen loài Nelumbo nucifera; Nelumbo lutea và Victoria regia bằng

phương pháp CE-PDA/MS và HPLC-PDA 106

Bảng 3.69 Kết quả xác định hàm lượng của các alkaloid (mg/100 mg) có trong

07 mẫu chế phẩm từ lá Sen loài N nucifera bằng phương pháp CE-PDA/MS và

HPLC-PDA 106

Bảng 3.70 Kết quả xác định hàm lượng các flavonoid (mg/100mg) có trong mẫu

nguyên liệu lá Sen loài Nelumbo nucifera; Nelumbo lutea và Victoria regia bằng

phương pháp CE-PDA và HPLC-PDA 107

Bảng 3.71 Kết quả xác định hàm lượng của các flavonoid (mg/100 mg) có trong

06 mẫu chế phẩm từ lá Sen loài N nucifera bằng phương pháp CE-PDA và

HPLC-PDA 107

Bảng 4.1 Độ dịch chuyển trên phổ 13C và 1H để phân biệt 05 alkaloid

LN-1, LN-2, LN-3, LN-4, LN-5 114 Bảng 4.2 Độ dịch chuyển trên phổ 13C và 1H để phân biệt 05 alkaloid

EN-1, EN-2, EN-3, EN-4, EN-5 115

ix

Bảng 4.3 Độ dịch chuyển trên phổ 13C và 1H để phân biệt 04 alkaloid

EN-6, EN-7, EN-8, EN-9 116 Bảng 4.4 Độ dịch chuyển trên phổ 13C và 1H để phân biệt 02 alkaloid

LN-9, LN-10 117 Bảng 4.5 Kết quả đánh giá về nơi thu hái cho hàm lượng alkaloid cao nhất có trong

lá Sen ( N nucifera) Việt Nam 127

Bảng 4.6 Kết quả đánh giá về nơi thu hái cho hàm lượng alkaloid cao nhất có trong

tâm Sen ( N nucifera) Việt Nam 127

Bảng 4.7 Kết quả đánh giá về nơi thu hái cho hàm lượng flavonoid cao nhất có trong lá Sen ( N nucifera) Việt Nam 127

Bảng 4.8 Kết quả đánh giá về nơi thu hái cho hàm lượng flavonoid cao nhất có trong tâm Sen ( N nucifera) Việt Nam 127

x DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Hình ảnh loài Sen hồng và Sen trắng 4

Hình 3.1 SKLM của 09 alkaloid phân lập từ lá Sen 49

Hình 3.2 SKLM của cao A1, A2, A3 lá Sen 49

Hình 3.3 SKĐ 06 lần tiêm mẫu thu hứng LN2, LN8 51

Hình 3.4 SKLM 08 flavonoid phân lập từ lá Sen 53

Hình 3.5 SKLM các alkaloid phân lập từ tâm Sen 56

Hình 3.6 SKLM các phân đoạn NP5, NP8, P tâm Sen 56

Hình 3.7 Cấu trúc hóa học của LN-1, LN-2, LN-3, LN-4 62

Hình 3.8 Cấu trúc hóa học và các tương tác xa của LN-5 63

Hình 3.9 Cấu trúc hóa học và các tương tác xa của LN-8, LN-9 65

Hình 3.10 Cấu trúc hóa học của EN-1, EN-2, EN-3 67

Hình 3.11 Cấu trúc hóa học và các tương tác xa của EN-4 69

Hình 3.12 Cấu trúc hóa học và các tương tác xa của EN-5 70

Hình 3.13 Cấu trúc hóa học của EN-6, EN-7, EN-8, EN-9 75

Hình 3.14 Cấu trúc hóa học của LF-1, LF-5, LF-6, LF-7, LF-8, TF-1 77

Hình 3.15 Cấu trúc hóa học của LF-2, LF-3, LF-4, TF-5, TF-4, TF-3 79

Hình 3.16 Điện di đồ của hỗn hợp chuẩn 07 alkaloid và mẫu thử dịch chiết

toàn phần alkaloid lá sen ở điều kiện thích hợp 87

Hình 3.17 Điện di đồ CE-MS của mẫu hỗn hợp chuẩn 07 alkaloid (TIC) và mẫu

thử lá Sen NN-1a (TIC/EIC) ở điều kiện thích hợp 87

Hình 3.18 Phổ MS của nuciferin, 2- O-nornuciferin, norarmepavin, armepavin trong mẫu

thử lá Sen, tương ứng điện di đồ CE-MS 89

Hình 3.19 Kiểm tra độ tinh khiết pic pronuciferin 90 Hình 3.20 Điện di đồ mẫu thử dịch chiết alkaloid toàn phần lá Sen, hỗn hợp 07 chuẩn

alkaloid và mẫu thử thêm hỗn hợp chuẩn 90

Hình 3.21 Điện di đồ mẫu hỗn hợp chuẩn 08 flavonoid và mẫu thử dịch chiết

flavonoid toàn phần lá Sen 91xi

Hình 3.22 SKĐ mẫu thử dịch chiết alkaloid toàn phần lá Sen, hỗn hợp 04 chuẩn

alkaloid ở điều kiện sắc ký thích hợp 92

Hình 3.23 Sắc ký đồ mẫu pha động (a), mẫu hỗn hợp chuẩn (b), dung môi pha mẫu (c),

mẫu thử lá Sen (d), mẫu thử thêm chuẩn (e) 93

Hình 3.24 Phổ UV-Vis của nuciferin trong (1) mẫu chuẩn, (2) mẫu thử lá Sen, (3)

mẫu thử thêm chuẩn và kiểm tra độ tinh khiết pic nuciferin 93

Hình 3.25 SKĐ hỗn hợp 06 chuẩn flavonoid (1), mẫu thử dịch chiết flavonoid

toàn phần lá Sen (2), ở điều kiện sắc ký thích hợp 94

Hình 3.26 Điện di đồ mẫu thử dịch chiết alkaloid toàn phần tâm Sen, hỗn hợp 09

chuẩn alkaloid ở điều kiện điện di thích hợp 95

Hình 3.27 Điện di đồ CE-MS của mẫu hỗn hợp chuẩn 09 alkaloid (TIC) và mẫu

thử tâm Sen NN-1a (TIC/EIC) ở điều kiện điện di thích hợp 96

Hình 3.28 Phổ MS của isoliensinin N2’-oxyd, isoliensinin N2-oxyd, isoliensinin,

pronuciferin trong mẫu thử tâm Sen, tương ứng điện di đồ CE-MS 97

Hình 3.29 Điện di đồ mẫu thử dịch chiết flavonoid toàn phần tâm Sen, hỗn hợp 06

chuẩn flavonoid ở điều kiện điện di thích hợp 98

Hình 3.30 Sắc ký đồ mẫu hỗn hợp 07 chuẩn alkaloid và mẫu thử dịch chiết alkaloid toàn

phần tâm Sen ở điều kiện sắc ký thích hợp 99

Hình 3.31 Sắc ký đồ mẫu hỗn hợp 06 chuẩn flavonoid và mẫu thử dịch chiết flavonoid

toàn phần tâm Sen ở điều kiện sắc ký thích hợp 100xii

DANH MỤC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 2.1 Sơ đồ trình tự các nội dung nghiên cứu 29

Sơ đồ 2.2 Chiết xuất cao toàn phần và các phân đoạn alkaloid, flavonoid từ lá Sen

bằng chiết phân bố lỏng-lỏng 31

Sơ đồ 2.3 Chiết xuất cao toàn phần và các phân đoạn alkaloid, flavonoid từ

tâm Sen bằng chiết phân bố lỏng-lỏng 32

Sơ đồ 2.4 Chiết xuất cao N từ cắn B bằng phương pháp tạo tủa với TT Bertrand 33

Sơ đồ 3.2 Qui trình chiết alkaloid toàn phần mẫu nguyên liệu lá Sen 87

Sơ đồ 3.3 Qui trình chiết flavonoid toàn phần mẫu nguyên liệu lá Sen 91

MỞ ĐẦU

Có nhiều con đường để tạo ra thuốc phục vụ điều trị và chăm sóc sức khỏe

con người, trong đó các thuốc có nguồn gốc từ tự nhiên là một lĩnh vực được các

nhà nghiên cứu phát triển dược phẩm trên thế giới quan tâm, nghiên cứu bởi

nhiều lợi thế của chúng Có nhiều cách tiếp cận trong phát triển thuốc có nguồn gốc

tự nhiên Đó là phát hiện các hoạt chất và phát triển chúng theo các tiêu chuẩn của

dược phẩm hiện đại phương tây và chứng minh tác dụng của dược liệu, bài thuốccủa y học cổ truyền như là một thể thống nhất như nó vốn có và dùng các kỹ thuậthiện đại để đảm bảo, nâng cao hiệu quả điều trị của chúng Với xu hướng này,

những cây thuốc lâu nay được sử dụng theo kinh nghiệm dân gian, trong y học cổtruyền, bên cạnh việc được đánh giá tác dụng trị liệu, đang rất được quan tâm

nghiên cứu về thành phần hóa học cũng như các phương pháp theo dõi, đánh giáthành phần, hàm lượng các chất chính, để có thể đánh giá, đảm bảo chất lượng, tiêuchuẩn hóa cho các sản phẩm, sử dụng trong chăm sóc sức khỏe một cách an toàn,hiệu quả và khoa học

Việt Nam được thiên nhiên ban tặng một thảm thực vật xanh rộng khắp trên

mọi miền đất nước, là điều kiện rất thuận lợi trong việc nghiên cứu và phát triển cácthuốc có nguồn gốc dược thảo Trong kho tàng cây thuốc Việt Nam, cây Sen

( Nelumbo nucifera Gaertn., Nelumbonaceae) đã gắn liền với cuộc sống tâm linh

cũng như thường nhật của người Việt Sen tượng trưng cho sự tinh khiết và trườngthọ, nhưng cũng hết sức bình dị và hữu dụng trong cuộc sống hàng ngày Sen có ởkhắp mọi miền đất nước, nhưng phổ biến nhất có lẽ ở vùng Miền tây Nam bộ mànổi tiếng nhất là ở Đồng Tháp Mười, nơi được xem là xứ sở Sen Sen là một trong

số ít các dược thảo mà tất cả các bộ phận đều được sử dụng và đều là những vịthuốc quí, có giá trị Danh y Hải Thượng Lãn Ông đã viết: “Cây mọc từ dưới bùnđen mà không ô nhiễm mùi bùn, đượm khí thơm trong lành của trời đất nên củ, lá,hoa, tua, vỏ quả, ruột đều là thuốc hay” Từ xưa nhân dân ta đã biết dùng ngó Sen,quả Sen làm thực phẩm Lá Sen, tâm Sen, gương Sen, nhị Sen dùng làm thuốc cổ1

truyền để điều trị mất ngủ, hồi hộp, cao huyết áp, tiêu chảy mãn tính, cảm nắng, béo

phì, di tinh, cầm máu[1],[3],[8].

Các nghiên cứu dược lý đã chứng minh dịch chiết lá Sen có nhiều hoạt tính

sinh học in vivo như: an thần [45], chống béo phì [66], [103], , giảm cholesterol

trong máu [33], [38], [78], chống oxy hóa [27],[70], hạ đường huyết [25],[65], chống lại sựphát triển của tế bào ung thư [64]…Dịch chiết tâm Sen có hoạt tính an thần [104],

hạ đường huyết[25],[96], hạ huyết áp[88], chống loạn nhịp tim [30],[108], ức chế kết tậptiểu cầu [100], kháng HIV [99] Các hoạt tính sinh học này ít nhiều đều liên quan đến

sự hiện diện của thành phần alkaloid và flavonoid có trong lá, tâm Sen

Ngày nay, với sự tiến bộ của khoa học chiết tách và phân tích, trên thế giới đã có

những công trình nghiên cứu về thành phần hóa học và phân tích định tính,

định lượng một số thành phần alkaloid, flavonoid trong lá, tâm Sen Trong lĩnh vực

phân tích cũng đã có một vài nghiên cứu của các tác giả Trung quốc và Ấn độ ứng

dụng phương pháp HPLC, CE để định lượng một vài chất trong số các thành phần

chính của Sen trong dược liệu, chế phẩm hay dịch sinh học

Tại Việt Nam hiện nay, việc sử dụng lá, tâm Sen trong điều trị bệnh ngày càng

trở nên phổ biến Thế nhưng các công trình nghiên cứu về thành phần hóa học,

cũng như các phương pháp định tính, định lượng các chất chính có trong lá, tâm Sen

bằng các phương pháp phân tích hóa lý hiện còn rất hạn chế Do đó, việc nghiên

cứu thành phần hóa học alkaloid, flavonoid và thiết lập các chất đối chiếu phục vụ

cho việc định tính, định lượng alkaloid, flavonoid có tác dụng sinh học trong lá, tâm

Sen Việt Nam là một việc làm cấp thiết

Với những lý do trên, đề tài “Nghiên cứu ứng dụng phương pháp sắc ký để

phân tích thành phần alkaloid, flavonoid của lá, tâm Sen và các chế phẩm”

được thực hiện với các mục tiêu nghiên cứu sau:

1 Chiết xuất, phân lập, xác định cấu trúc các alkaloid, flavonoid từ lá và tâm Senbằng phương pháp sắc ký và phổ nghiệm.

2 Thiết lập và xây dựng tiêu chuẩn một số alkaloid, flavonoid có tác dụng sinh học

để dùng làm chất đối chiếu phục vụ cho công tác kiểm nghiệm

2

3 Xây dựng các qui trình định tính điểm chỉ, định lượng đồng thời các alkaloid,flavonoid có trong lá, tâm Sen bằng các phương pháp HPLC và CE

4 Áp dụng các phương pháp đã xây dựng để định tính, đánh giá thành phần,

hàm lượng các alkaloid và flavonoid trong lá, tâm Sen được thu hái từ các tỉnh,thành khác nhau và trong chế phẩm từ Sen có trên thị trường

3

CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU

THỰC VẬT HỌC VỀ SEN

1.1.1 Chi Nelumbo và vị trí phân loại của chi

Chi Nelumbo thuộc họ Sen- Nelumbonaceae trước đây được xếp cùng với

họ Súng- Nymphaeaceae Tuy nhiên, ngày nay được tách ra riêng thành họ Sen,

với một chi duy nhất là Nelumbo với hai loài Nelumbo nucifera Gaertn., (Sen hồng,

phổ biến ở Việt Nam và một số nước Châu Á như Trung quốc, Ấn độ, Srilanka,

Nhật Bản, Thái Lan, Úc) và Nelumbo lutea Willd (Sen trắng, phổ biến ở

Đông Bắc Mỹ )[1],[8]

Theo hệ thống phân loại APG II năm 2003 và của Amen Takhtajan năm 2009 [14],

vị trí phân loại của chi Nelumbo được trình bày trong Bảng 1.1.

Bảng 1.1 Vị trí phân loại của chi Nelumbo

Nelumbonaceae

Chi

Nelumbo

1.1.2 Cây Sen - Nelumbo nucifera

Loài Sen Nelumbo nucifera Gaertn., có một số đồng danh khác là: Nelumbium nelumbo (L.) Druce, Nelumbium nuciferum Gaertn., Nelumbium speciosum Willd.

Trong tiếng Việt, Sen còn được biết với tên là Sen hồng, Liên Trong tiếng Anh,Sen được gọi với tên thông dụng nhất là lotus nhưng còn được biết với các tên khácnhư Chinese water - lily, Indian lotus, Egypian bean.[3]

Nelumbo nucifera Gaertn., Nelumbo lutea Willd.,

Hình 1.1 Hình ảnh loài Sen hồng và Sen trắng (nguồn: Wikipedia)

có gai nhỏ, đính ở giữa phiến lá, mép lá uốn lượn Hoa rất đẹp, rộng tới 20 – 30 cm,màu hồng tím, trắng có mùi thơm Hoa đều, lưỡng tính Lá đài 4 - 5, cánh hoa nhiều,hướng lên và trải ra, nhị nhiều bao phấn hai ô, nứt theo kẽ dọc Nhiều lá noãn chứatrong một đế hoa loe ra thành hình nón ngược gọi là gương Sen, mỗi lá noãn có1-2 tiểu noãn Quả bế màu xanh hình bầu dục, rời nằm sâu trên gương Sen chứa

15 - 25 quả bế, chứa một hạt không nội nhũ.

Hạt màu trắng, dài 1,3 - 1,5 cm, phần ngoài mỏng và cứng, màu lục tía, phần giữa

mềm chứa tinh bột màu trắng ngà và bên trong là lá mầm dầy có màu xanh sẫm

(tâm Sen) Tâm Sen gồm rễ mầm, thân mầm, chồi mầm và 2 lá đầu tiên; rễ mầm

không rõ; thân mầm màu xanh, dài 3 - 4 mm, tiết diện bầu dục, nhẵn bóng, 2 lá

đầu tiên, 1 to, 1 nhỏ, cuống lá mầm màu xanh, hình móc câu, tiết diện đa giác, dài

1,8 - 2 cm, phiến lá mầm hai mép cuộn vào giữa tạo thành một đoạn dài 6-7 mm

Các loài trong chi Nelumbo có hoa giống với các loài hoa Súng trong họ

Nymphaeaceae (họ Súng) Tuy nhiên, lá của các loài Sen có thể phân biệt được với

lá của các loài trong họ Súng do có hình khiên (lá tròn), trong khi đó Nymphaeaceae

có vết khía hình chữ V đặc trưng từ mép lá vào tâm của lá Quả ở trung tâm

chứa hạt của các loài cũng có đặc trưng phân biệt và được gọi là bát Sen [1],[3],[7],[8]

1.1.2.2 Sinh thái - phân bố

Trong thời kỳ cổ đại, Sen đã từng là loại cây mọc phổ biến dọc theo bờ sông Nile ở

Ai Cập cùng với một loài hoa súng có quan hệ họ hàng gần gũi có tên gọi dài dòng

là hoa Sen xanh linh thiêng sông Nile ( Nymphaea caerulea) Từ Ai Cập, Sen đã được đem đến vùnglãnh thổ Assyria và sau đó được trồng rộng rãi khắp các vùng

Ba Tư, Ấn Độ và Trung Quốc

5

Hiện nay, Sen được phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới Châu Á, Úc và Châu Mỹ,

hiếm hoặc đã tuyệt chủng tại Châu Phi Do ưa khí hậu nóng và ẩm của vùng nhiệt

đới, nên Sen cũng được trồng nhiều ở hầu hết các nước khu vực

Đông Nam Á đến Nam Á như: Campuchia, Thái Lan, Malysia, Ấn Độ và các tỉnh

phía nam Trung Quốc [3]

Ở Việt Nam, chỉ có một loài mọc hoang dại chủ yếu ở vùng Đồng Tháp Mười thuộc

tỉnh Đồng Tháp và An Giang Theo nhân dân địa phương cây Sen mọc trong trạng

thái tự nhiên đã có từ lâu đời Bên cạnh quần thể hoang dại, Sen cũng là cây trồng

quen thuộc ở các tỉnh đồng bằng và trung du, suốt từ Nam đến Bắc, dùng làm thuốc,

thức ăn và làm cảnh Sen được trồng nhiều nhất ở Đồng Tháp Mùa hoa: tháng 5 - 6,

mùa quả: tháng 7 – 9 [8]

1.1.2.3 Đặc điểm vi học

Lá: Biểu bì trên gồm một lớp tế bào hình chữ nhật nhỏ, mặt ngoài có núm lồi lên,

có lỗ khí Biểu bì dưới giống biểu bì trên, nhưng tế bào dài hơn, vách hóa mô cứng,

cutin dày Mô mềm giậu có một lớp tế bào xếp sát biểu bì trên, chạy từ phiến lá

xuyên qua gân giữa Mô dày góc gồm nhiều tế bào đa giác gần tròn, xếp thành đám

sát biểu bì dưới Ở giữa gân có 2 bó libe gỗ to, những bó libe gỗ nhỏ xếp rải rác

xung quanh Mỗi bó libe gỗ có sợi bao bọc, gỗ phía trên, libe phía dưới, bao quanh

là 1- 2 lớp tế bào hình đa giác, kích thước nhỏ, hóa mô cứng thành vòng [7]

Bột dược liệu

Bột lá Sen: có màu lục nhạt, soi kính hiển vi quan sát thấy các đặc điểm sau [6]:

Mảnh biểu bì trên gồm nhiều tế bào hình nhiều cạnh, kích thước không đều, màng ít

ngoằn ngoèo, mang lỗ khí ở dạng biến thiên Màng phía ngoài biểu bì có nhiều núm

lồi lên Núm nhìn phía dưới mặt là những vòng tròn nhò, rải rác có những núm bị

tách khỏi biểu bì, hình ba cạnh hay hình chuông Mảnh biểu bì dưới gồm tế bào

màng ngoằn ngoèo Sợi màng hơi dày, khoang rộng kèm mảnh mạch Mảnh mạch

vạch, mạch xoắn, mạch mạng Tinh thể calci oxalat hình cầu gai, đường kính 20- 36

µm Mô mềm chứa diệp lục Bột tâm Sen: Bột màu vàng xanh, mảnh mô mềm chứa hạt tinh bột Hạt

tinh bột hình cầu hoặc hình trứng, đường kính 4- 6 µm [2],[7]

6

1.1.2.4 Bộ phận dùng – thu hái và chế biến

Tất cả các bộ phận dùng của cây Sen đều có giá trị sinh học cao, được dùng làmthuốc trong y học cổ truyền và được đưa vào Dược điển một số nước [7],[8]

Lá Sen ( Folium Nelumbinis): lá bánh tẻ, thu hái vào mùa thu, bỏ cuống,

phơi khô Quả ( Fructus Nelumbinis): thu hái lúc quả chín (liên thạch), hạt còn màng

đỏ bên ngoài (liên nhục) Tâm Sen ( Plumula Nelumbinis): chồi mầm trong hạt Sen (liên tâm) Gương Sen ( Receptaculum Nelumbinis): đã lấy quả đem phơi khô

(liên phòng) Tua Sen ( Stamen Nelumbinis): bỏ hạt gạo ở đầu, phơi khô (liên tu) Thân rễ ( Nodus Nelumbinis rhizomatis) còn gọi là liên ngẫu hay ngó Sen,

thu hái quanh năm

1.2 HÓA HỌC VỀ SEN

1.2.1 Hóa học của lá Sen

Lá Sen chứa nhiều hợp chất khác nhau trong đó nhóm alkaloid và flavonoid đượcxem là hai thành phần chính chiếm tỉ lệ tương đối lớn và cho tác dụng sinh học

chủ yếu Ngoài ra, các hợp chất khác như: tanin, saponin, đường khử, các acid

hữu cơ (acid palmitic, acid citric, acid tartric, acid succinic, acid ascorbic,…),

các terpen steroid ( β-sitostenon, stigmasta-4,22-dien-3-on,…), các tinh dầu

lá Sen có cấu trúc isoquinolin bao gồm các phân nhóm aporphin, proaporphin,

benzylisoquinolin và bisbenzylisoquinolin

Alkaloid khung aporphin: các alkaloid có cấu trúc aporphin chiếm phần lớn về tỉ lệ

cũng như số lượng trong alkaloid toàn phần của lá Sen Các alkaloid đã biết thuộcnhóm này được trình bày ở Bảng 1.2

N- nor-nuciferin

C18H19NO2-CH3

-CH3

-CH3

Lirinidin

C18H19NO2-CH3

-H

-CH3

Roemerin

C18H17NO2-CH2-

-CH3

C17H15NO2-CH2-

-H

DehydronuciferinC

Alkaloid khung proaporphin: alkaloid thuộc nhóm này chỉ có một alkaloid là

pronuciferin (C19H21NO3) Chất này có thể chuyển thành nuciferin trong

môi trường acid.[17], [43]

pronuciferin

nuciferin

Alkaloid khung benzylisoquinolin: alkaloid thuộc nhóm này trong lá Sen được biết

với 04 alkaloid điển hình là armepavin, N-norarmepavin, N-methyl coclaurin

Alkaloid khung bisbenzylisoquinolin: alkaloid thuộc nhóm này trong lá Sen được

biết với neferin, isoliensinin với hàm lượng thấp Cấu trúc hai chất này được trìnhbày ở Bảng 1.5[7]

8

Ngoài ra, trong lá Sen còn có cepharadion B và lysicamin [114]

Liriodenin Lysicamin Cepharadion B

Tính chất của một số alkaloid chính trong lá Sen [114], [116]

Nuciferin: dạng base, là tinh thể hình lăng trụ không màu, tnc: 163-164 oC,

góc quay cực ở 27o là +145 o ( c = 0,67 %; EtOH), phát huỳnh quang xanh lục sáng

ở 245 nm Phổ UV có ba cực đại hấp thu trong dung môi EtOH lần lượt là

311 nm, 271 nm và 232 nm với giá trị logɛ lần lượt là 3,83; 4,32 và 4,36

N-nornuciferin: dạng base là một chất lỏng như dầu, dạng muối chlorid là tinh thể không màu, tnc: 156 – 157 oC, góc quay cực ở 27 o là +144 o ( c = 0,5 %; EtOH) Phổ

UV có ba cực đại hấp thu trong dung môi EtOH lần lượt là 311 nm, 271 nm, 230

nm với giá trị logɛ lần lượt là 3,67; 4,43 và 4,37

N-norarmepavin: kết tinh ở dạng muối oxalat là tinh thể hình kim không màu,

t

27

nc: 209 – 210 o C, αD

= + 20 o ( c= 0,2 %; MeOH) Phổ UV có ba cực đại hấp thu

trong dung môi EtOH lần lượt là 254 nm, 283 nm, 227 nm

1.2.1.2 Thành phần flavonoid

Hàm lượng flavonoid toàn phần của lá Sen từ 0,67-0,89 % có khi lên đến

1,64 % tùy theo điều kiện khí hậu, thổ nhưỡng Có khoảng 16 flavonoid đã được

xác định trong lá Sen Flavonoid trong lá Sen thuộc các nhóm flavonol, flavon,

catechin, leucoanthocyanidin, trong đó hàm lượng cao nhất được tìm thấy là

quercetin 3- O-β-D-glucuronid [7], [8]

Nhóm flavonol: Chiếm tỉ lệ lớn trong các flavonoid với hàm lượng nhiều hơn của

các aglycon như: myricetin, quercetin, kaempferol, isorhamnetin và các glycosid

với đường glucosyl, rhamnosyl như: myricetin 3- O-β-D- glucopyranosid, quercitrin,

Nhóm flavon: Các dẫn chất flavon chiếm tỉ lệ nhỏ với hàm lượng thấp của luteolin

và luteolin O-β-D- glucopyranosid [109]

Nhóm catechin: Các dẫn chất catechin điển hình là catechin [7], [29], [39]

Nhóm leucoanthocyanidin: Các dẫn chất leucocyanidin điển hình là

leucodelphenidin, leucocyanidin chiếm hàm lượng rất thấp trong lá Sen [7]

1.2.2 Hóa học của tâm Sen

Hầu hết các nghiên cứu về thành phần hóa học của tâm Sen đều tập trung vào cácalkaloid, là thành phần chính chiếm tỉ lệ lớn và được cho là có nhiều tác dụng sinhhọc nhất trong tâm Sen Chỉ có một vài công trình nghiên cứu về thành phần

flavonoid và các chất khác trong tâm Sen như: asparagin, tanin, triterpen,

đường khử, các acid hữu cơ [7], [8]

1.2.2.1 Thành phần alkaloid của tâm Sen

Tâm Sen có hàm lượng alkaloid toàn phần khoảng từ 0,85 - 0,96 % và thay đổi

theo điều kiện khí hậu, thổ nhưỡng Có khoảng 12 alkaloid được biết trong tâm Sen,bao gồm các alkaloid khung bisbenzylisoquinolin, tetrahydroisoquinolin,

benzylisoquinolin, aporphin, proaporphin Hàm lượng alkaloid cao nhất trong tâm

Sen, được tìm thấy là isoliensinin hoặc neferin tùy vùng khí hậu và thổ nhưỡng[7],[8]

Alkaloid khung benzylisoquinolin: Các alkaloid thuộc nhóm này được trình bày

Tính chất của một số alkaloid phân lập từ tâm Sen [34],[36],[110]

Neferin: Công thức phân tử: C38 H44N2O6 Khối lượng phân tử: 624,77 Bột kết tinh

màu trắng, tnc: 60 – 61 oC Góc quay cực: -100 o ( c = 0,24 %; MeOH).

Neferin dạng base tan nhiều trong dung môi hữu cơ kém phân cực, kém tan

trong nước, max: 282 nm (MeOH)

Liensinin: Công thức phân tử: C37H42N2O6 Khối lượng phân tử: 610,74 Dạng rắn màu trắng vô định hình, tnc: 95 – 99 o C Góc quay cực: +15,85 o ( c = 0,88 %;

aceton) Liensinin dạng base tan nhiều trong dung môi hữu cơ kém phân cực,

kém tan trong nước, max: 278 nm (MeOH)

Isoliensinin: Công thức phân tử: C37H42N2O6 Khối lượng phân tử: 610,74.

Dầu không màu hoặc tinh thể vàng nhạt tnc: 69 – 71 oC Góc quay cực: +50,68 o

( c = 0,30 %; aceton) Isoliensinin dạng base tan nhiều trong dung môi hữu cơ

kém phân cực, kém tan trong nước, max: 284 nm (MeOH)

11

1.2.2.2 Thành phần flavonoid

Cho đến nay, mới chỉ có một vài nghiên cứu về thành phần flavonoid trong tâm Sen.Các flavonoid được biết trong tâm Sen thuộc nhóm flavonol (rutin, kaempferol,

hyperin) và nhóm catechin (catechin) [16],[24].

1.3 CHIẾT XUẤT VÀ PHÂN LẬP CÁC THÀNH PHẦN ALKALOID VÀ

FLAVONOID TRONG LÁ, TÂM SEN

Đã có nhiều công trình nghiên cứu trên thế giới về chiết xuất và phân lập các

alkaloid, flavonoid trong lá, tâm Sen bằng nhiều kỹ thuật khác nhau, từ những kỹthuật đơn giản đến phức tạp, như được trình bày trong Bảng 1.6

Bảng 1.6 Tóm tắt các nghiên cứu về chiết xuất phân lập alkaloid, flavonoid trong

lá và tâm Sen

STT

Hợp chất phân lập được

Kỹ thuật ứng dụng

Phân lập alkaloid từ lá Sen loài Nelumbo lutea Willd.

Phân lập nuciferin và N-nornuciferin

oxalat và sắc ký cột (pha tĩnh: alumina

trung tính, pha động: aceton- methanol)

Phân lập được (±)-armepavin bằng sắc

ký lớp mỏng chế hóa kết hợp sắc ký cột

với điều kiện sắc ký như phân lập (-)-

Nuciferin, nor-nuciferin, roemerin

Sắc ký cột cổ điển pha thuận

4

[83]

dl-Armepavin

Sắc ký cột cổ điển pha thuận

Pronuciferin, liriodenin, annonain, Sắc ký cột cổ điển pha thuận5

7

[6],[9]

Nuciferin

Sắc ký cột cổ điển pha thuận

Sắc ký cột với với các loại pha tĩnh khác

(R)-Coclaurin, N-methyl coclaurin,

nhau: Dianion HP20, Sephadex LH- 20,8