Nghiên cứu một số phương pháp sắc ký ứng dụng theo dõi hàm lượng chất đối chiếu được phân lập từ bưởi non

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƢỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH PHẠM NGỌC LIÊN NGHIÊN CỨU MỘT SỐ PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ ỨNG DỤNG THEO DÕI HÀM LƢỢNG CHẤT ĐỐI CHIẾU ĐƢỢC PHÂN LẬP TỪ BƢỞI NON LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2022 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƢỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH PHẠM NGỌC LIÊN NGHIÊN CỨU MỘT SỐ PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ ỨNG DỤNG THEO DÕI HÀM LƢỢNG CHẤT ĐỐI CHIẾU ĐƢỢC PHÂN LẬP TỪ BƢỞI NON NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT MÃ SỐ: 8720210 LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS DS NGUYỄN HỮU LẠC THỦY THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2022 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận văn thân thực với hướng dẫn Cô TS DS Nguyễn Hữu Lạc Thủy Các kết nghiên cứu trình bày luận văn trung thực hồn tồn khách quan Tơi hồn tồn chịu trách nhiệm lời cam đoan Tác giả luận văn Phạm Ngọc Liên BẢNG TÓM TẮT LUẬN VĂN BẰNG TIẾNG VIỆT Mở đầu: dược liệu bưởi non ngày phát triển cần nghiên cứu thành phần flavonoid Mục tiêu: đề tài phân lập thiết lập chất đối chiếu naringin từ bưởi non; nghiên cứu quy trình định lượng khảo sát thay đổi hàm lượng naringin, hesperin bưởi non Phƣơng pháp: chiết xuất phương pháp ngấm kiệt, tinh chế kỹ thuật kết tinh lại; xác định cấu trúc chất tinh khiết đo phổ UV-Vis, IR, NMR, MS; xây dựng tiêu chuẩn chất lượng để đánh giá chất tinh khiết Khảo sát điều kiện khối phổ, điều kiện sắc ký, điều kiện điện di để xây dựng quy trình định lượng naringin hesperdin phương pháp LC-MS/MS, HPLC-PDA, CE-PDA Khảo sát bưởi non theo tháng tuổi phương pháp HPLC-PDA Kết quả: thu phổ chất phân lập gồm phổ UV-Vis, IR, NMR, MS; so sánh liệu phổ với chất đối chiếu tài liệu tham khảo; chất phân lập xác định hàm lượng naringin, đạt tiêu để thiết lập chất đối chiếu Xây dựng quy trình định lượng đồng thời naringin, hesperidin Khảo sát bưởi non từ 0,5 đến tháng tuổi, hàm lượng naringin hesperidin giảm Kết luận: phân lập 10,82 g naringin (BN01) từ bưởi da xanh non tỉnh Bến Tre, thiết lập chất đối chiếu: 100 lọ, 50 mg/lọ Xây dựng thẩm định đạt yêu cầu quy trình định lượng đồng thời naringin, hesperidin phương pháp LC-MS/MS, HPLC-PDA, CE-PDA Khảo sát bưởi non từ 0,5 đến tháng tuổi, hàm lượng naringin giảm từ 233,0 mg/g xuống 19,6 mg/g bưởi tháng tuổi; hesperidin từ 1,7 mg/g xuống 0,4 mg/g bưởi tháng tuổi Hàm lượng hesperidin bưởi tháng tuổi giới hạn định lượng đầu dị PDA Từ khóa: phân lập naringin từ bưởi non, định lượng naringin hesperidin, khảo sát hàm lượng naringin hesperidin BẢNG TÓM TẮT LUẬN VĂN BẰNG TIẾNG ANH Introduction: Medicinal materials from young pomelo are increasingly developed and need to be researched on the main flavonoid components Aims: The study isolates and establish naringin as reference substance from young pomelo; research the quantitative procedure and investigate the change in naringin, hesperin content in young pomelo Method: Extract components of young pomelo by percolation, refined by recrystallization technique; determine the structure of the pure substance by measuring UV-Vis, IR, NMR, MS; develop quality standards to evaluate pure substance Investigation of mass spectrometry, chromatography, and electrophoresis conditions to develop quantitative processes for naringin and hesperdin by LCMS/MS, HPLC-PDA, CE-PDA methods Investigate young pomelo monthly by HPLC-PDA method Results: The resulted spectra of isolates including UV-Vis, IR, NMR, MS spectra were compared to reference standard substance and reference materials; isolated substances were determined with naringin content, meeting the criteria to establish a reference substance Develop three simultaneous quantification procedures for naringin and hesperidin Investigate young pomelo from 0.5 to months old, the content of naringin and hesperidin are both decreased Conclusion: Isolation of 10.82 g of naringin (BN01) from young green-skinned pomelo in Ben Tre province, establish reference substance: 100 vials, 50 mg/vial Developing and validating simultaneous quantification processes for of naringin and hesperidin by methods of LC-MS/MS, HPLC-PDA, CE-PDA Investigate young pomelo from 0.5 to months old, naringin content decreased from 233.0 mg/g to 19.6 mg/g in months old pomelo; hesperidin from 1.7 mg/g to 0.4 mg/g in months old pomelo The hesperidin content in pomelo over months old was lower the limit of quantification of the PDA detector MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT i DANH MỤC HÌNH ii DANH MỤC SƠ ĐỒ iii DANH MỤC BẢNG iv MỞ ĐẦU CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan bưởi 1.2 Nghiên cứu chiết xuất, phân lập hợp chất từ bưởi 1.3 Một số phương pháp phân tích naringin hesperidin 10 CHƢƠNG ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP 18 2.1 Đối tượng nghiên cứu .18 2.2 Phương pháp nghiên cứu 20 2.2.1 Chiết xuất, phân lập, tinh chế chất tinh khiết từ bưởi non .20 2.2.2 Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng thiết lập chất đối chiếu từ bưởi non .22 2.2.3 Xây dựng quy trình định lượng đồng thời naringin hesperidin phương pháp sắc ký lỏng đầu dò MS/MS 25 2.2.4 Xây dựng quy trình định lượng đồng thời naringin hesperidin phương pháp sắc ký lỏng đầu dò PDA 26 2.2.5 Xây dựng quy trình định lượng đồng thời naringin hesperidin phương pháp điện di mao quản đầu dò PDA 27 2.2.6 Ứng dụng khảo sát thay đổi hàm lượng naringin hesperidin bưởi non thu hái theo tháng tuổi .28 CHƢƠNG KẾT QUẢ 29 3.1 Chiết xuất phân lập chất tinh khiết từ bưởi non 29 3.2 Tiêu chuẩn chất đối chiếu thiết lập chất đối chiếu 37 3.3 Quy trình định lượng đồng thời naringin hesperidin bưởi non phương pháp LC-MS/MS 48 3.4 Quy trình định lượng đồng thời naringin hesperidin bưởi non phương pháp HPLC-PDA 58 3.5 Quy trình định lượng đồng thời naringin hesperidin bột bưởi non phương pháp CE-PDA 67 3.6 Khảo sát thay đổi hàm lượng naringin hesperin bưởi non thu hái theo tháng tuổi 81 CHƢƠNG BÀN LUẬN .83 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 86 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC i DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Viết tắt BN CĐC CE EOF ESI GTAĐ GTCB Tiếng Anh HPLC Tiếng Việt Capillary electrophoresis Electroosmotic flow Electrospray ionization Bưởi non Chất đối chiếu Điện di mao quản Dòng điện thẩm Phun điện Giá trị ấn định Giá trị công bố High Performance Chromatography Sắc ký lỏng hiệu cao Liquid Hội nghị quốc tế hài hịa hóa International Conference on thủ tục đăng ký dược phẩm Harmonization sử dụng cho người Infrared Hồng ngoại Internal standard Chuẩn nội Coupling constant Hằng số ghép Capacity factor Hệ số dung lượng Liquid chromatography Sắc ký lỏng - khối phổ hai lần tandem mass spectrometry Limit of detection Giới hạn phát Limit of quantification Giới hạn định lượng Number of theoretical plates Số đĩa lý thuyết Nuclear magnetic resonance Cộng hưởng từ hạt nhân Photodiode array Dãy diod quang Parts per billion Phần tỷ Parts per million Phần triệu Quadrupole Vùng va chạm Resolution Độ phân giải Area Diện tích pic Sắc ký đồ Sắc ký lớp mỏng Migration time Thời gian di chuyển Total phenolic contents Tổng lượng phenolic Retention time Thời gian lưu ICH IR IS J k’ LC-MS/MS LOD LOQ N NMR PDA ppb ppm Q2 RS S SKĐ SKLM tM TPC tR ii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Bưởi - Citrus grandis Hình 1.2 Cấu trúc naringin 10 Hình 1.3 Cấu trúc hesperidin .10 Hình 2.1 Bưởi non mặt cắt ngang bưởi non 18 Hình 2.2 Nguyên liệu BN bột BN .18 Hình 2.3 Thiết bị chiết ngấm kiệt 21 Hình 3.1 Sản phẩm phân lập, tinh chế chất tinh khiết .29 Hình 3.2 Kết kiểm tra độ tinh khiết SKLM hệ dung mơi 30 Hình 3.3 Sắc ký đồ mẫu chuẩn mẫu thử BN01 31 Hình 3.4 Phổ UV-Vis hợp chất BN01 CĐC naringin 32 Hình 3.5 Phổ IR hợp chất BN01 32 Hình 3.6 Phổ MS hợp chất BN01 34 Hình 3.7 Cấu trúc naringin 34 Hình 3.8 Phổ 1H-NMR hợp chất BN01 .35 Hình 3.9 Phổ 13C-NMR hợp chất BN01 35 Hình 3.10 SKĐ khảo sát pha động 39 Hình 3.11 Sắc ký đồ khảo sát dung mơi pha mẫu 40 Hình 3.12 Sắc ký đồ thử nghiệm độ đặc hiệu 42 Hình 3.13 Đồ thị tương quan nồng độ C S pic naringin 43 Hình 3.14 Phổ ion mẹ [M-H]-, phổ ion tương ứng naringin, hesperidin 48 Hình 3.15 Sắc ký đồ khảo sát cột sắc ký C18 C8 49 Hình 3.16 SKĐ khảo sát pha động 49 Hình 3.17 Sắc ký đồ thử nghiệm độ đặc hiệu 52 Hình 3.18 Phổ MS thử nghiệm độ đặc hiệu .53 Hình 3.19 Đồ thị tương quan C S pic naringin, hesperidin 54 Hình 3.20 Sắc ký đồ khảo sát cột C8 C18 .58 Hình 3.21 Sắc ký đồ khảo sát pha động 59 Hình 3.22 Sắc ký đồ thử nghiệm độ đặc hiệu 61 iii Hình 3.23 Đồ thị biểu diễn tương quan nồng độ 63 Hình 3.24 Điện di đồ khảo sát chuẩn nội 67 Hình 3.25 Điện di đồ bước sóng 254 nm 283 nm 67 Hình 3.26 Điện di đồ khảo sát nồng độ dung dịch điện di 68 Hình 3.27 Điện di đồ khảo sát pH dung dịch điện di 69 Hình 3.28 Điện di đồ khảo sát loại dung môi hữu dung dịch điện di 70 Hình 3.29 Điện di đồ khảo sát tỷ lệ dung môi hữu dung dịch điện di 70 Hình 3.30 Điện di đồ khảo sát điện 71 Hình 3.31 Điện di đồ thử nghiệm độ đặc hiệu 74 Hình 3.32 Đồ thị tương quan nồng độ tỷ số diện tích pic naringin, hesperidin so với chuẩn nội 76 Hình 3.33 Mặt cắt ngang bưởi theo tháng tuổi 81 Hình 3.34 Đồ thị tương quan tháng tuổi 82 DANH MỤC SƠ ĐỒ Sơ đồ 2.1 Sơ đồ tổng quát phân lập flavonoid từ BN .20 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL 71 Phụ lục 26: Khoảng tuyến tính- phương pháp CE-PDA Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL 72 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL 73 Phụ lục 27: Độ xác - phương pháp CE-PDA Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL 74 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL 75 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL 76 Phụ lục 28: LOD LOQ - phương pháp CE-PDA Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL 77 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL 78 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL 79 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL 80 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL 81 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL 82 Phụ lục 29: Độ - phương pháp CE-PDA Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL 83 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL 84 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL 85 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn