Nghiên cứu tác dụng chống béo phì, chống rối loạn lipid và bảo vệ gan trên chuột nhắt của cao chiết từ bưởi non được tiêu chuẩn hóa

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH NGUYỄN THỊ DIỆU HIỀN NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CHỐNG BÉO PHÌ, CHỐNG RỐI LOẠN LIPID VÀ BẢO VỆ GAN TRÊN CHUỘT NHẮT CỦA CAO CHIẾT TỪ BƯỞI NON ĐƯỢC TIÊU CHUẨN HÓA LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2022 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH NGUYỄN THỊ DIỆU HIỀN NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CHỐNG BÉO PHÌ, CHỐNG RỐI LOẠN LIPID VÀ BẢO VỆ GAN TRÊN CHUỘT NHẮT CỦA CAO CHIẾT TỪ BƯỞI NON ĐƯỢC TIÊU CHUẨN HÓA NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT MÃ SỐ: 8720210 LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS NGUYỄN HỮU LẠC THỦY THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2022 LỜI CAM ĐOAN Tơi hồn thành luận văn hướng dẫn khoa học Cô TS Nguyễn Hữu Lạc Thuỷ Tôi xin cam đoan số liệu, kết trình bày luận văn trung thực, khách quan chưa công bố cơng trình khác Mọi giúp đỡ cho việc thực luận văn cảm ơn thơng tin trích dẫn luận văn ghi rõ nguồn gốc Tác giả luận văn Nguyễn Thị Diệu Hiền TÓM TẮT Đặt vấn đề Trong y học cổ truyền, bưởi non (BN) Citrus grandis (L.) Osbeck có tác dụng hạ mỡ gan, mỡ máu, giảm cân, Việc nghiên cứu tác dụng sinh học BN cần thiết để có sở khoa học cho việc sử dụng thuốc lâm sàng Tiến hành xây dựng quy trình chiết xuất cao BN quy mơ cơng nghiệp tiêu chuẩn hóa cao BN trước thử tác dụng sinh học đảm bảo kết đánh giá tác dụng sinh học ổn định Đồng thời, tiêu chuẩn chất lượng cao bưởi non giúp kiểm sốt chất lượng q trình sản xuất cao thành phẩm thuốc chứa cao dược liệu Đối tượng phương pháp nghiên cứu Đối tượng: cao chiết từ bưởi non Citrus grandis (L.) Osbeck, Rutaceae Phương pháp nghiên cứu: khảo sát xây dựng quy trình chiết xuất cao bưởi non; xây dựng quy trình định lượng đồng thời naringin hai chất bảo quản (natri benzoat kali sorbat) cao bưởi non; tiêu chuẩn hóa cao bưởi non làm nguyên liệu sản xuất thuốc; thử độc tính cấp đánh giá tác dụng chống béo phì, chống rối loạn lipid, bảo vệ gan cao bưởi non Kết Xây dựng quy trình chiết xuất cao bưởi non cho hiệu suất (34,53 %) hàm lượng naringin (21,77 %) ổn định Xây dựng thẩm định thành cơng quy trình định lượng đồng thời naringin hai chất bảo quản cao bưởi non phương pháp sắc ký lỏng Quy trình chưa cơng bố trước Xây dựng tiêu chuẩn sở cao bưởi non làm nguyên liệu sản xuất thuốc với tiêu: tính chất, tro toàn phần, giới hạn kim loại nặng, dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật, giới hạn chất bảo quản, giới hạn nhiễm khuẩn, định tính định lượng Thử nghiệm tác dụng sinh học cao bưởi non bao gồm: thử nghiệm độc tính cấp cao bưởi non (ở liều tối đa qua kim 13,084 g/kg, cao BN khơng có độc tính cấp); thử nghiệm tác dụng bảo vệ gan cao bưởi non (trên mơ hình gây tổn thương gan chuột CCl4, cao BN hỗ trợ trình phục hồi gan, giúp giảm tỉ lệ hoại tử gan); thử nghiệm tác dụng chống rối loạn lipid máu cao bưởi non (trên mơ hình gây rối loạn lipid tyloxapol, liều 1,3 g/kg 5,2 g/kg, cao BN có tác dụng làm giảm cholesterol toàn phần triglycerid, liều 5,2 g/kg có tác dụng làm tăng HDL-C giảm LDL-C); thử nghiệm tác dụng chống béo phì cao bưởi non (trên mơ hình gây béo phì cho chuột chế độ ăn giàu chất béo, cao BN làm giảm trọng lượng chuột, làm giảm cholesterol toàn phần triglycerid liều thấp 1,3 g/kg, làm giảm LDL-C làm giảm nhẹ viêm, hoại tử liều 5,2 g/kg) Từ khóa: bưởi non, naringin, HPLC, chống béo phì, chống rối loạn lipid, bảo vệ gan ABSTRACT Introduction In traditional medicine, immature pomelo Citrus grandis (L.) Osbeck has the effect of reducing the lipid levels in blood and liver and losing weight, etc The study of the biological effects of immature pomelo is necessary to provide a scientific basis for clinical application Developing a process for extracting immature pomelo on industrial scale and standardizing immature pomelo extract before testing for biological effects ensures stable results of biological effect assessment Besides, the quality standards of immature pomelo extract help control the quality in production process of herbal extract and finished herbal product Method Developing a process for extracting immature pomelo extract; developing an analytical method to simultaneously determine naringin and two preservatives (sodium benzoate and potassium sorbate) in immature pomelo extract; standardization of immature pomelo extract; Acute toxicity test and evaluation of antiobesity, antidyslipidemic and hepatoprotective effects of immature pomelo extract Result The process of extracting immature pomelo extract has been developed for stable results of efficiency (34,53%) and content of naringin (21,77%) Developing and validating successfully the analytical method to simultaneously determine naringin and two preservatives in immature pomelo extract by high performance liquid chromatography The procedure has never been published before Establishing standard for immature pomelo extract as raw material for drug production with criterias: property, total ash, limits for heavy metals, limits for pesticide residues, limits for preservatives, microbiological limits, quality and quantity Testing biological effects of immature pomelo extract, including: acute toxicity test of immature pomelo extract (at the maximum dose through the needle of 13,084 g/kg, immature pomelo extract had no acute toxicity); testing the hepatoprotective effect of immature pomelo extract (on a model of liver damage in mice with CCl4, immature pomelo extract supported the liver recovery process, helped to reduce the rate of liver necrosis); testing the antidyslipidemic effect of immature pomelo extract (on a dyslipidemic model by tyloxapol, at doses of 1,3 g/kg and 5,2 g/kg, immature pomelo extract had the effect of reducing total cholesterol and triglyceride, at dose of 5,2 g/kg had the effect of increasing HDL-C level and reducing LDL-C level); testing the antiobesity effect of immature pomelo extract (on a model of obesity in mice with a high-fat diet, immature pomelo extract reduced the weight of mice, reduced total cholesterol and triglyceride even at the low dose 1,3 g/kg, decreased LDL-C level and slightly reduced liver inflammation and necrosis at the dose of 5,2 g/kg) Keywords: immature pomelo extract, naringin, HPLC, antiobesity, antidyslipidemia, hepatoprotection i MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ii DANH MỤC HÌNH iv DANH MỤC BẢNG vi MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN .3 1.1 Tổng quan thực vật học bưởi 1.2 Thành phần hóa học bưởi 1.3 Tác dụng dược lý bưởi 1.4 Tổng quan cao thuốc 1.5 Chiết xuất định lượng flavonoid từ bưởi 11 1.6 Mơ hình gây tổn thương gan CCl4 13 1.7 Mơ hình gây rối loạn lipid máu tyloxapol .15 1.8 Mơ hình gây béo phì chế độ ăn giàu chất béo .16 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU .18 2.2 DUNG MƠI, HĨA CHẤT - THIẾT BỊ - ĐỘNG VẬT THỬ NGHIỆM 18 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.3.1 Khảo sát xây dựng quy trình chiết xuất cao bưởi non 20 2.3.2 Xây dựng quy trình định lượng đồng thời naringin hai chất bảo quản cao bưởi non phương pháp HPLC 21 2.3.3 Tiêu chuẩn hóa cao bưởi non 25 2.3.4 Đánh giá tác dụng sinh học cao bưởi non 27 CHƯƠNG KẾT QUẢ 31 3.1 Kết xây dựng quy trình chiết cao bưởi non .31 3.2 Quy trình định lượng đồng thời naringin hai chất bảo quản cao bưởi non phương pháp HPLC .34 3.3 Tiêu chuẩn hóa cao bưởi non 53 3.4 Đánh giá tác dụng sinh học cao bưởi non .61 CHƯƠNG BÀN LUẬN .70 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 75 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC ii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tiếng Anh ADN Acid deoxyribonucleic ALP Alkaline phosphatase ALT Alanine transaminase AST Aspartate transaminase Bưởi non BN DPPH Tiếng Việt 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl Ferric reducing antioxidant power Lực chống oxy hóa phương pháp khử sắt HDL High density lipoprotein Lipoprotein tỷ trọng cao HFD High Fat Diet Chế độ ăn nhiều chất béo HMG-CoA 3-hydroxy-3-methyl-glutarylcoenzyme A HPLC High performance liquid chromatography Sắc ký lỏng hiệu cao ICH International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use Hội đồng quốc tế hài hòa yêu cầu kỹ thuật dược phẩm dùng cho người i.p Intraperitoneal Tiêm màng bụng i.v Intravenus Tiêm tĩnh mạch LC Liquid chromatography Sắc ký lỏng LD50 Lethal dose 50% Liều gây chết 50% đối tượng thử LDL Low density lipoprotein Lipoprotein tỷ trọng thấp FRAP Kiểm nghiệm viên KNV MS Mass spectrometry Khối phổ NASH Non alcoholic steatohepatitis Viêm gan nhiễm mỡ không rượu PDA Photo diode array Dãy diod quang Rs Resolution Độ phân giải iii RSD Relative Standard Deviation Độ lệch chuẩn tương đối s.c Subcutaneously Tiêm da SKĐ Sắc ký đồ SKLM Sắc ký lớp mỏng Trolox capacity Tf Tailing factor Hệ số bất đối tR Retention time Thời gian lưu TC Total cholesterol Cholesterol tổng TG Triglyceride VLDL Very low density lipoprotein equivalent antioxidant Khả chống oxy hóa tương đương Trolox TEAC Lipoprotein tỷ trọng thấp Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-5 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-6 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-7 Phụ lục Tính tuyến tính Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-8 Phụ lục Độ lặp lại Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-9 Phụ lục Độ xác trung gian Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-10 Phụ lục Độ Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-11 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-12 Phụ lục Trọng lượng chuột (g) lơ thử nghiệm độc tính cấp Lô Ngày Chuột Chuột Chuột Chuột Chuột Sinh lý 19,5 20,5 20,5 20,0 19,6 20,6 21,3 21,7 22,1 21,6 22,1 22,5 23,9 23,7 22,7 23,7 24,7 25,5 24,2 23,6 23,9 24,7 25,5 24,2 23,6 24,0 24,8 25,7 24,5 23,6 24,1 25,0 25,6 24,6 23,6 24,1 25,0 25,8 24,8 23,6 24,4 25,9 26,2 25,3 24,0 10 24,7 26,5 26,7 26,1 25,1 11 25,0 27,1 27,2 26,6 25,2 12 25,5 27,4 27,5 27,2 25,4 13 25,9 27,8 28,0 27,6 26,1 14 26,1 28,5 28,3 28,4 26,5 21,7 20,8 19,9 21,9 20,3 22,5 23,5 21,2 22,2 22,1 22,9 25,2 23,1 22,5 23,6 23,3 26,0 24,1 23,0 24,5 23,9 26,2 24,1 23,5 24,5 24,1 26,3 24,1 24,1 24,7 24,5 26,6 24,2 24,4 24,6 24,6 26,6 24,2 24,5 24,7 25,3 26,9 24,6 24,5 24,8 10 25,7 27,5 24,9 24,7 24,7 11 26,0 28,0 25,6 24,7 25,0 12 26,3 28,3 26,2 24,8 25,1 13 27,0 28,8 27,0 25,3 25,6 14 27,8 29,0 27,8 25,8 26,2 Cao BN Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-13 Phụ lục Kết ALT, AST nhóm chuột thử nghiệm bảo vệ gan thời điểm ngày ngày Nhóm Trắng CCl4 BN70A BN70B Silymarin D1 D7 Chuột ALT (IU/L) AST (IU/L) ALT (IU/L) AST (IU/L) 182,8 132,1 97,8 101,5 135,7 50,4 114,6 138,9 112,1 58,8 109,6 146,8 118,6 46,8 133,0 145,0 138,9 37,4 120,7 136,7 5440,8 3381,8 86,3 146,1 2411,1 1591,3 109,9 129,4 3792,0 2424,1 121,2 439,4 2960,3 1239,7 115,0 167,4 1063,3 666,1 110,7 160,2 2646,0 2009,9 103,3 100,4 2561,5 2184,1 95,8 109,6 7358,7 4369,5 79,9 97,0 2957,0 1472,5 99,5 101,8 5269,5 3261,0 125,4 167,5 2559,6 2273,7 111,8 283,1 4794,7 3010,0 112,2 205,6 1699,5 738,6 100,0 135,9 613,9 618,3 83,8 120,3 3092,8 1808,3 91,3 133,9 1670,1 867,9 116,7 99,1 1033,6 735,3 77,1 73,9 895,6 924,2 98,3 143,9 1406,2 1141,3 79,4 133,7 2155,4 2395,6 63,3 135,6 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-14 Phụ lục Trọng lượng chuột (g) nhóm thử nghiệm chống rối loạn lipid cấp thời gian nuôi ổn định (thời điểm ngày ngày) Thời điểm Ngày Ngày Chuột Trắng Bệnh BN70A BN70B Atorvastatin 8 16,6 14,9 17,8 17,8 17,2 15,8 17,2 16,7 20,3 21,2 21,1 23,6 23,1 19,7 20,1 22,2 16,2 12,9 16,9 17,6 16,8 15,7 17,9 17,5 21,1 22,1 21,0 22,7 23,5 23,2 18,3 20,5 17,4 17,6 15,4 17,5 18,7 16,0 16,3 16,4 21,0 20,6 24,1 19,2 21,0 24,3 20,1 22,8 14,7 16,0 21,0 15,9 17,9 15,9 17,6 17,6 23,3 23,1 22,8 24,5 23,1 20,9 24,5 20,1 17,1 15,5 13,7 15,7 14,2 17,2 15,4 16,1 26,5 21,1 19,1 20,4 19,8 19,5 20,5 21,6 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-15 Phụ lục 10 Kết số lipid huyết nhóm chuột thử nghiệm chống rối loạn lipid cấp Nhóm Chuột Cholesterol (mmol/L) Triglycerid (mmol/L) HDL-C (mmol/L) LDL-C (mmol/L) Trắng 2,50 2,31 2,31 1,13 2,40 2,19 2,56 1,03 2,31 0,72 2,65 0,95 2,28 2,32 2,16 1,07 2,27 3,54 2,06 0,96 2,25 1,85 2,43 0,86 2,11 2,21 2,00 1,13 1,71 3,35 1,75 0,84 10,82 38,80 0,23 0,93 8,56 21,20 0,68 1,64 6,31 21,47 2,25 0,88 5,66 18,43 0,51 1,09 3,22 10,20 0,70 0,95 2,70 1,65 2,57 1,02 2,59 5,93 1,02 0,97 10,84 17,96 0,69 3,94 7,02 18,77 0,52 1,17 4,13 6,09 0,56 1,86 2,89 2,88 2,08 0,93 2,69 2,98 1,23 1,31 2,62 2,12 2,37 1,03 2,21 5,86 0,87 1,13 2,11 2,92 1,77 0,94 1,75 2,35 1,42 0,83 3,51 4,06 3,17 1,02 3,45 2,20 3,36 0,96 2,59 1,69 2,81 0,85 Bệnh BN70A BN70B Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-16 Atorvastatin 2,55 2,59 2,67 0,87 2,43 1,61 2,60 0,88 2,38 1,53 2,60 0,82 2,08 1,11 2,37 0,86 1,62 1,20 2,11 0,85 5,18 14,13 0,43 1,14 2,25 1,65 2,20 0,75 1,85 3,44 0,74 1,20 1,76 1,58 1,93 0,95 1,55 1,43 0,59 1,25 1,47 2,14 1,53 0,80 1,30 1,08 1,88 0,72 1,13 2,22 0,80 0,82 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-17 Phụ lục 11 Trọng lượng chuột (g) giai đoạn thử nghiệm chống béo phì Thời điểm Bắt đầu Sau tuần Chuột Trắng Bệnh BN70A BN70B Orlistat 26,3 35,1 37,0 42,4 38,80 23,6 35,1 39,2 34,9 37,90 22,5 35,9 34,2 40,8 37,90 24,1 31,5 38,1 34,7 36,90 25,7 35,9 38,8 40,0 36,30 22,9 35,9 38,1 37,7 33,90 23,8 35,4 36,4 39,0 36,20 25,3 35,5 35,2 36,4 35,30 24,6 42,0 30,5 25,0 28,4 25,2 34,3 31,1 34,6 33,3 32,3 34,6 25,5 32,5 33,8 29,3 42,3 27,1 30,4 35,1 30,8 41,0 29,7 27,8 28,2 25,7 31,9 32,5 28,1 34,4 26,2 35,4 32,7 32,3 36,8 29,9 35,9 34,5 35,7 28,4 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-18 Phụ lục 12 Kết số lipid huyết nhóm chuột thử nghiệm chống béo phì Nhóm Chuột Cholesterol (mmol/L) Triglycerid (mmol/L) LDL-C (mmol/L) Trắng 1,22 1,25 0,28 1,88 1,31 0,54 1,53 0,97 0,55 1,29 0,73 0,24 1,22 1,48 0,20 1,25 0,87 0,29 0,91 0,87 0,15 1,30 0,63 0,25 3,78 1,85 0,78 3,91 2,22 0,73 4,30 1,59 0,72 3,92 2,33 0,59 4,38 1,52 0,64 2,12 2,74 0,43 2,55 1,86 0,46 2,86 1,92 0,43 1,88 0,84 0,74 2,48 0,90 0,78 1,35 2,27 0,34 2,13 1,74 0,53 2,22 1,95 0,51 1,54 1,06 0,4 2,00 1,32 0,42 1,55 1,59 0,40 0,93 0,80 0,27 1,83 0,79 0,53 0,71 0,81 0,32 Bệnh BN70A BN70B Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL-19 Orlistat 1,47 0,95 0,32 0,32 1,32 0,13 1,62 1,27 0,31 2,76 0,97 0,63 1,66 0,53 0,7 0,73 1,07 0,34 1,01 1,04 0,23 1,19 1,08 0,35 1,73 0,81 0,53 3,03 3,3 0,52 1,67 1,58 0,39 1,90 1,00 0,36 1,71 2,73 0,25 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn