[Kl-Hup] Nghiên Cứu Thành Phần Hóa Học Và Đánh Giá Tác Dụng Bảo Vệ Gan Trên Mô Hình Gây Viêm Gan Cấp Bằng Paracetamol Của Cao Chiết Một Loài Ngũ Vị Tử Thu Hái Ở Ngọc Linh.pdf

BỘ YTÉ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI Lưu VIỆT HOÀNG NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG BẢO VỆ GAN TRÊN MÔ HÌNH GÂY VIÊM GAN CẤP BẢNG PARACETAMOL CỦA CAO CHIẾT MỘT LOÀI NGŨ VỊ TỬ THU HÁI Ở[.]

BỘ YTÉ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI Lưu VIỆT HỒNG NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HĨA HỌC VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG BẢO VỆ GAN TRÊN MƠ HÌNH GÂY VIÊM GAN CẤP BẢNG PARACETAMOL CỦA CAO CHIẾT MỘT LOÀI NGŨ VỊ TỬ THU HÁI Ở NGỌC LINH KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC sĩ HÀ NỘI - 2022 BỘ YTẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI Lưu VIỆT HOÀNG MÃ SINH VIÊN:1701211 NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG BẢO VỆ GAN TRÊN MƠ HÌNH GÂY VIÊM GAN CÁP BẰNG PARACETAMOL CỦA CAO CHIẾT MỘT LOÀI NGŨ VỊ TỬ THU HÁI Ở NGỌC LINH KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC sĩ Người hướng dẫn: TS ĐÀO THỊ THANH HIỀN ThS NGUYỄN THỊ PHƯỢNG Nơi thực hiện: Viện Dược liệu HÀ NỘI - 2022 LỜI CAM ƠN Trong suốt trình học tập hồn thiện khóa luận tốt nghiệp khoa Dược lý Hóa sinh khoa Hóa phân tích - Tiêu chn Viện Dược liệu, em nhận giúp đỡ, động viên vô lớn từ thầy cô, anh chị, bạn bè gia đình Lời đầu tiền em xin trân trọng cảm ơn Ban giảm hiệu, Phòng đào tạo trường Đại học Dược Hà Nội; khoa Dược lý - Hóa sinh, khoa Hóa Phân tích - Tiêu chuẩn Viện Dược liệu tạo điểu kiện cho em tham gia học tập hồn thành khóa luận suốt thời gian qua Đặc biệt em xin gửi tới lời cảm ơn chân thành sâu sắc tới ThS Nguyễn Thị Phượng khoa Dược lý - Hóa sinh Viện Dược liệu, cô người trực tiếp hướng dẫn, giúp đỡ, dìu dắt em xuyên suốt trình thực đề tài khóa luận tốt nghiệp Tiếp đến em xin cảm ơn TS Hà Vân Oanh môn Dược học cổ truyền trường Đại học Dược Hà Nội Cô tạo điều kiện cho phép em tiếp cận tham gia nghiên cứu khoa học, cảm ơn động viên quan tâm sát cô trình em hồn thành khóa luận tốt nghiệp Em xỉn gửi lời cảm ơn tới TS Đào Thị Thanh Hiền giúp đỡ em trình hồn thành đề tài khóa luận tốt nghiệp Em xỉn cảm ơn TS Nguyễn Thị Hà Ly khoa Hóa phân tích - Tiêu chuẩn Viện Dược liệu tạo điều kiện tối đa sở vật chất cho em hoàn thành việc nghiên cứu thực nghiệm đề tài khóa luận tốt nghiệp Trong suốt thời gian học tập nghiên cứu, em nhận giúp đỡ to lớn từ anh Nguyễn Văn Hiệp, chị Trần Thị Hồng Vân anh chị khoa Dược lý - Hóa Sinh khoa Hỏa Phân tích - Tiêu chuẩn Viện Dược liệu Cuối em xỉn bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè ln đồng hành suốt trình học tập công tác, chẽ dựa vững vật chất lần tinh thần em gặp khỏ khăn sống Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 27 tháng năm 2022 Sinh viên Lưu Việt Hoàng MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan Ngũ vị tử .2 1.1.1 Thực vật học 1.1.2 Thành phần hóa học 1.1.3 Tác dụng công dụng y học cổ truyền 1.1.4 Các nghiên cứu hoạt tính sinh học 1.2 Mơ hình gây viêm gan cấp 10 1.2.1 Các mơ hình gây tổn thương gan cấp 10 1.2.2 Mơ hình gây viêm gan cấp paracetamol 11 1.2.3 Mơ hình gây viêm gan tác nhân CC14 .12 1.2.3 Các thông số đánh giá .12 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu 13 2.1 Đối tượng nghiên cứu 13 2.1.1 Nguyên liệu 13 2.1.2 Hóa chất 13 2.1.3 Trang thiết bị nghiên cứu 14 2.1.4 Động vật nghiên cứu 14 2.2 Nội dung nghiên cứu 15 2.3 Phương pháp nghiên cứu 15 2.3.1 Phương pháp định tính nhóm chất thường gặp mẫu dược liệu 15 2.3.2 Phương pháp định lượng polyphenol, flavonoid có mẫu cao dược liệu 17 2.3.3 Nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan Ngũ vị tử 20 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN cứu 23 3.1 Kết định tính nhóm chất hữu thường gặp Ngũ vị tử 23 3.2 Kết định lượng số hoạt chất Ngũ vị tử 25 3.2.1 Xác định hàm ấm mẫu cao dược liệu 25 3.2.2 Định lượng polyphenol 25 3.2.3 Định lượng flavonoid 27 3.3 Kết đánh giá tác dụng bảo vệ gan mơ hình gây viêm gan cấp paracetamol .28 3.3.1 Kết hình ảnh gan đại thể 28 3.3.2 Kết đo hoạt độ AST 29 3.3.3 Kết đo hoạt độ ALT 30 3.3.4 Kết định lượng TBARs 31 3.3.5 Kết định lượng GSH 32 CHƯƠNG BÀN LUẬN 34 4.1 kết định tính nhóm chất dược liệu Ngũ vị tử Ngọc Linh 34 4.2 kết định lượng polyphenol, flavonoid 34 4.3 tác dụng bảo vệ gan cao chiết Ngũ vị tử Ngọc Linh 34 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XƯÂT 36 Kết luận 36 Đề xuất 36 TÀI LIỆU ■ THAM KHẢO: DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIÉT TẲT Chữ, kí hiệu viết tắt Ý nghĩa chữ viết đầy đủ ALT Alanine aminotransferase AST Aspartate aminotransferase Caki-1 CC14 Dòng tế bào ung thư biểu mô thận người Carbontetraclorid CMC Carboxymethyl cellulose CNVT Cao chiết Ngũ vị tử DPHH gốc tự diphenyl picryl hydrazinyl DTNB 5,5-dithio-bis-(2-nitrobenzoic acid) GSH Glutathion HDL High density lipoprotein cholesterol HepG2 Dòng tế bào ung thư gan người IC50 Nồng độ ức chế tối đa nửa LDL Low density lipoprotein cholesterol MDA Malondialdehyde NAFLD Viêm gan nhiễm mỡ không rượu NAPQI N-acetyl-p-benzoquinoneimine PAR Paracetamol PC3, MCF7 Dòng tế bào ung thư vú người SCP-O-1,SCPP11 Polysaccharide từ khô S.chỉnensỉs SGPT Glutamate-pyruvate transaminase (ALT) SOD Superoxide dismutase TBA Acid thiobarbituric TBARs TC Các chất phản ứng với acid thiobarbituric Total cholesterol TG Triglycerid DANH MỤC CÁC BANG Bảng 1.1 Các hợp chất phân lập từ Schisandra sphenanthera Bảng 2.1 Các chất độc với gan dùng để gây tổn thương gan thực nghiệm chuột 11 Bảng 3.1 Kết định tính nhóm chất Ngũ vị tử Ngọc Linh 24 Bảng 3.2 Kết xác định hàm ẩm mẫu cao dược liệu 25 Bảng 3.3 Kết xây dựng đường chuẩn polyphenol 25 Bảng 3.4 Kết định lượng polyphenol 26 Bảng 3.5 Kết xây dựng đường chuẩn flavonoid 27 Bảng 3.6 Kết định lượng flavonoid 28 Bảng 3.7 Ảnh hưởng CNVT lên hoạt độ AST huyết chuột 29 Bảng 3.8 Ành hưởng CNVT lên hoạt độ ALT huyết chuột 30 Bảng 3.9 Ảnh hưởng CNVT lên giá trị TB ARs gan chuột 31 Bảng 3.10 Ảnh hưởng CNVT lên giá trị GSH gan chuột 32 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Một số hình ảnh Ngũ vị tử thu vùng núi Ngọc Linh Hình 1.2 Cấu trúc lignan dibenzocyclooctadien từ Schisandra sphenanthera Hình 1.3 Cấu trúc lignan khác từ Schỉsandra sphenanthera Hình 1.4 Cấu trúc triterpene S.sphenanthera Hình 1.5 Cấu trúc hóa học nortriterpenoid lignan phân lập từ s sphenanthera Hình 2.1 Quy trình bào chế cao chiết cồn Ngũ vị tử Ngọc Linh 13 Hình 3.1 Kết định tính nhóm chất Ngũ vị tử Ngọc Linh 24 Hình 3.2 Đường chuẩn polyphenol 26 Hình 3.3 Đường chuẩn flavonoid 27 Hình 3.4 Hình ảnh gan đại thể lơ chuột 29 Hình 3.5 Kết phân tích hoạt độ AST 30 Hình 3.6 Kết phân tích hoạt độ ALT 31 Hình 3.7 Kết phân tích hàm lượng TBARs 32 Hình 3.8 Kết phân tích hàm lượng GSH 33 ĐẶT VẤN ĐÈ Chi Schisandra (Ngũ vị tử) có khoảng 22-25 lồi phân bố giới chủ yếu tìm thấy Trung Quốc [12], [16], [39] Trước năm 2000, Việt Nam phát loài Schisandra cocinea Schisandra sinensis với tên gọi chung Ngũ vị tử phân bố chủ yếu tỉnh biên giới giáp với Trung Quốc Lào Cai Lai Châu [2] Năm 2006, Viện Dược liệu cơng bố lồi Ngũ vị tử Schỉsandra sphenanthera Rehd.et Wils, tìm thấy vùng núi Ngọc Linh thuộc địa phận hai tỉnh Kon Turn Quảng Nam Trong y học cố truyền Ngũ vị tử vị thuốc bổ giúp phục hồi sức khỏe, trị lỵ, lậu, cảm lạnh, say nóng, viêm phế quản, hen phế quản, chữa ho, liệt dương, [1], [2J Hiện nghiên cứu xác định thành phần hóa học Schisandra sphenanthera hợp chất lignan, cịn có chứa thành phần tinh dầu, triterpene, acid hữu cơ, [l], [2], [13] Một số nghiên cứu tác dụng dược lý Schisandra sphenanthera có tác dụng ức chế tế bào ung thư, chống oxy hóa, [11], [14] Tuy nhiên Ngũ vị tử Ngọc Linh (Schisandra sphenanthera) loài tương đối Việt Nam nghiên cứu thành phần hóa học tác dụng dược lý tương đối hạn chế Theo thống kê Bộ Y tế, Việt Nam có khoảng triệu người mắc vấn đề gan có viêm gan Do nhu cầu chăm sóc chi phí điều trị lớn Trên giới có nhiều sản phấm chiết xuất từ Ngũ vị tử có tác dụng bảo vệ gan Tuy nhiên Việt Nam có nghiên cứu chun sâu tác dụng bảo vệ gan từ Ngũ vị tử Điều bỏ phí hội phát triển sản phẩm tiềm điều trị viêm gan có tác dụng, an tồn chi phí thấp từ vị dược liệu quý Việt Nam Từ nhừng vấn đề trên, đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học đánh giá tác dụng bảo vệ gan mơ hình gây viêm gan cấp paracetamol cao chiết loài Ngũ vị tử thu hái Ngọc Linh” thực với mục tiêu nghiên cứu thành phần hóa học làm sáng tỏ tác dụng bảo vệ gan cao chiết Ngũ vị tử Nội dung nghiên cứu đề tài bao gồm: Định tính nhóm chất có dược liệu Ngũ vị tử phản ứng hóa học đặc trưng Định lượng số hoạt chất có cao chiết Ngũ vị tử Đánh giá tác dụng bảo vệ gan cao chiết Ngũ vị tử mơ hình gây viêm gan cấp Paracetamol CHƯƠNG TỐNG QUAN 1.1 Tổng quan Ngũ vị tử Ngọc Linh 1.1.1 Thực • vật • học • 1.1.1.1 Vị trí phân loại Ngũ vị tử thu hái Ngọc Linh, Việt Nam có tên khoa học Schỉsandra sphenanthera Rehd.et Wils., thuộc chi Ngũ vị tử (Schisandrà), họ Ngũ vị (Schisandraceae), Hồi (Illiciales), phân lớp Hồng liên (Rancunulidae), lóp Hai mầm (Dicotyledones), ngành Hạt kín (Angiospermae) B A c Hình 1.1 Một sơ hình ảnh Ngũ vị tử thu vùng núi Ngọc Linh (A - Quả chưa chín; B: Hoa; C: Quả chỉn) 1.1.1.2 Đặc diêm thực vật Ngũ vị tử Ngọc Linh (Schisandra sphenanthera Rehd.et Wils.) loại thân leo gỗ, dài - m rụng vào mùa khơ (tháng 10-11) Tồn khơng lơng, gặp gân, mặt non có lơng nhỏ mềm thưa thớt Khi đâm chồi (tháng 2) vẩy chồi có lơng mềm Cành nhỏ có mầu hồng cánh gián Thân cành có nốt sần, cành non có cạnh Lá mọc so le, hình trứng đảo, rộng phía cuối lá, gốc hình nêm, đỉnh nhọn, kích thước trung bình dài 5-11 cm, rộng 3-7 cm Mặt xanh đậm, mặt nhạt mầu Mép có cưa thơ phía cuối Lá có gân hình lơng chim Cuống mầu hồng nhạt, dài 2-3 cm Gân 4-5 đôi, lồi mặt dưới, lõm mặt Hoa đơn tính, khác gốc, tràng có 6-9 cánh, màu vàng trắng, có mùi thơm, nhị Hoa mọc nách lá, cuống dài 2-4 cm, gốc có phiến bao (vẩy) dài 3-4 mm Cánh hoa 5-9 màu cam, hình trứng đảo dạng trịn dài, kích thước 6-12x58 mm Hoa đực nhị nhiều, thành bó hình trứng đảo, đường kính 4-5mm Đe hoa lồi hình trụ trịn, nhị nhiều, ô phấn hướng nội, ô Hoa có 30-60 tâm bì tập họp thành 3.2.3 Định lượng flavonoid 3.2.3.1 Xây dựng đường chuân Kết thề Bảng 3.5 Hình 3.3 Bảng 3.5 Kêt xây dựng đường chuân flavonoid Mẩu Chuẩn (Catechin) Khối lưựng Thể tích pha Nồng độ c Độ hấp phụ cân (mg) loãng (ml) (mg/ml) Abs 0,108 0,332 0,216 0,629 0,432 1,275 0,864 2,528 1,08 3,368 10,8 10 Đường chuẩn Flavonoid y =: 3,0762x - 0,0348 • 3/368 R2 = 0,9974 • 2,528 • 1,275 • 0,629 • 0,332 0,2 0,4 0,6 0,8 1,2 Hình 3.3 Đường chuẩn flavonoid Phương trình đường chuẩn flavonoid: y = 3.0762 - 0.0348, X nồng độ chất chuẩn (mg/ml); y mật độ quang Độ tuyến tính đường chuẩn đánh giá thông qua hệ số tương quan R2 Kết đánh giá đường chuẩn acid gallic cho thấy R2 lớn 0,99, chứng tở đường chuẩn xây dựng có độ tuyến tính cao đảm bảo đề thực phép phân tích định lượng flavonoid tính theo catechin 3.2.3.2 Kết định lượng Kết định lượng flavonoid thể Bảng 3.6 27 Bảng 3.6 Kêt định lượng flavonoid Khối lượng Mẫu cân (mg) Thể tích Nồng độ c pha lỗng (mg/ml) (ml) Mật độ Hàm quang lượng Abs (%) 196,9 50 0,23594 0,691 6,61 213,5 50 0,264222 0,778 6,83 217,8 50 0,263247 0,775 6,67 6,70 Trung bình Từ kết thu cho thấy cao chiết Ngũ vị tử Ngọc Linh có hàm lượng flavonoid 6,70% 3.3 Kết đánh giá tác dụng bảo vệ gan mơ hình gây viêm gan cấp paracetamol 3.3.1 Kết hình ảnh gan đại thể /Lf ■■ * ' * ■ ; > * Lô 1: Sinh lý Lô 2: Bệnh lý _ Lô 3: Chứng dương Lô 4: CNVT 500 28 Lô 5: CNVT 1000 Hình 3.4 Hình ảnh gan đại thê lơ chuột ọ Nhận xét: Từ Hình 3.4 ta thấy: + Lô (sinh lý): Gan màu sẫm, mặt nhẵn, mềm, không phù nề, không sung huyết + Lô (bệnh lý): Gan bạc màu, bề mặt sần, gan xốp, nhẹ, khối gan to + Lô (chứng dưong): Nhiều gan sẫm màu, có số bạc màu, mặt nhẵn, xốp + Lơ (CNVT 500): Gan bạc màu, số sẫm màu, bề mặt sần, gan xốp + Lô (CNVT 1000): Gan sẫm màu, bạc màu, bề mặt nhẵn, phù nề, sung huyết 3.3.2 Kết đo hoạt độ AST Bảng 3.7 Ảnh huởng CNVT lên hoạt độ AST huyết chuột LƠ Tên lơ lơ n AST (U/l) p Sinh lý 193,3±9,4 pi-2 = 0,000 Bệnh lý 11 2292,3±369.5 Chứng dương 11 1211,8±102,0 p2-3 = 0,042 CNVT 500 1981,6±267,6 P2-4 = 0,950 CNVT 1000 10 1087,7±146,3 P2-5 = 0,010 29 Hoạt độ AST Sinh lý Bệnh lý CNVT500 CNVT1000 Silymarin Hình 3.5 Kết phân tích hoạt độ AST * p