Bộ YTẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI BÙI THỊ MAI HƯƠNG NGHIÊN CỨU THÀNH PHÀN HÓA HỌC VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG KHÁNG VI SINH VẬT CỦA củ HÀNH TĂM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC sĩ HÀ NỘI 2022 Bộ YTÉ TRƯỜNG ĐẠI HỌC[.]
Bộ YTẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI BÙI THỊ MAI HƯƠNG NGHIÊN CỨU THÀNH PHÀN HÓA HỌC VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG KHÁNG VI SINH VẬT CỦA củ HÀNH TĂM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC sĩ HÀ NỘI - 2022 Bộ YTÉ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI BÙI THỊ MAI HƯƠNG Mã sinh viên: 1701238 NGHIÊN CỨU THÀNH PHÀN HÓA HỌC VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG KHÁNG VI SINH VẬT CỦA củ HÀNH TĂM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC sĩ Người hướng dẫn: PGS TS Nguyễn Thái An Nơi thực hiện: Bộ môn Dược liệu Viện Hóa sinh biển - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam HÀ NỘI - 2022 LỜI CẢM ƠN Trong q trình hồn thành khóa luận em nhận đuợc giúp đỡ, hỗ trợ từ nhiều thầy cơ, bạn bè gia đình Với tình cảm chân thành, em xin phép đuợc gửi lời cảm ơn sâu sắc tới tất Thầy Cô, anh chị, bạn, phịng ban mơn Nhà truờng tạo điều kiện cho em suốt trình học tập, nghiên cứu thực đề tài Trước hết, với lịng kính trọng biết ơn, cho phép em gửi lời cảm ơn tới PGS TS Nguyễn Thái An bảo, định hướng, giải đáp thắc mắc, ln dìu dắt em q trình học tập nghiên cứu Em xin chân thành cảm ơn DS Nguyễn Thanh Tùng - Bộ môn Dược liệu, Ths Đỗ Ngọc Quang - Bộ môn Vi sinh & Sinh học, Ths Đỗ Hồng Anh - Viện Hóa sinh biên, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, anh chị Phịng Cơng nghệ sinh học - Viện Hóa sinh biến (Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam) giúp đỡ, hỗ trợ em q trình hồn thành khóa luận Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới toàn thể thầy trường Đại học Dược Hà Nội nói chung, thầy cô anh chị kỹ thuật viên thuộc mơn Dược liệu nói riêng ln tạo điều kiện tốt giúp em trình nghiên cứu Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình bạn bè tin tưởng, nguồn động viên to lớn chỗ dựa tinh thần cho em suốt trình học tập, nghiên cứu trường Hà Nội, ngày 01 tháng 06 năm 2022 Sinh viên Bùi Thị Mai Hương MỤC LỤC DANH MỤC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BÂNG DANH MỤC CÁC HÌNH ĐẶT VÁN ĐỀ CHƯƠNG 1: TỐNG QUAN 1.1 Tên khoa học vị trí, phân loại Hành tăm 1.2 Đặc điểm thực vặt 1.2.1 Đặc điểm hình thái 1.2.2 Đặc điểm sinh thái 1.2.3 Đặc điểm phân bố 1.3 Thành phần hóa học 1.3.1 Flavonoid 1.3.2 Anthocyanin 1.3.3 Tinh dầu 1.3.4 Họp chất phenolic 1.3.5 Steroid 1.4 Tác dụng sinh học 1.4.1 Tác dụng kháng khuẩn 1.4.2 Tác dụng chống oxy hóa 1.4.3 Tác dụng kháng nấm 10 1.4.4 Tác dụng chống giun sán 10 1.4.5 Tác dụng chống viêm 10 1.4.6 Tác dụng hạ huyết áp 11 1.4.7 Tác dụng chống ung thu 11 1.5 Công dụng 12 1.6 Một số thuốc từ Hành tăm 12 1.7 Một số phương pháp đánh giá tác dụng kháng vi sinh vật 13 CHƯƠNG NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu 14 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 14 2.1.1 Nguyên liệu 14 2.1.2 Phương tiện nghiên cứu 14 2.2 Nội dung nghiên cứu 15 2.2.1 Thu mâu Hành tăm xác định hàm luợng tinh dâu mâu nghiên cứu 15 2.2.2 Phân tích thành phần hóa học Hành tăm 16 2.2.3 Phân tích thành phần tinh dầu Hành tăm 16 2.2.4 Đánh giá tác dụng kháng vi sinh vật tinh dầu Hành tăm 16 2.3 Phuơng pháp nghiên cứu 16 2.3.1 Thu mẫu nghiên cứu 16 2.3.2 Xác định hàm luợng nước dược liệu 16 2.3.3 Xác định hàm lượng tinh dầu 16 2.3.4 Định tính sơ nhóm chất thường có dượcliệu 17 2.3.5 Định tính Hành tăm sắc ký lóp mỏng 17 2.3.6 Phân tích thành phần tinh dầu sắc ký lóp mỏng 18 2.3.7 Phân tích thành phần tinh dầu sắc ký khí kết họpkhối phổ (GC/MS) 2.3.8 18 Đánh giá tác dụng kháng vi sinh vật tinh dầu Hành tăm 19 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN cứu 21 3.1 Kết quan sát đặc điểm hình thái mẫu nghiên cứu 21 3.2 Hàm lượng tinh dầu 21 3.2.1 Tiến hành 21 3.2.2 Kết 21 3.3 Định tính nhóm chất thường gặp Hành tăm 22 3.4 Định tính dịch chiết thân (củ) Hành tăm sắc ký lớp mỏng 23 3.4.1 Tiến hành định tính 23 3.4.2 Kết định tính sắc kýlớp mỏng 24 3.5 Kết phân tích tinh dầu sẳc ký ló-pmỏng 27 3.6 Phân tích thành phần tinh dầu sắc ký kết họp khối phổ (GC/MS) 29 3.7 Đánh giá tác dụng kháng vi sinh vật tinh dầu Hành tăm 31 CHƯƠNG BÀN LUẬN 33 KÉT LUẬN 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẤT GC/MS Gas chromatography - Mass spectrometry (Sắc ký khí kết hợp khối phổ) LB Lysogeny broth MIC Minimum inhibitory concentration (Nồng độ ức chế tối thiểu) Rf Retention factor (Hệ số lưu giừ) RI Retention index (Chỉ số lưu giữ) RT Retention time (Thời gian lưu) SKLM Sắc ký lớp mỏng SKĐ Sắc ký đồ TLC Thin layer chromatography (Sắc ký lớp mong) TT Thuốc thử DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1 Hàm lượng tinh dầu mẫu nghiên cứu 21 Bảng 3.2 Kết định tính nhóm chất thường gặp Hành tăm 22 Bảng 3.3 Kết định tính thành phần tinh dầu Hành tăm SKLM sau màu vanilin/H2SO4, quan sát ánh sáng thường 28 Bảng 3.4 Kết phân tích thành phần tinh dầu Hành tăm 29 Bảng 3.5 Giá trị MIC (pg/ml) tinh dầu Hành tăm chủng vi sinh vật kiểm định 32 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 3.1 Ảnh chụp phần thân (củ) Hành tăm {Allium schoenoprasum L.) 21 Hình 3.2 Sắc ký đồ cắn chiết Hành tăm 24 Hình 3.3 Sắc ký đồ cắn tồn phần Hành tăm (HO) 25 Hình 3.4 Sắc ký đồ cắn clorồrm dịch chiết tồn phần Hành tăm(Hl) 26 Hình 3.5 sẳc ký đồ cắn cloroíồrm dịch nước Hành tăm (H2) 27 Hình 3.6 Sắc ký đồ tinh dầu Hành tăm ánh sáng thường sau khihiện màu vanilin/H2SO4 28 Hình 3.7 Sắc ký đồ mẫu tinh dầu Hành tăm 28 Hình 3.8 Sắc ký đồ tinh dầu Hành tăm 31 ĐẶT VẤN ĐÈ Ngày nay, khoa học công nghệ ngày phát triển, bên cạnh thuốc hóa dược, thuốc, vị thuốc dân gian nghiên cứu sử dụng rộng rãi để phòng chữa bệnh Nhiều bệnh truyền nhiễm chữa khởi thuốc có nguồn gốc thảo dược, đặc biệt với trợ giúp khoa học công nghệ giúp xác định chiết xuất hợp chất dùng phòng điều trị bệnh Chi Hành Allium L chi lớn, phân bố rộng rãi Bắc bán cầu Việt Nam với đặc điểm nước nhiệt đới gió mùa, thiên nhiên ưu đãi, dành tặng kho tàng thực vật phong phú, đa dạng lồi thuộc chi Allium L Các loài thuộc chi Allium L từ lâu đà sử dụng phố biến đế làm gia vị, rau ăn Các lồi thuộc chi Allium L cịn giàu chất dinh dưỡng, có khả điều trị phịng ngừa số bệnh rối loạn tiêu hóa, ung thư, béo phì, tim mạch, tăng cholesterol máu Ngồi ra, tinh dầu lồi thuộc chi Allium L cho có khả kháng khuẩn, chống oxy hóa, thành phần giàu họp chất chứa lưu huỳnh, họp chất polyphenol Hành tăm trồng quen thuộc, phổ biến khu vực miền Trung Nghệ An, Hà Tĩnh, Quảng Bình, Quảng Ngãi Cũng giống loài thuộc chi Allium L khác, việc biết đến loại gia vị thơm ngon ăn, Hành tăm cịn vị thuốc sử dụng phổ biến y học cổ truyền thuốc dân gian Một thuốc từ củ Hành tăm người dân hay sử dụng dùng để kích thích tiêu hóa chữa ngộ độc thực phẩm Tác dụng liên quan tới hoạt tính kháng vi sinh vật Hành tăm, nhiên số lượng nghiên cứu khả kháng vi sinh vật loài này, đặc biệt củ tinh dầu Hành tăm hạn chế, Việt Nam Với khả kháng khuẩn tiềm năng, Hành tăm tinh dầu cúa cần nghiên cứu phát triển nhiều tương lai Đẻ góp phần làm phong phú thêm khả ứng dụng Hành tăm nâng cao giá trị tiềm cú Hành tăm, tinh dầu Hành tăm scìĩoenoprasum L., đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học đánh giá tác dụng kháng vi sinh vật củ Hành tăm” thực với mục tiêu sau: - Nghiên cứu thành phần hóa học củ Hành tăm - Nghiên cứu thành phần tinh dầu Hành tăm - Lựa chọn tinh dầu Hành tăm để đánh giá tác dụng kháng vi sinh vật CHƯƠNG 1: TỐNG QUAN 1.1 Tên khoa học vị trí, phân loại Hành tăm Tên thường gặp: Hành trắng, Hành tăm, Ném, Nén, (Việt Nam), Chive (Anh Mỹ) Tên khoa học: Allium schoenoprasum L [6] Theo tài liệu [2], [5], Hành tăm Allium schoenoprasum L thuộc họ Hành (Alliaceae) phân loại [43] sau: Giới thực vật - Plantae Ngành Ngọc Lan - Magnoliophyta Lóp Hành - Liliopsida Bộ Măng Tây - Asparagales Họ Hành - Alliaceae Chi Hành - Allium L Loài - Allium schoenoprasum L Tuy nhiên, theo phân loại APG III, loài thuộc chi Allium L thuộc họ Allỉaceae xếp vào họ Amaryllidaceae phân họ Allioideae [43], [46] Do đó, Hành tăm có phân loại sau: Giới thực vật - Plantae Ngành Ngọc Lan - Magnoliophyta Lớp Hành - Liliopsida Bộ Măng Tây - Asparagales Họ Thủy Tiên - Amaryllidaceae Phân họ - Allioideae Chi Hành - Allium L Loài - Allium schoenoprasum L 1.2 Đặc điểm thực vật 1.2.1 Đặc điểm hình thái Hành tăm thảo nhở, sống lâu năm [5], mọc thành chùm, giống Hành hương (A fistulosum L.), thường cao 10 - 15 cm tới 20 - 30 cm, cao đến 60 cm thành bụi cỡ 30 cm [6] Thân (củ) Hành tăm màu trắng, lớn cỡ đầu ngón tay út hay hạt ngơ, hình nón, thn dài, đường kính khoảng cm, bao bọc vẩy dai (bẹ trắng, chắc, bẹ bên ngồi đơi có màu xám) [2], [22] Các củ mọc gần thành chùm chùm dày đặc [22] Lá nhiều, màu xanh lục đậm, mỏng khoảng 2-3 mm [6] Lá cuống hoa hình trụ rỗng, nhỏ tăm (do gọi Hành tãm) [2], [6] Cụm hoa tán, gần hình đầu, cuống hoa chung, dài 10 - 40 cm, đường kính 2-4 mm Lá bắc tổng mỏng, màu đỏ tím, dài gần cụm hoa Mỗi cụm hoa 23 Hadacek, F., Greger, H (2000), “Testing of antifungal natural products: methodologies, comparability of results and assay choice”, Phytochemical Analysis, 11(3), pp 137-147 24 Justesen, Ư., Knuthsen, p (2001), “Composition of flavonoids in fresh herbs and calculation of flavonoid intake by use of herbs in traditional Danish dishes”, Food Chemistry, 73(2), pp 245-250 25 Kim, J.W., Huh, J.U., Kyung, S.H., Kyung, K.H (2004), “Antimicrobial activity of alk(en)yl sulfides found in essential oils of garlic and onion”, Food Sci Biotechnol, 13(2), pp 235-239 26 Klimpel, s., Abdel-Ghaffar, F., Al-Rasheid, K.A.S., Aksu, G., Fischer, K., Strassen, B., Mehlhorn, H (2010), “The effects of different plant extracts on nematodes”, Parasitology Research, 108(4), pp 1047-1054 27 Kucekova, z., Mlcek, J., Humpolicek, p., Rop, o., Valasek, p., Saha, p (2011), “Phenolic compounds from Allium schoenoprasum, Tragopogon Pratensis and Rumex Acetosa and their antiproliferative effects ”, Molecules, 16(11), pp 92079217 28 Kumia, D., Ajiati, D., Heliawati, L., Sumiarsa, D (2021), “Antioxidant properties and structure-antioxidant activity relationship of Allium species leaves”, Molecules, 26(23), pp 7175 29 Lanzotti, V., Scala, F., Bonanomi, G (2014), “Compounds ỸĩQva Allium species with cytotoxic and antimicrobial activity”, Phytochemistry Reviews, 13(4), pp 769-791 30 Lengbiye, E.M., Mbadiko, C.M., Falanga, C.M., Matondo, A., Inkoto, C.L., Ngoyi, E.M., Kabengele, C.N., Bongo, G.N., Gbolo, B.Z., Kilembe, J.T., Mwanangombo, D.T., Tshibangu, D.S., Tshilanda, D.D., Mihigo, S.O., Ngbolua, K.N., Mpiana, P.T (2020), “Antiviral activity, phytochemistry and toxicology of some medically interesting Allium species: a mini review”, International Journal of Pathogen Research, pp 64-77 31 García, J.L., Kuceková, z., Humpolicek, p., Mlcek, J., Sáha, p (2013), “Polyphenolic extracts of edible flowers incorporated onto atelocollagen matrices and their effect on cell viability”, Molecules, 18(11), pp 13435-13445 32 Mnayer, D., Fabiano T.A.S., Petitcolas, E., Hamieh, T., Nehme, N., Ferrant, c., Fernandez, X., Chemat, F (2014), “Chemical composition, antibacterial and antioxidant activities of six essentials oils from the Alliaceae family”, Molecules, 19(12), pp 20034-20053 33 Najjaa, H., Neffati, M., Zouari, s., Ammar, E (2007), “Essential oil composition and antibacterial activity of different extracts of Allium roseum L., a North African endemic species”, Comptes Rendus Chimie, 10(9), pp 820-826 34 Parvu, A.E., Pârvu, M., Vlase, L., Miclea, p., Mot, A., Silaghi, R.D (2014), “Anti-inflammatory effects of Allium schoenoprasum L leaves”, Journal of physiology and pharmacology : an official journal of the Polish Physiological Society, 65(2), pp 309-315 35 Parvu, M., Rusu, I., Rosea, c.o (2013), “The antifungal activity of Allium schoenoprasum L leaves”, Contrib Bot, 48, pp 75-82 36 Rattanachaikunsopon, p., Phumkhachorn, p (2008), “Diallyl sulfide content and antimicrobial activity against food-borne pathogenic bacteria of chives (Allium schoenoprasum)”, Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 72(11), pp 2987-2991 37 Sanei, D.A., Soleimani, A.M., Abadi, Y.S., Paksa, A (2019), “Wild chive oil is an extremely effective larvicide against malaria mosquito vector Anopheles stephensif Asian Pac J Trop Med, 12(4), pp 170-174 38 Setiawan, V.W., Yu, G.P., Lu, M.L., Yu, S.Z., Mu, L., Zhang, J.G., Kurtz, R.C., Cai, L., Hsieh, C.C., Zhang, Z.F (2005), “Allium vegetables and stomach cancer risk in China”, Asian Pac J Cancer Prev, 6(3), pp 387-395 39 Shirshova, T.I., Beshlei, I.V., Deryagina, V.P., Ryzhova, N.I., Matistov, N.v (2013), “Chemical composition of Allium schoenoprasum leaves and inhibitory effect of their extract on tumor growth in mice”, Pharmaceutical Chemistry Journal, 46(11), pp 672-675 40 Stajner, D., Canadanovic, B.J., Pavlovic, A (2004), “Allium schoenoprasum L., as a natural antioxidant”, Phytotherapy Research, 18(7), pp 522-524 41 Stajner, D., Milic, N., Canadanovic, B.J., Kapor, A., Stajner, M., Popovic, B.M (2006), “Exploring Allium species as a source of potential medicinal agents”, Phytotherapy Research, 20(7), pp 581-584 42 Stajner, D., Popovic, B.M., Calic, D.D., Malencic, Đ., Zdravkovic, K.s (2011), “Comparative study on Allium schoenoprasum cultivated plant and Allium schoenoprasum tissue culture organs antioxidant status”, Phytotherapy Research, 25(11), pp 1618-1622 43 Simpson, M.G (2010), “Diversity and classification of flowering plants”, Plant Systematics, pp 181-274 44 Timité, G., Mitaine-Offer, A.C., Miyamoto, T., Tanaka, c., Mirjolet, J.F., Duchamp, o., Lacaille-Dubois, M.A (2013), “Structure and cytotoxicity of steroidal glycosides from Allium schoenoprasum”, Phytochemistry, 88, pp 61- 66 45 Tran Nguyen An Sa, Nguyen Van Muoi Mot, Nguyen Tri Thue, Nguyen Thi Diem Thu (2019), “GC/MS-TOF analysis of essential oil composition of the Allium schoenoprasum L bulbs cultivated from Quang Tri - Viet Nam ”, Tạp chi Khoa học Công nghệ Thực phẩm, 18(1), pp 12-22 46 Varinder s., Gargi c., Pawan K., Richa s (2018), “Allium schoenoprasum L.: a review of phytochemistry, pharmacology and future directions”, NaturalProduct Research, 32(18), pp 2202-2216 47 Vlase, L., Parvu, M., Parvu, E., Toiu, A (2012), “chemical constituents of three Allium species from Romania”, Molecules, 18(1), pp 114-127 48 You, W.C., Blot, W.J., Chang, Y.S., Ershow, A., Yang, Z.T., An, Q., Wang, T.G (1989), “Allium vegetables and reduced risk of stomach cancer”, JNCI Journal of the National Cancer Institute, 81(2), pp 162-164 49 Zheng, w., Wang, S.Y (2001), “Antioxidant activity and phenolic compounds in selected herbs”, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 49(11), pp 5165-5170 PHỤ LỤC PHỤ LỤC CÁC PHẢN ỨNG ĐỊNH TÍNH HĨA HỌC PHỤ LỤC HÌNH ẢNH CÁC PHẢN ÚNG ĐỊNH TÍNH HĨA HỌC PHỤ LỤC BẢNG KỂT QUẢ ĐỊNH TÍNH CẮN TỒN PHẦN BẰNG SKLM PHỤ LỤC BẢNG KẾT QUẢ ĐỊNH TÍNH CẮN CLOROFORM CỦA DỊCH CHIẾT TOÀN PHÂN BANG SKLM PHỤ LỤC BẢNG KẾT QUẢ ĐỊNH TÍNH CẮN CLOROFORM CỦA DỊCH NƯỚC BẰNG SKLM PHỤ LỤC HÌNH ẢNH SẮC KÝ ĐỒ TINH DẦU HÀNH TĂM PHỤ LỤC CÁC PHẢN ỨNG ĐỊNH TÍNH HĨA HỌC Định tính nhóm chất dịch chiết toàn phần ỉ ỉ Định tỉnh alkaloid Lấy khoảng 5ml dịch chiết cho vào chén sứ đến cắn Hịa tan can khoảng 4ml acid hydroclorid 5%, chia dịch acid vào ống nghiệm nhỏ Định tính alkaloid thuốc thử: Mayer, Bouchardat, Dragendorff - Phản ứng với thuốc thử Mayer: tủa trắng - vàng nhạt - Phản ứng với thuốc thử Bouchardat: tủa dở cam - Phản ứng với thuốc thử Dragendorff: tủa dở gạch So sánh với ống chứng khơng có thuốc thử Nếu dung dịch đục có tủa: Có alkaloid 1.2 Định tính glycosid tim Lấy 20 ml dịch chiết vào cốc có mỏ, thêm khoảng Iml dung dịch chì acetat 30% (TT), khuấy Lọc loại tủa, thủ dịch lọc tủa với chì acetat (TT), cho thêm khoảng 0,5ml dung dịch chì acetat nừa vào dịch chiết, khuấy lọc lại Tiếp tục thử tới dịch chiết khơng cịn tủa với chì acetat Cho tồn dịch lọc vào bình gạn lắc với hỗn hợp cloroform : methanol (4:1) (TT) (3 lần, lằn ml), gạn lớp cloroform vào cốc có mỏ khơ Cho dịch chiết vào ống nghiệm nhỏ, bốc dung môi cách thủy đến khơ cắn cịn lại làm để làm phản ứng định tính sau: - Phản ứng Liebermann - Burchard: Hòa tan cẳn ống nghiệm Iml anhydrid acetic, lẳc Nghiêng ống 45°, cho từ từ theo thành ống 1ml acid sulfuric đặc, tránh làm xáo trộn chất lỏng ống Quan sát thấy mặt tiếp xúc lóp chất lỏng xuất vịng màu tím đỏ, lớp chất lỏng phía duới có màu hồng, lớp màu xanh phản ứng dương tính - Phản ứng Baljet: Hòa tan cắn ống nghiệm 1ml ethanol 90%, lắc đều, nhỏ giọt thuốc thử Baljet pha (1 phần dung dịch acid picric 1%, phần dung dịch NaOH 10%, lắc đều) So sánh màu với ống chứng ống không chứa cắn thử thấy ống thử màu cam đậm chứng tở phản ứng dương tính - Phản ứng Legal: Cho vào ống nghiệm chứa cắn 0,5ml EtOH 90%, lắc Nhỏ giọt TT natri nitroprussiat 0,5% giọt dung dịch NaOH 10% Lắc thấy màu đỏ cam đậm ống chứng (ống không chứa cắn thử) chứng tỏ phản ứng dương tính 1.3 Định tính flavonoid - Phản ứng với dung dịch kiềm: Cho 2ml dịch chiết vào ống nghiệm, thêm 3-5 giọt dung dịch NaOH 10%, đa số flavonoid làm cho dung dịch từ không màu hay vàng nhạt chuyên thành màu vàng hay vàng cam - Phản ứng với dung dịch FeCh 5%: Cho Iml dịch chiết vào ống nghiệm Thêm 23 giọt dung dịch FeCh 5% lắc, thấy xuất tủa xanh lục, xanh nâu chứng tỏ có mặt flavonoid - Phản ứng Cyanidin: Cho Iml dịch chiết vào ống nghiệm, thêm khoảng Omg bột magie kim loại, nhở giọt HC1 đậm đặc Để yên, sau vài phút dung dịch chuyển từ màu vàng sang màu dở chứng tỏ có mặt flavonoid 1.4 Định tính saponin Thí nghiệm tạo bọt: Cho 10ml dịch chiết vào ống nghiệm, bốc hoi dung mơi đến cịn khoảng 5ml Lấy dịch cho vào ống nghiệm lớn chứa sẵn 5ml nước Dùng ngón tay bịt miệng ống lắc mạnh theo chiều thẳng đứng phút Đế yên quan sát tượng tạo bọt Nếu cột bọt bền vững sau 15 phút sơ kết luận dược liệu có saponin 7.5 Định tỉnh đường khử Phản ứng với thuốc thử Fehling: Cho khoảng 0,5ml dịch chiết vào ống nghiệm nhỏ, thêm 0,5ml thuốc thử Fehling A 0,5ml thuốc thử Fehling B Đun sôi cách thủy khoảng 10 phút Phản ứng dương tính xuất kết tủa dở gạch lắng đáy ống nghiệm 1.6 Định tính acid hữu - Thử giấy thị với dịch chiết: chấm vài giọt dịch chiết lên giấy thị so sánh màu giấy thị với bảng màu độ pH - Phản ứng với Na2CCh: Lấy 2ml dịch chiết cho vào ống nghiệm Thêm vào dung dịch tinh thể Na2CƠ3 Nếu có bọt khí nhỏ lên từ tinh thể Na2CƠ3: có acid hữu 7.7 Định tính tanin - Phản ứng với dung dịch gelatin 1%: lấy ml dịch chiết, thêm giọt dung dịch gelatin 1%, xuất tủa bơng trắng chứng tỏ có mặt tanin - Phản ứng với muối kim loại: • Lấy 2ml dịch chiết thêm giọt dung dịch FeCh 5%, xuất tủa xanh đen xanh nâu nhạt chứng tở có mặt tanin • Lấy 2nd dịch chiết thêm giọt dung dịch chì acetate 10%, xuất tủa bơng chứng tỏ có mặt tanin Định tính nhóm chất dịch nưó’c 2.7 Định tính glycosid tim Lấy 20ml dịch nước vào cốc có mỏ, thêm khoảng Iml dung dịch chì acetat 30% (TT), khuấy Lọc loại tủa, thử dịch lọc cịn tủa với chì acetat (TT), cho thêm khoảng 0,5ml dung dịch chì acetat vào dịch chiết, khuấy lọc lại Tiếp tục thử tới dịch chiết khơng cịn tủa với chì acetat Cho tồn dịch lọc vào bình gạn lắc với hỗn hợp cloroform: methanol (4:1) (TT) (3 lần, lần 3ml), gạn lớp cloroform vào cốc có mỏ khơ Cho dịch chiết vào ống nghiệm nhỏ, bốc dung mơi cách thủy đến khơ Cắn cịn lại làm để làm phản ứng định tính sau: - Phản ứng Liebermann - Burchard: Hòa tan cắn ống nghiệm Iml anhydrid acetic, lắc Nghiêng ống 45°, cho từ từ theo thành 1ml acid sulfuric đặc, tránh làm xáo trộn chất lỏng ống Quan sát thấy mặt tiếp xúc lóp chất long xuất vịng màu tím dở, lóp chất lỏng phía có màu hồng, lớp màu xanh phản ứng dương tính - Phản ứng Baljet: Hịa tan cắn ống nghiệm 1ml ethanol 90%, lắc đều, nhỏ giọt thuốc thử Baljet pha (1 phần dung dịch acid picric 1%, phần dung dịch NaOH 10%, lắc đều) So sánh màu với ống chứng ống không chứa cắn chiết thấy ống thử màu cam đậm chứng tỏ phản ứng dương tính - Phản ứng Legal: Cho vào ống nghiệm chứa cắn 0,5ml EtOH 90%, lắc Nhỏ giọt TT natri nitroprussiat 0,5% giọt dung dịch NaOH 10% Lắc thấy màu đỏ cam đậm ống chứng (ống không chứa cắn thử) chứng tỏ phản ứng dương tính 2.2 Định tỉnh alkaloid Lấy khoảng 10ml dịch nước cho vào bình gạn 50ml, kiềm hóa dịch chiết đến pH 10 dung dịch NH4OH 10% chiết cloroform (10ml X lần) Gộp chung rửa lóp dung mơi hữu với 10ml nước cất Lắc lóp cloroform với dung dịch acid hydroclorid 5% (2ml X lần) Chia dung dịch acid vào ống nghiệm nhỏ Định tính alkaloid thuốc thử: Mayer, Bouchardat, Dragendorff - Phản ứng với thuốc thử Mayer: tủa trắng - vàng nhạt - Phản ứng với thuốc thử Bouchardat: tủa cam - Phản ứng với thuốc thử Dragendorff: tủa dở gạch So sánh với chứng khơng có thuốc thử Neu dung dịch đục có tủa: Có alkaloid 2.3 Định tính flavonoid - Phản ứng với dung dịch kiềm: Cho 2ml dịch nước vào ống nghiệm, thêm 3-5 giọt dung dịch NaOH 10%, đa số flavonoid làm cho dung dịch từ không màu hay vàng nhạt chuyển thành màu vàng hay vàng cam - Phản ứng với dung dịch FeCÍ3 5%: Cho Iml dịch nước vào ống nghiệm Thêm 2-3 giọt dung dịch FeCỈ3 5% lắc, thấy xuất tủa xanh lục, xanh nâu chứng tỏ có mặt flavonoid - Phản ứng Cyanidin: Cho Iml dịch nước vào ống nghiệm, thêm khoảng lOmg bột magie kim loại, nhỏ giọt HC1 đậm đặc Đe yên, sau vài phút dung dịch chuyển từ màu vàng sang màu đỏ chứng tỏ có mặt flavonoid 2.4 Định tính saponin Thí nghiệm tạo bọt: Cho 10ml dịch nước vào ống nghiệm, bốc dung mơi đến cịn khoảng 5ml Lấy dịch cho vào ống nghiệm lớn chứa sẵn 5ml nước Dùng ngón tay bịt miệng ống lắc mạnh theo chiều thẳng đứng phút Để yên quan sát tượng tạo bọt Neu cột bọt bền vừng sau 15 phút sơ kết luận dược liệu có saponin 2.5 Định tỉnh tanin - Phản ứng với dung dịch gelatin 1%: lấy 2ml dịch nước, thêm giọt dung dịch gelatin 1%, xuất tủa bơng trắng chứng tỏ có mặt tanin - Phản ứng với muối kim loại: • Lấy ml dịch nước thêm giọt dung dịch FeCh 5%, xuất tủa xanh đen xanh nâu nhạt chứng tỏ có mặt tanin • Lấy ml dịch thêm giọt dung dịch chì acetate 10%, xuất tủa bơng chứng tỏ có mặt tanin 2.6 Định tính đường khử Phản ứng với thuốc thử Fehling: Lấy 5ml dịch chiết cô cách thủy đến cắn Hòa tan cắn cồn 25%, lọc Cho dịch lọc vào ống nghiệm, thêm 0,5ml Fehling A 0,5ml Fehling B Đun sôi cách thủy 10 phút Nếu xuất kết tủa đỏ gạch lắng đáy ống nghiệm: có đường khử 2.7 Định tính acid hữu - Thử giấy thị với dịch chiết: chấm vài giọt dịch chiết lên giấy thị so sánh màu giấy thị với bảng màu độ pH - Phản ứng với NazCCh: Lấy 2ml dịch chiết cho vào ống nghiệm Thêm vào dung dịch tinh thể Na2CƠ3 Nếu có bọt khí nhỏ lên từ tinh thể Na2CƠ3: có acid hữu Định tính nhóm chất dịch chiết bã dưọc liệu 3.1 Định tính alkaloid Lấy khoảng 5ml dịch chiết cho vào chén sứ đến cắn Hịa tan cắn khoảng 4ml dung dịch acid hydroclorid 5%, chia dịch acid vào ống nghiệm nhỏ Định tính alkaloid thuốc thử: Mayer, Bouchardat, Dragendorff - Phản ứng với thuốc thử Mayer: tủa trắng - vàng nhạt - Phản ứng với thuốc thử Bouchardat: tủa đỏ cam - Phản ứng với thuốc thử Dragendorff: tủa dở gạch So sánh với ống chứng khơng có thuốc thử Nếu dung dịch đục có tủa: có alkaloid 3.2 Định tỉnh glycosid tỉm Lấy 20ml dịch chiết vào cốc có mỏ, thêm khoảng Iml dung dịch chì acetat 30% (TT), khuấy Lọc loại tủa, thử dịch lọc tủa với chì acetat (TT), cho thêm khoảng 0,5ml dung dịch chì acetat vào dịch chiết, khuấy lọc lại Tiếp tục thử tới dịch chiết khơng cịn tủa với chì acetat Cho tồn dịch lọc vào bình gạn lắc với hồn hợp cloroform : methanol (4:1) (TT) (3 lần, lần 3ml), gạn lớp cloroíồrm vào cốc có mỏ khơ Cho dịch chiết vào ống nghiệm nhỏ, bốc dung môi cách thủy đến khơ cắn cịn lại làm để làm phản ứng định tính sau: - Phản ứng Liebermann - Burchard: Hòa tan cắn ống nghiệm Iml anhydrid acetic, lắc Nghiêng ống 45°, cho từ từ theo thành ống 1ml acid sulfuric đặc, tránh làm xáo trộn chất lỏng ống Quan sát thấy mặt tiếp xúc lóp chất lỏng xuất vịng màu tím đỏ, lóp chất lỏng phía có màu hồng, lóp màu xanh phản ứng dương tính - Phản ứng Baljet: Hòa tan cắn ống nghiệm 1ml ethanol 90%, lắc đều, nhỏ giọt thuốc thử Baljet pha (1 phần dung dịch acid picric 1%, phần dung dịch NaOH 10%, lắc đều) So sánh màu với ống chứng ống không chứa cắn thử thấy ống thử màu cam đậm chứng tở phản ứng dương tính - Phản ứng Legal: Cho vào ống nghiệm chứa cắn 0,5ml EtOH 90%, lắc Nhở giọt TT natri nitroprussiat 0,5% giọt dung dịch NaOH 10% Lắc thấy màu đỏ cam đậm ống chứng (ống không chứa cắn thử) chứng tỏ phản ứng dương tính 3.3 Định tính flavonoid - Phản ứng với dung dịch kiềm: Cho 2ml dịch chiết vào ống nghiệm, thêm 3-5 giọt dung dịch NaOH 10%, đa số flavonoid làm cho dung dịch từ không màu hay vàng nhạt chuyển thành màu vàng hay vàng cam - Phản ứng với dung dịch FeCh 5%: Cho Iml dịch chiết vào ống nghiệm Thêm 23 giọt dung dịch FeCh 5% lắc, thấy xuất tủa xanh lục, xanh nâu chứng tỏ có mặt flavonoid - Phản ứng Cyanidin: Cho Iml dịch chiết vào ống nghiệm, thêm khoảng Omg bột magie kim loại, nhỏ giọt HC1 dặm đặc Để yên, sau vài phút dung dịch chuyển từ màu vàng sang màu dở chứng tỏ có mặt flavonoid 3.4 Định tính saponin Thí nghiệm tạo bọt: Cho 10ml dịch chiết vào ống nghiệm, bốc dung mơi đến cịn khoảng 5ml Lấy dịch cho vào ống nghiệm lớn chứa sẵn 5ml nước Dùng ngón tay bịt miệng ống lắc mạnh theo chiều thẳng đứng phút Để yên quan sát tượng tạo bọt Nếu cột bọt bền vững sau 15 phút sơ kết luận có saponin 3.5 Định tính đường khử Phản ứng với thuốc thử Fehling: Cho khoảng 0,5ml dịch chiết vào ống nghiệm nhỏ, thêm 0,5ml thuốc thử Fehling A 0,5ml thuốc thử Fehling B Đun sôi cách thủy khoảng 10 phút Phản ứng dương tính xuất kết tủa dở gạch lắng đáy ống nghiệm 3.6 Định tính acid hừu - Thử giấy thị với dịch chiết: chấm vài giọt dịch chiết lên giấy thị so sánh màu giấy thị với bảng màu độ pH - Phản ứng với Na2CƠ3: Lấy 2ml dịch chiết cho vào ống nghiệm Thêm vào dung dịch tinh thể Na2CƠ3 Nếu có bọt khí nhỏ lên từ tinh thể Na2CƠ3: có acid hữu 3.7 Định tính tanin - Phản ứng với dung dịch gelatin 1%: lấy 2ml dịch chiết, thêm giọt dd gelatin 1%, xuất tủa trắng chứng tỏ có mặt tanin - Phản ứng với muối kim loại: • Lấy 2ml dịch chiết thêm giọt dung dịch FeCỈ3 5%, xuất tủa xanh đen xanh nâu nhạt chứng tỏ có mặt tanin • Lấy 2ml dịch chiết thêm giọt dung dịch chì acetate 10%, xuất tủa bơng chứng tỏ có mặt tanin PHỤ LỤC HÌNH ẢNH CÁC PHẢN ỨNG ĐỊNH TÍNH HĨA HỌC Nhóm Phản ứng chất định tính Flavonoid Phản ứng với dung dịch kiềm Phản ứng với dung dịch FeCh 5% Phản ứng Cyanidin Saponin Thí nghiệm tạo bọt Tanin Phản ứng với dung dịch gelatin 1% (1) Phản ứng với dung dịch FeCh 5% (2) Phản ứng với dung dịch chì acetat 10% Đường (3) _ Phản ứng với khử thuốc thử Fehling Acid hữu Thử giấy thị màu Phản ứng với NaiCCh Kết Dịch chiết toàn phần Dịch nước Dịch chiết cồn PHỤ LỤC BẢNG KÉT QUẢ ĐỊNH TÍNH CẮN TỒN PHÀN BẰNG SKLM r Màu săc STT Rf xioo Trước • màu Sau • màu uv 254 nm uv 366 nm AST uv 366 nm Nâu đen Xanh lam nhạt Nâu nhạt Vàng nhạt 0,9 3,9 Xám nhạt Vàng nhạt 5,4 Vàng nhạt Vàng 9,2 19,3 Hồng nhạt Vàng nhạt 44,1 47,1 52,0 10 75,0 85,3 Xanh lam Xanh dương 27,4 11 Nâu nhạt Nâu nhạt nhạt Xanh dương Xanh lam nhạt nhạt Tím nhạt Hồng Nâu nhạt Hồng nhạt Nâu nhạt Hồng nhạt Xanh dương Xanh nhạt dương nhạt PHỤ LỤC BẢNG KẾT QUẢ ĐỊNH TÍNH CẮN CLOROFORM CỦA DỊCH CHIẾT TOÀN PHẦN BẰNG SKLM Màu sắc STT RfxlOO Trước • màu ƯV 254 nm Nâu uv 366 nm Xanh lam Sau • màu AST ƯV 366 nm Vàng 0,9 5,4 9,2 18,2 20,5 23,5 Tím nhạt 28,2 Tím nhạt nhạt • Vàng Xanh lục Vàng Nâu nhạt Xanh lục Cam 37,9 10 42,8 11 44,1 12 48,4 13 52,0 14 75,0 15 86,0 Cam Xanh lam 31,7 Vàng nhạt Nâu nhạt Xanh lam nhạt Tím Nâu Xanh lam Xanh dương Xanh lam Tím nhạt Nâu nhạt Tím Nâu Xanh dương Hồng Xanh dương PHỤ LỤC BẢNG KÉT QUẢ ĐỊNH TÍNH CẮN CLOROFORM CỦA DỊCH NƯỚC BẰNG SKLM Màu sắc STT RfxlOO Trước • màu ưv 254 nm uv 366 nm Nâu Sau • màu AST ƯV 366 nm Vàng nhạt 0,9 5,4 Vàng nhạt 7,0 Vàng Xanh dương Xanh lục 9,2 Vàng nhạt Xanh lam 13,6 18,2 Nâu nhạt 20,5 Nâu nhạt 23,5 29,0 10 31,7 Vàng nhạt 11 34,5 Hồng nhạt nhạt Nâu nhạt 13 44,1 Nâu 14 46,8 15 48,4 16 52,0 Nâu nhạt 17 64,8 Nâu nhạt 19 87,0 Vàng Nâu nhạt 37,9 84,8 Xanh lục Tím nhạt 12 18 Vàng nhạt Xanh lam nhạt Hồng Xanh dương Xanh lam Tím nhạt Xanh lam Xanh lam nhạt Nâu nhạt Xanh dương Hồng nhạt Xanh dương PHỤ LỤC HÌNH ẢNH SẮC KÝ ĐÒ TINH DÀU HÀNH TĂM Xbundanc O ọ ộ ”7-