Luận văn Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào của cây Lạc tiên (Passiflora roetida L.) ở tỉnh Thừa Thiên Huế bằng dung môi hữu cơ phân cực tiến hành nhằm cung cấp thông tin về thành phần hóa học trong các cao chiết phân cực và hoạt tính gây độc tế bào của cây Lạc tiên (Passiflora roetida L.).
Trang 1
ĐẠI HỌC HUẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
HUỲNH THỊ TÝ
NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC
'VÀ HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BAO CUA CAY LAC TIEN
(PASSIFLORA F0ETIDA L) Ủ TỈNH THỪA THIÊN HUẾ
BẰNG DUNG MÔI HỮU CO PHAN CUC
Chuyên ngành: Hóa hữu cơ
Mã số: 60 44 01 44
LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HOC
TS NGUYEN
Thira Thién Hué, nam 2016
Trang 2LỜI CAM ĐOAN
“Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi,
các số liệu và kết quả nghiên cứu ghỉ trong luận văn là trung thực,
được các đồng tác giả cho phép sử dụng và chưa từng được công bố
trong bắt kỳ một công trình nào khác
Họ tên tác giả
Trang 3Po
* Loi Cam Ou
Lain van này đạc hoan thank tại phòng tí nghiệm hep chat te nbien 2“
tating Bai hoc su pham Hut
“Gái xin bay t6 long bidt on chan thank wa séu sae din TS Neguyin
Phi co là nguai đã lướng dân tan ten, chu do ra tao mei đu hien gin Á ti: tong thoi gian thue hign ludn van
Ce xin chan thank cim on cde thay ob gido hoa Aéga nti chung va t6 Fea lưu ov nei tiếng da giip do mhiet tink dé toi hoan thank udm van
” Gat xin bay ti hinh thong tà côm m tá Ban Gm its, phng
Dav too Sau Dei hye, ting Dai ne Sue pham Hue da tow st hin
thuận (oi givin tei thực Hiện để tài
Xã ang lá xi dan đan căm on gin nh, ba be dae wi dong
vien dé tei 06 them nghi le wa say me nghien cit hhoa hoe
* Goi in ttn tong ci ox!
Cae gia luận săn
Trang 4MỤC LỤC Trang TRANG PHỤ BÌA LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN MUC LUC
DANH MUC CAC KY HIEU VA CHU VIET TA’ DANH MUC CAC BANG DANH MỤC CÁC HÌNH MO DAU 1 Lý do chon dé tai
2 Mục tiêu của đề tài
3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 4 Nội dung của đề tài
5 Phương pháp nghiên cứu
6 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
7 Cầu trúc của luận văn
Chương 1 TÔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Giới thiệu chung về họ Passifloraceae và chi Passiflora 8 1.1.1 Vai nét vé ho Passifloraceae 8
1.1.2 Vai nét vé chi Passiflora 10
1.1.3 Hoạt tính sinh học của các loài thuộc chi Passiflora " 1.2 Sơ lược về cây Lạc tiên (Passj/fora /oetida L.) 17 1.2.1 Vị trí phân loại 17 1.2.2 Đặc điểm thực vật 17 1.2.3 Thành phần hoá học " - 18 1.2.4 Công dung 20 1.2.5 Hoạt tính sinh học 2222222221221 1e 21 1.3 Các sản phẩm ứng dụng trên thị trường 122
13.1 Cac sin phim ing dung cia mét sé loai thude chi Passiflora 22
Trang 5Chương 2 ĐÓI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Đối tượng nghiên cứu 2.2 Hóa chất, dụng cụ và thiết bị nghiên cứu 30 2.2.1 Hóa chất 30 2.2.2 Dụng cụ và thiết bị 30
2.3 Phương pháp nghiên cứu 31
2.3.1 Phương pháp thu hái, định danh và xứ lý mẫu 31
2.3.2 Phương pháp chiết xuất khu ey |
2.3.3 Phương pháp phân lập 32
2.3.4 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học 3
2.4 Phương pháp đánh giá hoạt tính gây độc tế bào 33
2.4.1 Thiết bị nghiên cứu 3 2.4.2 Các dòng tế bào sai ¬ 33 2.4.3 Phuong phap Chương 3 KẾT QUÁ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Định danh loài
3.2 Hàm lượng các cao chiết 35
3.3 Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào của các cao chiết .37
3.4 Phân lập và khảo sát các cao chiết 38
3.4.1 Phân lập chất từ cao chiết ethyl acetate 38
3.4.2 Khảo sát cao chiết methanol bằng SKIM Az
Trang 6DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TAT Các phương pháp phổ ‘H-NMR SC-NMR IR J (Hz) ð(ppm) Các dòng tế bào Hep-G2 KB LU MCF-7 Cac ký hiệu viết tắt khác DMSO ECs EDso Ia Rr SKC (TLC) SKLM TLTK UV Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy Infrared Spectroscopy ppm = part per million Human hepatocellular Careinoma Human epidermoid carcinoma Human bronchogenic carcinoma Human breast adenocarcinoma Dimethyl sulfoxide Effective Concentration 50% Effective Dose 50% Inhibitory Concentration 50% Retardation factor Thin Layer Chromatography Ultraviolet Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon 13 Phổ hồng ngoại Hằng số tương tác tính bing Hz Độ dịch chuyển hóa học tính bằng phần triệu Ung thư gan
Ung thư biểu mô
Ung thư phổi
Ung thư vú
Trang 7DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bang 1.1 Danh mục các loài thuộc họ Lạc tiên (Passifloraceae) ở Việt Nam 9
Bảng 1.2 Các loài thuộc chi Passiflora 6 Việt Nam "
Bảng I.3 Hoạt tính sinh học của các loài thuộc chỉ Passiflora 12
Bảng 14 Hiệu quả gây độc tế bào của cao chiét ethanol loai Passiflora
inearnata L với dòng tế bào EAC 14
Bảng 1.5 Hoạt tính kháng oxi hóa của Passj/lora edulis 14 Bảng 1.6 Các sản phẩm ứng dụng của một số loài thudc chi Passiflora 23 Bảng 1.7 Các sản phẩm tir cay Lac tién (Passiflora foetida L.) enn DT Bảng 3.1 Hàm lượng các cao chiết phần trên mặt đất cây Lạc tiên 37
Bang 3.2 Hoạt tính gây độc tế bào các cao chiết phần trên mặt đất cây Lạc tiên 37
Bảng 33 Số liệu phổ NMR của hợp chất PFE2 (DMSO, 125/500 MHz) và
Trang 8DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang
Hinh 2.1 Hình ảnh một số bộ phận cây Lạc tiên 30
Hình 3.1 Cảnh, lá và quả của cây Lạc tiên (Passiflora foetida L.) 35
Hình 3.2 Sơ đồ chiết xuất các cao chiết từ cây Lạc tién (Passiflora foetida L.) .36
Hình 3.3 SKLM của chất PFEI trong hệ dung môi dichlorometane:methanol [97:3] 40 Hình 3.4 SKLM của chất PEE2 trong hệ dung môi dichloromethane:methanol
[90:10] 4I
Hinh 3.5 So dé phan lap chat tir cao chiét ethyl acetate 42 Hình 3.6 SKLM cao chiết methanol của cây Lạc tiên trong các hệ dung môi
khác nhau - sn 4
Hình 3.7 Pho IR của hợp chất PFE2 43
Hinh 3.8 Phd 'H-NMR cua hop chat PFE2 sone hước ¬ 4
Hinh 3.9 Phd “C-NMR cia hop chat PFE2 45
Hình 3.10 Phô DEPT của hợp chất PFE2 — 45
Hình 3.11 Cấu trúc của hợp chất PFE2 (daucosterol) 48
Trang 9MỞ ĐÀU 1 Lý do chọn đề tài
Ngày nay, các sản phẩm từ thiên nhiên có hoạt tính sinh học tốt được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau của đời sống, trong đó có y học Những năm gần đây, nhiều hợp chất thiên nhiên hoặc các sản phẩm được tổng hợp,
ban ting hop tir hop chất thiên nhiên được sử dụng hiệu quả trong việc phòng ngừa
và điều trị một số bệnh, đặc biệt là các bệnh hiểm nghèo
Tại Việt Nam, trong giai đoạn 2010-2015, mỗi năm có hơn 150.000 trường hợp mới mắc ung thư, trong đó có khoảng 75.000 trường hợp tử vong và con số này
có xu hướng tăng lên trong những năm tiếp theo [68] Các phương pháp điều trị ung thư thông thường như phẫu thuật, hóa trị và xa trị hay để lại tác dụng phụ Các tác dụng không mong muốn này gây ra nhiều khó chịu, ảnh hưởng đến chất lượng cuộc sống của bệnh nhân Vì vậy, việc tìm ra các giải pháp mới trong điều trị ung thư là một yêu cầu cấp thiết
Hiện nay, cây Lạc tién (Passiflora foetida L.) dang thu hút sự quan tâm của nhiều nhà khoa học trong nước và trên thế giới Nghiên cứu ban đầu cho thấy Passiflora foetida có hoạt tính gây độc tế bào tiềm năng [ 10] Cao chiết ethanol tir la loài này thể hiện hoạt tính tốt trên dòng tế bào ung thư vú (SKBR3) với giá trị ICa, tương đối thấp [40] Bên cạnh đó, theo kinh nghiệm dân gian, Lạc tiên được sử dụng để trị đau bụng, chữa ho, hồi hộp, mắt ngủ và suy nhược thần kinh [62], [67] [69] Vì vậy, Passi/lora foetida cần được nghiên cứu sâu hơn về thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào để làm tăng giá trị của nó Đồng thời, để góp phần giải thích tác dụng chữa bệnh từ loại dược liệu nảy, chúng tôi chọn đẻ tài “Nghiên cứu thành phan hoá học và hoạt tính gây độc tế bào của cây Lạc tiên (Passj/lora foetida L.) ở tỉnh Thừa Thiên Huế bằng dung môi hữu cơ phân cực”
2 Mục tiêu của đề tài
Cung cấp thông tin về thành phần hóa học trong các cao chiết phân cực và
hoạt tính gây độc tế bào của cây Lạc tiên (Passiflora foetida L.),
3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
Trang 104 Nội dung của đề tài
~ Thu thập mẫu nguyên liệu và định danh loài
~ Xử lý mẫu, chiết xuất với các dung môi có độ phân cực tăng dần
~ Phân lập ít nhất một cấu tử từ cao chiết trong dung môi phân cực và xác định
cấu trúc hóa học cấu tử phân lập được
~ Khảo sát hoạt tính gây độc tế bào tử các cao chiết
5 Phương pháp nghiên cứu
~ Phương pháp thu hái, định danh và xử lý mẫu ~ Phương pháp chiết xuất và phân lập
+ Phương pháp chiết rắn - lỏng + Phương pháp sắc ký cột hap thu + Phương pháp sắc ký lớp mỏng ~ Xác định cấu trúc hợp chất phân lập được
+ Phương pháp phổ hồng ngoại (IR)
+ Phương pháp phô cộng hưởng từ nhân: 'H-NMR, '*C-NMR, DEPT 6 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
Lần đầu tiên nghiên cứu để xác định thành phần hóa học các cao chiết trong dung môi phân cực và khảo sát hoạt tính gây độc tế bảo của Lạc tiên (Passjflora /oetida L.) ở tỉnh Thừa Thiên Huế nhằm giải thích kinh nghiệm sử dụng dược liệu
của người dân địa phương
7 Cấu trúc của luận văn
Luận văn gồm 71 trang với 3 chương, 10 bảng, 13 hình, 75 tai liệu tham khảo và 12 phụ lục Luận văn có bố cục như sau:
Mở đầu: 2 trang
Chương 1 Tổng quan: 22 trang
Chương 2 Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: 5 trang
Chương 3 Kết quả và thảo luận: 15 trang Kết luận và khuyến nghị: 2 trang
Trang 11Chương I
TÔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Giới thiệu chung vé ho Passifloraceae và chi Passiflora
1.1.1 Vai nét vé ho Passifloraceae
Ho Lac tién (Passifloraceae) la ho thy vật có hoa gồm khoảng 18 chỉ với hơn 630 loài, phân bố ở khu vực nhiệt đới, chủ yếu ở Nam Mỹ, Đông Nam Á, ở độ cao cách mực nước biển 3800 m Riêng ở khu vực Đông Nam Á, Campuchia có số lượng loài nhiều nhất với 167 loài, trong đó có 58 loài đặc hữu được tìm thấy cách mực nước biển 1500 ~ 2500 m, 22 loài có quả ăn được và 9 loài có giá trị thương mại [22]
Trong hệ thực vật Việt Nam, họ Lạc tiền có 2 chỉ: Passiflora, Adenia và 28 loài [3] Đây cũng là họ có số chỉ và loài đa dạng, phân bố khắp các địa phương trên cả nước
Các loài thuộc họ Lạc tiên thuộc nhóm thực vật hai lá mầm, mọc ở dạng cây bụi, thân thảo hoặc thân leo với nhiều tua cuốn, lá nách Hoa đơn tính hoặc lưỡng
tính với ba đến năm lá đài, cánh hoa được xếp đối xứng, cấu trúc xoắn hình tua bao
quanh hoa Phần dưới nhụy hoa là bầu nhụy được nâng đỡ bởi cuống hoa, bầu nhụy có từ ba đến năm lá noăn Các loài thuộc họ này có dạng quả nang hoặc quả hạch, mỗi quả có nhiều hạt nằm trong phần thịt quả và được bao quanh bởi áo hạt [37]
Trang 12Băng 1.1 Danh mục các loài thuộc họ Lạc tiên (Passifloraceae) ở Việt Nam [3]
srr Tên khoa học Tên Việt Nam Phân bỗ T Passiflora foetida L Nhãn lông
2 | Passi assiflora quandrangularis vdraneulars Dua gang tây, mu Chùm bao dưa 3 Passiflora edulis Sims Chim bao tring
R Quảng Nam, Đà 4 Passiflora coerulea L "Nhãn lồng lam Ning, Sai Gon :
3 Passifiora laurifolia L Guỗi tây Sai Gần © | Passiflora altebilobata HemLs | Nhan lông thuỳ cao
7 | Passifiora eberhardtii Gagn | Nhin Tong Eberhardt | Bắc Cạn R Cao Nguyên, 8 Passiflora cupiformis Nhãn lồng hình ly Bạch Mã, Bà Nà 9 Passiflora perpera Mast Nhãn lông sai
Sa Pa, Bình Trị 10 | Passiflora wilsomi HemLs Nhãn lồng Wilson | Thiên, Quảng
‘Nam, Da Ning
1 Passiflora sumatrana Bl han Tong Sumatra Bạch Mã 1 Passifiora incarnata L Mắc mác, Lạc tiên | Hà Nội, Đà Lạt 1ã | Passiflora pertriloba Mer Nhãn Tong 3 thuy Ha Noi 14 Passjffora suberosa L Nhãn lông sube Sài Gòn 15 | Passiflora jugorum W.W.Sm Nhãn lông hợp
Trang 13STT 'Tên khoa học Tên Việt Nam Phin bd
20 Adenia penangiana Thu digp 1a nho Biên Hoà
21 ‘Adenia banaensis Cuss Thu diép Ba Na Ba Na, Bach Ma
2 ‘Adenia poilanei Cusset Thu digp poilane 2 Adenia viridiflora Craib Qua qua “Thư điệp di vòng, 24 | Adenia heterophylla (BI.) Koord Vòng kỹ Thanh Hoá Đồng Nai, Côn 25 Adenia heterophylla Sơn, Phú Quốc <
26 Adenia heterophila Tây Ninh
oy | Mena ondata (Gaertn) de wilde,
+ | Adenia pinnarisecta (Craib) Thu điệp xế
Caib, lông chim
1.1.2 Vai nét vé chi Passiflora
Chỉ Passj/lora thuộc họ Lạc tiên là chỉ có số lượng loài lớn nhất và phô biến
nhất của hệ thực vật nhiệt đới, được tim béi Killip năm 1938 [32] Chi này có hơn
500 lồi, phân bố nÌ
nơi trên thế giới như Mỹ, Đông A, Nam A, New Guinea,
Australia và New Zealand Hơn 350 loài được tìm thấy ở vùng nhiệt đới và rừng mưa Nam Mỹ, trong đó có 60 loài ăn được [49]
Chỉ Passj/lora có đặc điểm hình thái phức tạp Hầu hết các loài thuộc chỉ này có tua cuốn, thân thảo và có dạng đây leo Lá so le, đơn hoặc kép, thủy lá giống,
hình bàn tay và một vài loài có lơng mịn Một số lồi có sự khác biệt giữa lá non và lá trưởng thành về hình dáng và kích thước Các loài thuộc chi Passiflora c6 r8 moc
khá cạn, có thê quan sát thấy 60% rễ cách mặt đất 30 cm Hoa có thẻ đơn tính hoặc
lưỡng tính, màu sáng, có nhiều sợi hoặc hình khuyên phụ giữa tràng hoa và nhụy
hoa, những đặc điểm này làm hoa có hình đáng rất đa dạng Đài hoa gồm ba đến
năm lớp xếp đè lên nhau, nằm tự do hoặc ở trên lá đài, có ba đến năm nhụy dưới
Trang 14sắc đẹp của hoa đóng vai trò quan trong trong việc thu hút côn trùng thụ phấn [22]
Theo Phạm Hoàng Hộ, ở Việt Nam, Passj/lora có 19 loài, phân bố ở nhiều
vùng miễn trên cả nước: Bắc Cạn, Sải Gòn, Hà Nội, Quảng Tri, Kon Tum, Thanh
Hố, Cơn Sơn, Nha Trang, Phú Qui [B] Các loài này được tổng hợp ở bảng 1.2
ig 1.2 Các loài thuộc chỉ Passj/lora ở Việt Nam |3]
STT 'Tên khoa học Tên Việt Nam
7 Passiflora foetida L Nhãn Tong
2 Passjffora quandrangularisL Đưa gan tây, Chùm bao đưa 3 Passifiora edulis Sims Chùm bao trứng 3 Passifiora coerulea L Nhãn lông lam 3 Passifiora laurifolia L Guỗi tây 6 Passifiora aliebilobata HemLs Nhãn lồng thuỳ cao 7 Passifiora eberhardiii Gagn Nhin Tong Eberhardt 8 Passiflora cupiformis Nhãn lông hình Ty 9 Passifiora perpera Mast Nhãn lông sai 10 Passifiora wilsonii HemLs Nhãn lông Wilson
1 Passifiora sumatrana BI Nhãn Tong Sumatra 12 Passifiora incarnata L Mặc mác, Lạc tiên 1B Passiflora pertriloba Mer Nhãn Tong 3 thuy 1 Passiflora suberosa L Nhãn Tong sube 15 Passiflora jugorum W.W Sm Nhãn lông hợp 16 Passiflora moluccana Tầng đèn 7 Passiflora siamica ‘han Tong Thai Lan 18 Passifiora kwantungensis Mert Nhãn lông Quảng Đông 1 Passifiora tonkinensis de Wilde Nhãn lông Bắc Bộ
1.1.3 Hoạt tính sinh học của các loài thuộc chi Passiflora
“Theo nhiều công trình nghiên cứu trên thể giới, các chỉ trong họ Passifloraceae được sử dụng để làm thực phẩm hay làm thuốc tại nhiều nơi, trong dé chi Passiflora , điển hình là nghiên cứu ở Án Độ, Brazil,
Trung Quốc và Việt Nam Trong y học, các loài thuộc chi Passiflora được dùng làm
được quan tâm trong vài nim gin dé
Trang 15thuốc chữa một số bệnh như an thần, trị mắt ngủ, hồi hộp, hạ huyết áp, [69], [70]
Tuy là một chỉ có số lượng loài khá lớn nhưng chỉ mới có một số ít loài thuộc chỉ
Passiflora được các nhà khoa học nghiên cứu về hoạt tính sinh học Kết quả từ các
công trình nghiên cứu được tổng hợp ở bảng 1.3
Bảng 1.3 Hoạt tính sinh học của các loài thuộc chi Passiflora STT Loài Bộ phận dùng học [TUTK,năm Phan trên mặt đất An thân Tráng dương Passiflora [38], 2013 1 incarnata L Tr ho
7 ‘Chong hen suyén
7 Tri dai thao đường
Gây độc tếbảo | [41],2012 ‘Khang oxi hoa
Passiflora Giảm đau 2 leschenaultia lá Kháng viêm [49], 2014 Hạ sốt Passiflora mm 3 quadrangularis L lá Trị thiếu máu [56], 2005 Hạ sốt
Passiflora Kháng oxi hóa
4 subpeltata Lá Giảm đau [49], 2014
Kháng viêm
5 —Ƒ Passiora actimia Tả Giải lo âu [45], 2006
Trịđái tháo đường | [IS],2013 [15], 2013
La Kháng oxi hóa [36], 2007
6 | Passiflora alata [8], 2015
Bão vệ dạ dây [8], 2015 Thin cây Khang nam 47}, 2012
7 |Passiflora bogotensis lá Trị đái tháo đường | [24], 2015
Trang 16STT Bộ phận dùng | Hoat tinh sinh học | TLTK, nim Hạ huyết áp (27), 2010 Giải lo âu Kháng oxihóa | [20],2012 Kháng viêm Quả và thân cây | Khángoxihoá | [44], 2009 [32], 2013 36], 2007 8 | Passiflora edulis Khang oxi boa) 56) 2011 [14], 2015 Giải lo âu [9], 2015 La "¬ [16], 2013 Chống trằm cảm I9].2015 17, 2007 Khang viém B1) [14], 2015 9 | Passiflora tetrandra La Gây độc tế bào | [43], 1991 Kháng oxi hóa
10 | Passiflora ligularis | - Bột trái cây Kháng khuẩn [49], 2014 ‘Tri dai thio đường
Từ bảng 1.3 kết hợp với tải liệu tham khảo, một số hoạt tính sinh học đáng chú ý của các loài thuộc chỉ Pass/lora có thể kể đến như sau:
1.1.3.1 Hoạt tính gây độc tế bao
Nam 1991, Perry N B và các cộng sự tìm thay 4-hydroxy-2-cyclopentenone từ cao chiét 1a loai Passiflora tetrandra Hop chat 4-hydroxy-2-cyclopentenone
được biết là có hoạt tính ức chế rất tốt cho dong tế bào ung thư máu (P-388) với giá
trị ICsạ thấp, nhỏ hơn | ug/mL [43]
Năm 2012, Nagineni S nghiên cứu in vro hoạt tính gây độc tế bào thực quản
(EAC) thir nghiệm trên chuột Nghiên cứu cho thấy cao chiét ethanol tir loai Passiflora incarnata L c6 khả năng tiêu diệt tế dòng bao ung thư này Kết quả được thể hiện ở bảng 1.4
Trang 17Bang 1.4 Hiệu quả gây độc tế bào của cao chiết ethanol loài Passiflora incarnata L v6i dong té bio EAC ‘Nong độ (ug/mL) | Tế bào sống sót Tếbàochết | % tế bào sống sót 200 36 0 100 400 3 1 96.96 600 30 3 90,90 S00 6 18 25 1000 9 2 0
Như vậy, hiệu quả gây độc tế bào phụ thuộc vào nồng độ cao chiết, nồng độ
càng lớn thì hiệu quả gây chết càng cao Khi nồng độ cao chiết ethanol đạt đến 1000
ug/mL thì sẽ tiêu diệt 100% tế bào ung thư thực quản [41] 1.1.3.2 Hoạt tính kháng oxi hóa
Nam 2010, Ingale A.G và công sự nghiên cứu hoạt tính kháng oxi hóa từ bốn
cao chiết loai Passiflora edulis Két quả tông hợp ở bảng 1.5
Bang 1.5 Hoạt tính kháng oxi hóa của Passj/fora edulis
STT Mẫu ICs (ug/ml)
T_ | Cao chigt Id trong ether dau hoa 5888 2 | Cao chiết lá trong chloroform 5685 3 [ Cao chiết thân trong ether đầu hỏa 34,01 4ˆ [ Cao chiết thân trong chloroform 31,28
3 | Axit ascorbic 43,04
‘Tir bang 1.4 cho thay ca bin cao chiét déu thể hiện hoạt tính kháng oxi hóa Tuy
nhiên, cao chiết chloroform tir thin loai Passiflora edulis c6 hoat tính kháng oxi hóa tốt
nhất với giá tri ICsp thấp nhất (51,28 g/mL), giá trị này cao hơn không đáng kể so với
chất chuẩn axit ascorbic (ICs = 43,04 ug/mL) Trong khi đó, cao chiết ether dau héa tir
lá có hoạt tính kháng oxi hóa thấp nhat (ICs = 58,88 g/mL) [27]
Năm 2014, Shanmugam S củng cộng sự nghiên cứu in viro trên bốn cao chiét: ether dầu hỏa, chloroform, acetone va methanol từ lá Pass/lorz subpeliara
Kết quả cho thấy ba cao chiết chloroform, acetone và methanol có hoạt tính kháng
Trang 18oxi hóa, trong đó cao chiết acetone thể hiện hoạt tính tốt nhất với giá trị ICzo là
27.90 ng/mL [48] Cùng năm đó, nhóm nghiên cứu của Shanmugam S.T.P tìm thấy
hoạt tính kháng oxi hóa trong hai cao chiét acetone và methanol từ bột qua
Passiflora ligularis Tuy nhiên, cao chiết acetone có hoạt tính tốt hơn cao chiết
methanol với giá trị ICạ lần lượt là 19,13 pg/mL va 23,71 mg/mL [52]
Năm 2015, André W và cộng sự nghiên cứu hoạt tính kháng oxi hóa bằng hai phương pháp DPPH và ORAC từ cao cẻ
tương ứng là 061,20 + 8,50 pg/mL va 1076 + 8S mol trolox/g Hợp chất rutin được tìm thấy trong loài nảy cũng cho giá tri ECso la 18,30 + 0,90 ug/mL khi thử
nghiệm hoạt tính kháng oxi hóa bằng phương pháp DPPH [8]
Năm 2016, Shanmugam S và cộng sự thử nghiệm hoạt tính kháng oxi hóa
ết loài Pass/flora alata có giá trị ECso
trên các loại cao chiết khác nhau từ loài Pass//lora lesehenaulrii Kết quả cho thấy cao chiết acetone từ lá cho giá trị ICs; thấp nhất (29,14 ug/mL) trong bốn cao chiết
thử nghiệm, tức là cao chiết này có hoạt tính kháng oxi hóa cao nhất [5 1] 1.1.3.3 Hoạt tính kháng khuẩn, kháng nắm
Nam 1991, Perry và cộng sự đã tìm được 4-hydroxy-2-cyclopentenone trong cao chiết lá loài Passjflora ferrandra Chắt này có khả năng kháng được ba chủng vi khuẩn: E coli, B subilis và P aeruginosa Vào năm 1970, Nicolls tìm thấy hoạt tính kháng nấm ở một số loài thuộc chi Passiflora nhu Passiflora caerulean,
Passiflora edulis và Passjflora mollissim Cao chiết của các loài này trong dung
dịch đệm phosphate (pH = 7) có tác dụng làm giảm sự phát triển của hai chủng nắm Trichophyton mentagrophytes và Candida albicans [27]
Nam 2014, Shanmugam S.T.P va céng su nghién ciu in vitro cao chiét
acetone từ bột cây loài Passj/lora ligularis Két quả cho biết cao chỉ:
này có khả
năng ức chế bốn chủng vi khuẩn: S parz/yphi (28 mm), S typhi A (31 mm), S typhi
8 2 mm) và K pneumonia (32 mm); kháng tốt hai chủng vi khuan C albicans
(14,85 mm) và 4 niger (13,91 mm) [52] 1.1.3.4 Hoạt tính giảm đau
Năm 2014, nhóm nghiên cứu của Shanmugam S cho kết quả cao chiết acetone từ lá loài Passiflora subpeltata với liều lượng 200 và 400 mg/kg cho hiệu quả giảm
Trang 19đau tương ứng là 50,65% và 82,73% Nghiên cứu nhận thấy cao chiết liều 400 mg/kg cho hiệu quả giảm đau đáng kể, thời gian phát huy tác dụng cũng diễn ra nhanh hơn [49] Hai năm sau, nhóm nghiên cứu này tiếp tục tìm hiểu cao chiết acetone từ lá loài assi/lora leschenauliii, kết quả cho thấy hiệu quả giảm đau 44,75 và §1,43% tương ứng với liều lượng thử nghiệm 200 và 400 mg/kg [51] Như vậy, cao chiết acetone từ lá loài Passjlora subpelrata sẽ có hiệu quả giảm đau tốt hơn Passiflora leschenaultit
1.1.3.5 Hoạt tính kháng viêm
Năm 2014, Shanmugam S nghiên cứu iw vizo trên cao chiết acetone từ lá loài
Passiflora subpeltata với liều lượng 200 và 400 mg/kg, hiệu quả kháng viêm lần lượt là 47,08% và 81,54% Ở liễu lượng thử nghiệm 400 mg/kg, hiệu quả kháng viêm thấp hơn không đáng kể so với 10 mg/kg chất chuẩn indomethacin, 89,16% [48] Đến năm 2016, nhóm tác giả này nghiên cứu trên loài Passiflora leschenaultii, két qua là cao chiết acetone từ lá loài này cho hiệu quả kháng viêm 42,07% và 81,37%, tương ứng với liễu lượng 200 va 400 mg/kg [51]
1.1.3.6 Hoạt tính trị đái tháo đường
Việc điều trị đái tháo đường liên quan
Nam 2014, Shanmugam S.T.P cho biết cao chiét acetone tir bét qua Passiflora
su tte ché enzym a-glucosidase ligularis cho hiệu quả ức chế tốt nhất, đạt tới 75,36%, gần tương đương với chất chuẩn acarbose (79,87%) Trước đó một năm, Montefusco-Pereira và công sự cho biết loài Pass//lora nitida ức chế ezym a-glucosidase với giá trị ICso la 6,78 + 0,31 ug/mL (72%) Như vậy, khi so sánh Passiflora ligularis va Passiflora nitida, Passiflora ligularis có khả năng ức chế enzym a-glucosidase tốt hơn, đồng nghĩa với việc loài này cho hiệu quả chữa trị đái tháo đường cao hơn [52]
1.1.3.7 Một số hoạt tính khác
Nam 2006, Ichimura và cộng sự cho biét cao chiét methanol tir loai Passiflora epalensis (10 mg/kg hoặc 50 mg/kg) hoặc lutcolin (50 mg/kg) có tác dụng hạ huyết áp khi thử nghiệm trên chuột Phân tích định lượng bằng sắc ký lỏng - khối phổ
(LC-MS) cho thay cao chiết này chứa 20 yg/g luteolin va 41 ug/g luteolin-
glucoside Ngoài ra, cao chiết methanol còn chứa 2,40 mg/g axit 7-aminobutyric,
đây được biết là hợp chất hạ huyết áp hiệu quả [27]
Trang 20Năm 2011, nhóm nghiên cứu của Hongwei L kết luận cao chiét ethanol loài
Passiflora edulis “edulis” không có tác dụng giải lo âu ở liều lượng thấp, hoạt tính này chỉ thể hiện ở liều lượng tương đối cao (> 400 mg/kg) Trong khi đó, Passiflora edulis “/lavicarpa” cho thấy hiệu quả giải lo âu đáng kế ở liều lượng 400 mg/kg, với liều lượng thấp hơn thì cao chiết này cũng không thấy hiệu quả [26]
Trong hai năm 2014 va 2016, Shanmugam S và các cộng sự đã nghiên cứ
cao chiét acetone tir la hai loai Passiflora subpeltata va Passiflora leschenaultii, két
qua cho thay Passiflora subpeltata cho higu qua ha sot tốt hơn Cụ thể như sau, với liều lượng thử nghiệm 200 va 400 mg/kg, trong 1 giờ, cao chiết loai Passiflora
subpeltata có tắc dụng giảm nhiệt độ lần lượt 0,14 va 0,38°C, trong 5 giờ, nhiệt độ
giảm 1,68 va 2,55°C [49] Đối với loài Passi/lora leschenaultii, véi liều lượng thử
nghiệm như trên, trong 1 giờ, nhiệt độ giảm lần lượt 0,14 và 0,34°C, giảm 1,05 và
242°C sau 5 giờ [51]
Một vài nghiên cứu chỉ ra ring cao chiét loai Passiflora edulis thir nghiém trén chuột có tác dụng kéo dài giấc ngủ và có tác dụng an thần tiềm năng ở liều lượng
1000 mg/kg [9]
1.2 Sơ lược về cây Lạc tiên (Passj/fora /oetida L.) 1.2.1 Vị trí phân loại
Cây Lạc tiên (Passiflora foetida L.) có vi trí phân loại như sau: Ho Lac tién (Passifloraceae)
Chi Passiflora
Loài Passiflora foetida L
Passiflora foetida L 1a một loài thực vật có lá và quả ăn được trong họ Passifloraceae [4], [36]
1.2.2 Dac diém thye vat
Theo giáo sư Đỗ Tắt Lợi, cây Lạc tiên còn được gọi là cây lạc, nhãn lồng, lồng đèn, hồng liên, long châu quả, mắt mát (Đà Lạt) Lạc tiên có tên khoa học là Passiflora foetida L., thudc chi Passiflora, ho Lac tién (Passifloraceae) [4]
Lạc tiên là một loại cây mọc leo, thân mềm, trên thân có nhiều lông mềm Lá mọc so le, hình tim, dai 6 — 10 em, mép lá có nhiễu lông mịn, cuống lá dài 7 = 8 em
Trang 21Đầu tua cuốn có dạng hình lò xo Hoa đơn, màu trắng hoặc tím nhạt với đường kính 5,5 em Lá đài màu trắng phía đưới có gân xanh và dưới lá đài có ba gân chính với nhiều gân phụ Một đĩa có hai tầng tua, mặt tua trên có màu tím trong vàng, trong cùng có lông mịn Cây ra hoa từ tháng 4 đến tháng 5, có quả trong khoảng thời gian tháng 5 đến tháng 7 Quả có dạng hình trứng có chiều dài 2 - 3 cm [2], [4]
'Passiflora foetida L có nguồn gốc từ Bắc Mỹ, sau đó chúng lan rộng ra nhiều
vùng nhiệt đới trên toàn thế giới, loài này phân bố ở độ cao 120 ~ 1000 m Ở Việt
Nam, Lạc tiên được tìm thấy ở nhiều vùng trên cả nước: Nam Bộ, Đà Lạt, Thừa Thiên Huế, Quảng Nam [35]
1.2.3 Thành phần hoá học
Qua các tài liệu tham khảo, trên thế giới đã có một số công trình nghiên cứu về thành phần héa hoc cita loai Passiflora foetida L
“Theo công trình nghiên cứu déc lap cua Patil A.S., Paikrao H.M., Dhawan K., Echeverri F., Asadujjaman Md., thanh phần hóa học của Passiflora foetida gom
14 16p chat chinh: gum, duéng, saponin, tannin, cardiac glycoside, alkaloid,
anthraquinon, steroid, flavonoid, phenol, cyanogenic, passifloricin, polyketide
và a-pyrone [10], [16], [19], [21]
Nam 2013, Patil A.S vi cOng su cho biét Passiflora foetida có tổng các axit bếo gồm axit linolenie (1) và axit linoleic (2) chiém tir 61,1 dén 74.8% Thém vao dé, tetraphyllin B (3) va tetraphyllin B sulphate (4) cũng được tìm thấy
trong hạt của loài này ở đảo Galapagous [11]
Trang 22oso,H 4 n on oF on ° a Đ, nơ 0 4 nơ Ho: 4 No NC’ ‘on NC
Tetraphyllin B (3) Tetraphyllin B sulphate (4)
Ở Việt Nam, năm 2014, Nguyễn Tắn Phát và cộng sự ở Viện Cơng nghệ Hố học ~ Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam đã nghiên cứu thành phần hóa học cao chiết methanol từ phần trên mặt đắt cây Lạc tiên được thu hái ở tỉnh An Giang 'Từ cao chiết methanol đã phân lập được 3 hợp chất di vòng: axit indol-3-axetic (S), axit pyroglutamie (6), adenosine (7) va 1 polyol myo-inositol (8) [5] af X— Axitindol-3-axetie (5) Axit pyroglutamic (6) on sy Aw + a 4 Ne Th
‘Adenosine (7) Polyol myo-inositol (8)
Ở Thái Lan, năm 2015, Aussavashai S và cộng sự nghiên cứu hàm lượng
vitexin trong cao chiết ethanol từ lá loài Passjflora foetida Sự kết hợp sắc ký lớp
mỏng (TLC) và sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC) xác định sự có mặt của
vitexin (9) trong cao chiết lá với hàm lượng từ 0,03% dén 0,31% [11]
Trang 23
Vitexin (9)
"Tuy nhiên, theo các tài liệu tham khảo được thì ở Việt Nam vẫn chưa có công, trình nào nghiên cứu thành phần hóa học của cây Lạc tiên ở tỉnh Thừa Thiên Huế
trong cao chiết ethyl acetate Đây cũng là một trong những lý do chúng tôi lựa chọn cao chiết này để tiến hành phân lập chất
1.2.4 Công dụng
Trong y học cổ truyền, cây Lạc tiên được sử dụng trong nhiều vị thuốc khác nhau Theo TLTK [62], Lạc tiên là một thảo được có nhiều hoạt tính tốt Trong dân gian, người dân thường dùng dây và lá sắc uống giúp an thần, chữa mắt ngủ Trước
đây, các công ty và bệnh viện y học cổ truyền ở Việt Nam thường thêm cồn vào Lạc tiên để pha chế thành thuốc nước ngọt Loại thuốc này có tác dụng an thần, chữa mắt ngủ và tim hồi hộp
Theo TLTK [73], quả Lạc tiên có vị ngọt, tính bình Do đó, nó có tác dung thanh nhiệt, giải độc, lợi thủy, chữa phù thũng, bạch trọe, giã đ
chữa ung nhọt 16 loét ở chân rất hiệu quả Nhờ vào những tác dụng dược lý tốt, một số bài thuốc chữa bệnh từ cây Lạc tiên được áp dụng theo kinh nghiệm dân gian:
Chữa bệnh da liễu: Lá Lạc tiên nẫu nước tắm rửa để chữa các bệnh ngoài da
Chữa bệnh kiết ly: Cây Lạc tiên rat tốt cho hệ tiêu hóa Khi bị kiết ly và tiêu
chảy có thể dùng 60 gam quả Lạc tiên, rửa sạch, sắc lấy nước, pha thêm đường, ngày uống hai lần trước bữa ăn
Chữa thần kinh suy nhược: Khi bị suy nhược thần kinh do căng thẳng, bệnh nhân có thể dùng 8 — 10 gam dây và lá Lạc tiên sắc uống Lạc tiên cũng có thê phối hợp với lá vông, lá dâu tằm, tâm sen, nấu thành cao lỏng uống, mỗi ngày dùng 2 — 5 gam, uống trước khi đi ngủ
Trang 24Trợ tim, chữa mắt ngủ: Cây Lạc tiên được đánh giá là rất tốt cho hệ tuần hoàn,
tìm mạch Dùng day, lá Lạc tiên 20 gam, hat sen 12 gam, lá tre 10 gam, lá dâu tằm 10 gam, lá vông nem 12 gam, cam thảo 6 gam, xương bồ 6 gam, táo nhân 10 gam,
sắc nước
Ống trong ngày sẽ đem lại hiệu quả
Ngoài ra, quả Lạc tiên được dùng làm nước gidi khát do có tác dụng mat và bổ Quả chín được bổ đôi, nạo hết ruột, ép và lọc lấy dịch quả Đường trắng 250
gam hòa với một lít nước đun sôi đề nguội, cho dịch quả vào nước đường rồi trộn
đều Nước quả Lạc tiên có mùi thơm đặc biệt, vị hơi chua, chứa nhiều vitamin, nhất là vitamin B2
1.2.5 Hoạt tính sinh học
Qua các tài liệu tham khảo được, tính đến nay chỉ mới có một số công trình khoa học nghiên cứu về hoạt tính sinh học của loài Passj/lora /oerida L
Nam 2006, Moongkarndi P và cộng sự nghiên cứu hoạt tính gây độc tế bảo trên đòng tế bảo ung thư vú (SKBR3) từ cao chiết ethanol phần trên mặt đất
Passiflora ƒoetida Quá trình thử nghiệm được thực hiện bằng phương pháp MTT trong 48 giờ Kết quả cho thấy cao chiết này có hoạt tính tương đối tốt, giá trị IC› 14 54,75 + 6,03 pg/mL [40]
Nam 2007, cae nha khoa hoc 6 An D6 nghiên cứu hoạt tính kháng khuân các cao chiết ethanol và acetone từ lá và quả Passiflora foetida Két qua cho thay cao chiét acetone khang rit tét ching vi khuan V cholera, sau đó đến ba chủng Ps putida, S flexneri va St pyogenes Trong khi dé, cao chiét ethanol c6 hoat tính tốt với cả bốn chủng vi khuẩn trên Trong nghiên cứu này, cao chiết lá có hoạt tính
kháng khuẩn tốt hơn cao chiết quả [39]
Ở Ẩn Độ, năm 201 1, Sasikala V và cộng sự nghiên cứu hoạt tính giảm đau với cao chiét ethanol tir la Passiflora ƒoetida thử nghiệm trên chuột Liều lượng 200 mg/kg cho hiệu quả cao nhất [(13,83 + 0,48) min] ở phút 90, xắp xi với 5 mg/kg chất
chuẩn morphine sulphate [(14,67 + 0,21) min] Nghiên cứu cũng cho biết cao chiết này có hoạt tính kháng viêm, giá trị cao nhất là [(1,52 + 0,05) mL] ở liều lượng 100
mg/kg, tương đương với 10 mg/kg chất chuẩn indomatacin [46]
Trang 25Nam 2013, Siriwardhene M.A và cộng sự nghiên cứu hoạt tính hạ đường huyết
từ cao chiết lá loài Passỹ/fora foetida Với liều lượng 433 mg/kg, sau 90 phút lượng
đường trong máu giảm tới giá trị trung bình 96,30 + 2,60 mg/dL, higu quả 34,4% Kết quả này tương đương với liều lượng 10 mg/kg chất chuẩn glipizide với hiệu quả đạt 34,55% [S3]
Năm 2014, Asadujjaman Md và cộng sự kết luận là cao chiết ethanol từ Passiflora foetida có hoat tinh giảm đau, hiệu quả 68,75% và 30,00% tương ứng với liều lượng 500 và 250 mg/kg Ở liều 500 mg/kg, hoạt tính này gần tương đương với liều lượng là 25 mg/kg chất chuẩn natri diclofenac, 72,50% Ngoài ra, nghiên cứu cũng cho biết cao chiết này có khả năng trị tiêu chảy [10]
Năm 2015, nhóm nghiên cứu của Aussavashai S tìm thấy sự có mặt của vitexin trong cao chiết lá loài Passjflora ƒoetida Vitexin được biết là hợp chất có
hoạt tính kháng oxi hóa, kháng viêm, chống các bệnh về tuyến giáp, chống xơ cứng,
động mạch, hạ huyết áp và giải độc gan [1 1]
Theo các tài liệu tham khảo được, cho đến nay chưa có công trình nghiên cứu nao về hoạt tính gây độc tế bào của loài Passj/lora foetida ở Việt Nam Vì vậy, dược liệu này cần được nghiên cứu sâu hơn về thành phần hóa học và hoạt tinh gay độc tế bào để tìm ra các hoạt chất có tác dụng tốt
1.3 Các sản phẩm ứng dụng trên thị trường
1.3.1 Các sản phẩm ứng dụng của một số loài thuộc chỉ Passj/lora
Nhiều nghiên cứu cho thấy, các chi trong họ Passifloraceae được sử dụng làm
thực phẩm hay làm thuốc ở khắp nơi trên thế giới, trong đó các loài thuộc chỉ
Passifora được quan tâm trong vài năm gần đây, đáng chú ý là các nghiên cứu ở Án Độ, Ý, Brazil [38], [42]
“Theo các tài liệu tìm hiểu được, đã có một số sản phẩm của các loài thuộc chỉ
Passiflora trên thị trường quốc tế nói chung và Việt Nam nói riêng Các sản phẩm
này đóng vai trò như thực phẩm chức năng giúp con người có cuộc sống khỏe mạnh hơn và hạnh phúc hơn Tùy theo mục đích sử dụng, các nhà sản xuất có thể tạo ra chỉ với duy nhất một loài thuộc chỉ Pass//ora hoặc kết hợp với các
Trang 26
Dang STT Thanh phan | _ sử dụng Công dụng Xuất xứ 6 Passiflora Dạng _ |Giúp an thần và ngủ| incarnata | nude ngon An thần, giảm bồn Passiflora R : 7 incarnata Dang viên | chén, lo âu và mắt ngủ
Passiflora „._ | Giảm lo âu và mất
8 inearnata Dang viên ngủ Anh
Passiflora
9 incarnata vi | Dang vién| Giảm lôu ngơ
Passiflora
incarnata, “Tạo cảm giác thư
10 ethanol va | P8 Dạng viên giãn MỊ ợ
nước
Trang 27
Dang STT Thanh phan | _ sử dụng Công dụng Xuất xứ Passiflora tim | incarnata ae xu
Dog { | Thue phim bé sung] Thé Nhĩ
"1 =3S& — - | (131%), nữ | Dạng viên | tang (7,29%), dinh đưỡng, Kì chất ôn định Giảm lo lắng, hồi Pe hộp, căng thả o| Sa incarnata assiflord | ong vien| MOP căng thẳng | Romania mắt ngủ, hạ huyết áp Bạc hà, yến Giảm lo lắng,
13 mạch và | Dạng viên |ngủ, suy nhược thằn| Anh
Passiflora kinh va căng thing
Giảm căng thẳng,
Passiflora loạn thần kinh, hồi ở
Trang 28Dang STT Thanh phần - sử dụng Công dụng Xuất xứ Giam bén chén, lo Passiflora | = Dang viên | lắng, căng thẳng và a incarnata = mắt ngủ 3 Passiflora Trị mắt ngủ, bồn 18 incarnata Dang viên chin : My
Từ bảng 1.6 có thể thấy, mặc dù chỉ Passi/lora có rất nhiều loài, các nước lớn như Mỹ, Anh, Úc, chủ yếu khai thác, sản xuất và sử dụng các sản phẩm từ loài 'Passiflora incarnata Một điểm đáng chú ý nữa là các sản phẩm này hầu hết được điều chế ở dạng viên để thuận lợi cho quá trình đóng gói, bảo quản và vận chuyển
1.3.2 Các sản phẩm ứng dụng của cây Lạc tiên (Passiflora foetida L.)
Hiện nay, theo tài liệu tham khảo được, các sản phẩm từ loài Passiflora foetida L chỉ được tim thấy ở thị trường Việt Nam và đã có 8 sản phẩm từ loài này, công dụng chủ yếu là giúp an thần và trị mắt ngủ Kết quả được tổng hợp ở bảng l7
Trang 29Bảng 1.7 Các sản phẩm từ cây Lạc tiên (Passi/lora foetida L.) {59}, 160}, [61], [67], [74], [75] 2 Dang STT Thành phần | sử dụng Công dụng
Tri suy nhược thần kinh, tìm
Passiflora hồi hộp, hay nằm mơ, phụ nữ
1 foetida \ Dang cao hành kinh sớm, đau bung, ho
‘va mat nga
Passiflora
2 foetida L Dang tra Tri mắt ngủ
An thân, giải nhiệt, mát gan, trị
mắt ngủ, suy nhược thần
Passiflora
3 foetida L Dang cao |kinh, hay nằm mơ, phụ nữ hành kinh sớm, đau bụng, ghẻ ngứa
va phi thang Trị chứng mắt ngủ, ngủ ha Passiflora mơ, phụ nữ hành kinh sớm, an ¬
foetida L., "¬
Trang 30h a,| Dạng STT | Sảnphẩm |Thành phần sử dụng 'Công dụng Passiflora
|/oerida L lá “Trị mắt ngũ, suy nhược than
6 vông, dâu Dạng cao kinh, tim hồi hộp và an thần R :
tim, nước
Passifiora foetida L.,
'vông nem, lá Trị suy nhược thần kinh, hồi 7 dau, đường Dạng cao hộp và hay nim mo
BY tring, ethanol và nước
suy nhược thân kinh, tìm hồi hộp, hay nằm mơ, phụ nữ Passiflora
8 foetida L Dạng trà | hành kinh sớm, đau bụng do : nhiệt táo, ho do phế nhiệt, phi
thũng và bạch trọc
Nhu vay, trên thị trường Việt Nam, các sản phẩm từ cây Lạc tiên khá đa dạng về mẫu mã Các công ty chủ yếu điều chế Lạc tiên ở dạng cao để giúp người tiêu dùng dễ dàng sử dụng
1.4 Các phương pháp nghiên cứu hoạt tính gây độc tế bào [1]
Một vài phép so màu nhanh đã được miêu tả trong thử nghiệm trên các dòng tế bào ung thư ở mức độ in vitro, hiện nay người ta thường sử dụng hai phương pháp phương pháp MTT (3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide) và phương pháp SRB (Sulforhodamin B)
1.4.1 Phương pháp MTT
Trong những năm gần đây, phương pháp tetrazolium (MTT) được sử dụng phô biến Phương pháp này lần đầu tiên được miêu tả bởi Tim Mosmamn trên tạp chi Immunological Methods năm 1983 Theo tác giả, muối tetrazolium được ding để triển khai phép thử so màu, qua đó đánh giá về sự sống sót và khả năng phát triển
Trang 31của tế bào động vật Nguyên lý của phép thử là vòng tetrazolium bám chặt vào tỉ thể của tế bào hoạt động, dưới tác dụng của enzym dehydrogenase, màu vàng của MTT biến đổi thành màu tím formazan Kết quả đọc trên máy quang phổ và có độ chính xác cao Phương pháp được dùng để đo độ độc của chất nghiên cứu, khả năng phát O oy triển và hoạt động của tế bào oy Tetrazolium (mau vang) Formaran (mau tim) 1.4.2 Phương pháp SRB Phép thử SRB được phát triển bởi Philip Skehan và cộng sự năm 1990 để đánh
giá độc tính của chất nghiên cứu và khả năng phát triển của tế bào trong ứng dụng sàng lọc thuốc ở qui mô lớn Nguyên tắc của phép thử là khả năng nhuộm màu của SRB lên protein, SRB nhuộm bằng cách phá vỡ màng tế bào Những mảnh vỡ tế bào sẽ không bị nhuộm màu nên không ảnh hưởng đến số liệu thực nghiệm
Phuong pháp SRB dựa trên khả năng liên kết tĩnh điện và sự phụ thuộc vào pH do lượng dư amino axit của protein Dưới điều kiện môi trường axit nhẹ, SRB liên kết với lượng amino axit dư trên protein của các tế bào đã được có định bằng axit trichloroacetic (TCA) Sau đó, sử dụng bazơ yếu như tris-base (2-amino-2- hydroxymethyl-propane-I,3-diol) để hòa tan va đo mật độ quang của dịch chiết từ tế bào một cách định lượng
Trang 32Chương 2
ƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
DOI TUQNG VA PE
2.1 Đối tượng nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu là phần trên mặt đất của cây Lạc tiên (Passjflora foedida L.) ở huyện Phú Lộc, tỉnh Thừa Thiên Huế gồm: thân, cành, lá, quả Hình 2.1 Hình ảnh một số bộ phận A Cảnh và lá, ây Lạc tiên
B Quả trưởng thành, C Quả chín
2.2 Hóa chất, dụng cụ và thiết bị nghiên cứu
2.2.1 Hóa chất
Dung méi sir dung: n-hexane, dichloromethane, ethyl acetate, methanol, acetone, chloroform,
‘Thude thir: vanillin (10 mL axit sulfuric dic, 200 mL methanol, 25 mL axit acetic dic va 3 gam vanilin), it, dung dich axit sulfuric 10%
Chất nhỏ
cột sắc ký: silica gel pha thường (Silica gel 60 cỡ hạt 0,040-0,063 mm, (230-400 mesh ASTM), Merck) Ngoai ra còn sử dụng sắc ký lớp mỏng pha thường (TLC-Silieagel 60, Fass, Merck),
2.2.2 Dụng cụ và thiết bị
số AND GX 600, độ chính xác 0,001 gam
Cân phân tích hiện
Các dụng cụ thủy tình: cột sắc ký, pipet, đũa thủy tỉnh, cốc thủy tỉnh với nhiều thể tích khác nhau, bình chạy sắc ký
Trang 33
'Bếp điện, máy sấy, giá đỡ, máy cô đuôi dung môi RE-S2CS-I, bình chiết, máy
chiết siêu âm Amsco Relianee Sonic 550, đèn UV ở 2 bước sóng 254 nm va 365 nm
WFH-203 (Shanghai Jinghe Industrial, Trung Quéc)
2.3 Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Phương pháp thu hái, định danh và xử lý mẫu
3.3.1.1 Thu hái mẫu
~ Mẫu được thu hái tại xã Vinh Mỹ, huyện Phú Lộc, tinh Thừa Thiên Huế vào
tháng 1/2016
~ Bộ phận sử dụng: phần trên mặt đất của cây Lạc tiên
- Tiêu chuẩn lựa chọn: + Lá, thân và quả còn tươi
+ Loại bỏ những phần bị hư hỏng
2.3.1.2 Định danh
~ Cây Lạc tiên được thu hái đầy đủ các bộ phận như: thân, cành, lá, quả và
được xác định tên khoa học bởi nhà giáo ưu tú Đỗ Xuân Cẩm, nguyên giảng viên Phân loại học Thực vật, trường Đại học Nông lâm Huế
~ Ghi chép tắt cá những thông tin về lồi nghiên cứu như: mơ tả hình thái, màu sắc quả, nơi phân bố và môi trường sống, tình trạng của cây trong tự nhiên
~ Chụp ảnh cành mang quả, ảnh chụp riêng quả từ giai đoạn mới hình thành
đến khi chín Mẫu được sử dụng để phục vụ công tác xác định tên khoa học
2.3.1.3 Xứ lý mẫu
Phan trên mặt đất của cây Lạc tiên sau khi thu hái, tiến hành loại bỏ các phần bị sâu bệnh, nắm mốc, vàng héo, úa dập cũng như các loài thực vật ký sinh khác
Sau đó rửa sạch, thái nhỏ, phơi, sấy khô ở 50-60°C và xay thành bột thô để hành chiết xuất, phân lập các hợp chất
2.3.2 Phương pháp chiết xuất Dược liệu sau khi đã xử lý
‘cue tang dan: n-hexane, dichlorometane, ethyl acetate va methanol Méi dung méi
hợp được chiết với các dung môi có độ phân
ngâm 5 lần, mỗi lần ngâm trong 24 giờ, 12 giờ khuấy 1 lần (dung môi ngâm chiết
Trang 34phải ngập mẫu bột được liệu từ 3 em đến 5 em) Dịch chiết của từng dung môi sau
mỗi lần ngâm được gộp lại, lọc và cô đuôi dung môi để thu được các cao chiết tương ứng 'Hàm lượng tương đối các cao chiết được tính theo công thức sau: m(%)= 2.100% M Trong đó:
m(%): hàm lượng cao chiết a: khối lượng cao chiết (gam)
M: khối lượng được liệu (gam) 2.3.3 Phương pháp phân lập
Quá trình phân lập sử dụng phương pháp sắc ký cột hắp thu với phương pháp
nhồi cột ướt Theo dõi quá trình rửa giải bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng
2.3.3.1 Sắc ký cột hấp thu
Nguyên tắc: Sắc ký cột hắp thu dựa trên sự phân bồ khác nhau của các cấu tử
trong hỗn hợp với hai pha không trộn lẫn Trong đó, pha động là chất lỏng chảy qua, pha tĩnh là những hạt rắn, nhuyễn mịn, có tính trơ được nhỏi trong cột thủy
tình Sự hấp thu xảy ra do sự tương tác lẫn nhau giữa các phân tử phân cực, tương
tác giữa những phân tử có mang các nhóm phân cực đối với pha tĩnh rắn là chất rất phân cực Nhờ vậy mà có thể triển khai dung môi liên tục với nhiều hệ dung môi khác nhau có độ phân cực thay đôi từ yếu đến mạnh [6]
2.3.3.2 Sắc ký lớp móng
"Thực hiện với bản mỏng tráng sẵn silica gel pha thường (TLC-silica gel 60, cỡ hạt 0,040 ~ 0,063 mm, F;s¿, Merck)
Nguyên tắc: Sắc ký lớp mỏng là phương pháp phân tích dựa trên cơ chế hấp phụ, trong đó lượng chất phân tích sau khi chấm lên bản mỏng sẽ di chuyển trên lớp chất hấp phụ mịn, vô cơ hay hữu cơ, theo một chiều nhất định Trong quá trình triển khai sắc ký, phụ thuộc vào hệ dung môi pha động và khả năng hấp phụ của các thành phần trong chất phân tích sẽ tạo ra các vệt sắc ký ở các vị trí khác nhau
Trang 35Các chất được phát hiện bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 và 365 nm hoặc dùng thuốc thử vanilin phun đều lên bản mỏng rồi sắy ở nhiệt độ cao trong vài phút cho đến khi lên màu [6]
2.3.4 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học
'Việc xác định cấu trúc của hợp chất tỉnh khiết được thực hiện thông qua các tính chất hóa lý và phân tích dữ liệu các phổ
Phổ hồng ngoại (IR) được đo trên máy FT-IR Prestige spectrometer (Shimazdu, Japan) tại khoa Hóa, Trường Đại học Sư phạm Huế
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân: 'H-NMR, '”C-NMR, DEPT được đo trên máy Bruker AMS00 FT-NMR Spectrometer tại Viện Hoá học, Viện Han lim Khoa hoc
và Công nghệ Việt Nam
Kết quả biện luận được khẳng định sau khi giải phổ và so sánh với tài liệu
trong các nghiên cứu đã được công,
2.4 Phương pháp đánh giá hoạt tính gây độc tế bào [23| |48|
Phương pháp thử hoạt tính gây độc tế bào được tiến hành tại Phòng thử hoạt tính sinh học, Viện Hóa học và phòng Sinh học thực nghiệm, Viện Hóa học các hợp
chất thiên nhiên
2.4.1 Thiết bị nghiên cứu
Tủ ấm CO; (INNOVA CO-170); Tủ sấy sinh học an toàn cấp II; Máy li tâm
(Universal 320R); Kính hiển vi ngược (Zeizz); Tủ lạnh sâu -25°C, -80°C; Buồng
đếm tế bảo (Fisher, Hoa Kỷ); Máy quang phổ (Genios Tecan); Bình nitơ lỏng bảo cquản tế bao và các dụng cụ thí nghiệm thông thường khác
2.4.2 Các dòng tế bào
Các dòng tế bảo ung thư ở người được cung cấp bởi ATCC (American Type
Culture Collection) gdm: KB (Human epidermic carcinoma) - ung thư biểu mộ, là dòng luôn được sử dụng trong các phép thứ độc tế bảo, Hep-G2 (Hepatocellular carcinoma) ~ ung thy gan; LU (Human lung carcinama) ~ ung thư phổi và MCF-7 (Human breast carcinoma) — ung thư vú
2.4.3 Phương pháp
Phuong pháp thử độc tế bào ¿ vo được Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ
Trang 36(NCD) xác nhận là phép thử độc tế bào chuẩn nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt tế bào ưng thư ở điều kiện in viro
Các dòng tế bảo ung thư nghiên cứu được nuôi cấy trong các môi trường nuôi cấy phù hợp có bổ sung thêm 10% huyết thanh phôi bò (FBS) và các thành phần tần thiết khác ở điều kiện tiêu chuẩn (5% CO;; 37°C; độ âm 98%; vô trùng tuyệt đối) Tùy thuộc và đặc tính của các dòng tế bào khác nhau, thời gian cấy chuyển
cũng khác nhau Tế bảo phát triển ở pha lo sẽ được sử dụng để thứ độc tính
"Thử độc tế bào: 200 ul dung dịch tế bào ở pha log nồng độ 3 x 10 tế bào/mL vào mỗi giếng (đĩa 96 giếng) trong môi trường DMEM cho các dòng tế bảo Hep-
G2, MCF-7, KB, LU Mẫu thử được pha loãng sao cho đạt đến nồng độ cuối cùng là 128 g/mL; 32 pg/mL; 8 pg/mL; 2 wgímL; 0,5 wg/mL Ù 372C, 5% CO; 3 ngày Giếng điều khiển (đối chứng dương) chỉ gồm 200 gl dung dịch tế bào 3 x 10 tế bao/mL Elliipticine (sigma) được dùng làm chất tham khảo (đối chứng âm)
Sau 3 ngày nuôi cấy; ủ tiếp với MTT 0,2 mg/mL ở 37°C trong 4 giờ; loại môi trường Thêm 100 wl DMSO lắc đều đọc kết quả với bước sóng 540 nm trên máy
spectrophotometter Genios TECAN
Phan trăm kìm hãm sự phát triển của tế bào (Growth inhibition) được tính toán
dựa trên số liệu do mật độ quang học OD trên máy quang phổ TECAN theo công thức sau: ODmiu thử - ODcontrol(+) IC(%)=100X ————— ODeontrol(-) - ODcontrol(+) Trong đó ODcontrol(-): giá trị thu được ở giếng thử chỉ có môi trường nuôi cấy mà không có tế bảo
ODcontrol(+): giá trị thu được ở giếng thử có môi trường nuôi cấy chứa tế bào nhưng không xử lý với mẫu cặn dịch chiết
Giá trị ICạy được tính dựa trên kết quả số liệu phần trăm kìm hãm sự phát trién
của tế bào bằng phần mềm miy tinh table curve
Trang 37Chương 3
KẾT QUÁ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Định danh loài
Cây Lạc tiên được thu hái ở xã Vinh Mỹ, huyện Phú Lộc, tỉnh Thừa Thiên Huế vào tháng 1 năm 2016 Mẫu được liệu nghiên cứu được nhà giáo ưu tú Đỗ
Xuân Cẩm, nguyên giảng viên phân loại thực vật, Trường Đại học Nông lâm Huế
xác định tên khoa học la Passiflora foetida L
Hình 3.1 Cành, lá và quả của cây Lạc tiên (Passiflora foetida L.) 3.2 Hàm lượng các cao chiết
Lượng mẫu nguyên liệu đem chiết xuất là 1,600 kg bột khô, mẫu được ngâm chiết lần lượt với các dung môi hữu cơ có độ phân cực tăng dần là m-hexane, dichloromethane, ethyl acetate va methanol Mỗi dung môi chiết 5 lần, mỗi lằn khoảng 4 lít để tiến hành phân tách các nhóm chất có độ phân cực khác nhau khỏi
bột cây Phần dịch chiết với mỗi loại dung môi được gộp lại, lọc và đuổi dung môi
bằng máy cô quay đưới áp suất giảm dé thu được các cao chiết tương ứng Quy
trình chiết tách được sơ đồ hóa ở hình 3.2
Trang 38Mau Passiflora foetida L 1 Phoi khô }zx» Bột cây khô (1,600 kg) “Chiết với n-hexane Ỷ \
Dịch chiết rong n-hexan Phản bã 1
Cö đuổi dụng môi “Chiết với dichloromethane Cao n-hexane Ì (17,894 g) Dich chiét trong dichloromethane
Ì C8 đuổi dung mỗi
Chit vi ethyl acetate Cao dichloromethane (25,985 g) + +
Dich chiet trong ethyl acetate Phan ba3 C6 duéi dung moi
Trang 39là 56,35; 40,72; 62,24 và 50,58 ug/mL Trong khi đó, cao chiết ethyl acetate c6 hoạt tính đối với 2 dòng tế bao ung thu gan (ICs = 94,60 ug/mL) va ung thir vai (ICs) = 82,82 pg/mL) Céc cao chiết còn Iai la n-hexane va methanol không thể hiện hoạt tính gây độc tế bảo trên 4 dòng tế bảo khảo sát Như vậy, trong cả 4 cao chiết, cao chiét dichloromethane cé hoat tính gây độc tế bảo tốt nhất và mạnh nhất với dòng tế bảo ung thư gan
'Kết quả sàng lọc về khảo sát hoạt tính gây độc tế bào từ các cao chiết cây Lạc tiên cho thấy đây là một loài thực vật có hoạt tính gây độc tế bảo, trong đó đáng chú ý đến hai cao chiết dichloromethane và cthyl acetate Đây là một trong các cơ sở để chúng tôi lựa chọn cao phân đoạn tiếp tục nghiên cứu phân lập cấu tử
3.4 Phân lập và khảo sát các cao chiết 3.4.1 Phân lập chất từ cao chiét ethyl acetate 3.4.1.1 Khảo sát cao chiét ethyl acetate bing SKLM
Cho 0,5 gam cao chiét ethyl acetate hoa tan hoan toan trong acetone Dé chon
hé dung méi thich hop cho qua trinh sic ky c6t, ching t6i khao sat cao chiét ethyl acetate bằng SKLM với các hệ dung môi khác nhau:
Hệ I: n-hexane:acetone [90:10]
Hệ II: a-hexane:acetone [80:20]
Hệ III: dichloromethane:methanol [95:5]
Các bản mỏng sau khi triển khai sắc ký được hiện vết các cấu tử bằng bằng
đèn UV ở hai bước sóng 254, 365 nm và thuốc thử vanilin
Dựa vào hình ảnh SKLM, chúng tôi nhận thấy ở hệ I và hệ II vết chất tách ra tương đối rõ ràng Đây là cơ sở cho việc lựa chọn hệ dung môi để triển khai sắc ký cột, tách các chất trong cao chiét ethyl acetate
3.4.1.2 Phân lập cao chiết ethyl acetate bằng sắc ký cột
Chuẩn bị cột: Cân 160 gam chất hấp phụ silica gel được nhồi vào cột sắc ký thủy tỉnh (chiều cao 80 em, đường kính 2,5 em) Cột sắc ký được rửa sạch, tráng lại bằng acetone, sấy khô Lót bông ở đáy cột và cố định chắc chắn trên giá Lượng
silica gel đã chuẩn bị được cho vào cốc chứa hệ dung môi n-hexane:acetone
[90:10], khuấy đều cho đến khi thu được hỗn hợp sệt đồng nhất thì cho vào cột (vừa cho vừa dùng bóp cao su gỡ nhẹ),
Trang 40Chuan bj mau sic ky c6t: Cao ethyl acetate 3,777 gam được hòa tan với lượng methanol tối thiểu, sau đó tẩm với silica gel pha thường với tỷ lệ khối lượng 1:1 Dua mau da tim silica gel này khuấy trên máy siêu âm cho đến kiệt dung môi được dang bột mịn
Tiến hành triển khai sắc ký cột: Mẫu đã tẩm silica gel nói trên được đưa lên đầu cột, dùng bóp cao su gõ nhẹ để bột phân bố đều Phân đoạn cao cthyÌ acetate sau khi khảo sát bằng SKLM được khai triển bằng sắc ký cột pha thường với hệ
dung môi rửa giải là n-hexane:acetone ([90:10]-[0:100]) Sau khi bay hơi dung môi
thu được năm phân đoạn ký hiệu lần lượt là E1, E2, E3, E4, E5 Khi khảo sát các phân đoạn trên SKLM, phân đoạn E3 và E4 cho các vệt sắc ký tương đối rõ rằng Do đó, hai phân đoạn này được quan tâm đề tiến hành phân lập chất
3.4.1.3 Phân lập chất từ phân đoạn E3
Phân đoạn E3 để bay bớt dung môi thấy có xuất hiện kết tủa trắng Gạn lấy phần kết tủa này và rửa lại bằng methanol, thu được 18 mg chất, ký hiệu E31 Kiểm tra SKLM thấy có một vết chính với hệ dung môi dichloromethane:methanol [97:3] Dựa vào kết quả trên bản mỏng, chúng tôi sử dụng hệ dung môi dichloromethane methanol ({99:1]-{95:5]) để triển khai SKC tiếp tục tỉnh chế chất trong phân đoạn E31
Chuẩn bị cột: Sử dụng cột sắc ký thuỷ tỉnh (chiều cao 30 cm, đường kính 1em) bằng phương pháp nhồi cột ướt Dưới đáy cột nhồi một lớp bông mỏng Cân 4 gam silica gel cho vào cốc thủy tinh chứa hệ dung môi dichloromethane:methanol [99:1] Khuấy đều đến khi tạo hỗn hợp đồng nhất rồi rót từ từ vào cột đến hết, để ôn định cột cho silica gel lắng xuống và mở khóa đẻ dung môi chảy ra bình hứng đến khi trên đầu cột vạch dung môi còn khoảng 0,5 cm so với vach silica gel
Chuẩn bị mẫu sắc ký cột: Lấy 1§ mg chất rắn E31 hòa tan hoàn toàn với lượng tối thiểu trong hệ dung môi dichloromethane:methanol [99:1]
Tiến hành triển khai sắc ký: Cho phân đoạn E31 đã hòa tan vào cột Triển khai sắc ký cột với hệ dung môi rửa giải dichlorometane:methanol ([99:1]-[95:5]) thu được ba phân đoạn tương ứng là E311, E312 và E313 Qua quá trình khảo sát bằng SKLM, phân đoạn E312 thấy hiện vết chất sạch trong hệ dung môi