Luận văn Thạc sĩ Hoá học: Nghiên cứu thành phần hoá học của thân cây Mâm xôi (Rubus alceaefolius Poir.) họ Rosaceae ở Yên Sơn - Tuyên Quang

Mục tiêu nghiên cứu của luận văn nhằm tìm ra những hợp chất có hoạt tính sinh học làm sáng tỏ việc sử dụng cây này trong dân gian, và đưa ra hướng bảo tồn và sử dụng hiệu quả cây dược liệu quí này. Mời các bạn cùng tham khảo!

ĐỖ THỊ NGỌC THỦY

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HOÁ HỌC

THÂN CÂY MÂM XÔI (RUBUS ALCEAEFOLIUS POIR.),

HỌ ROSACEAE Ở YÊN SƠN – TUYÊN QUANG

LUẬN VĂN THẠC SỸ HOÁ HỌC

Thái Nguyên - 2012

ĐỖ THỊ NGỌC THỦY

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HOÁ HỌC

THÂN CÂY MÂM XÔI (RUBUS ALCEAEFOLIUS POIR.),

HỌ ROSACEAE Ở YÊN SƠN – TUYÊN QUANG

Chuyên ngành: Hoá học Hữu cơ

Mã số : 60.44.27

LUẬN VĂN THẠC SỸ HOÁ HỌC

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS PHẠM VĂN THỈNH

Thái Nguyên - 2012

Tôi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Phạm Văn Thỉnh - Người thầy khoa học, mẫu mực đã hết lòng tận tình hướng dẫn, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và thực hiện luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn TS Nguyễn Quyết Tiến, TS Phạm Thị Hồng Minh những người thầy đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi nhiều kiến thức bổ ích và những kinh nghiệm quý báu trong nghiên cứu khoa học

Xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong khoa Hoá - Trường Đại học

Sư phạm Thái Nguyên, các thầy của Trường Đại học Sư phạm Hà Nội đã tận tình giảng dạy, giúp đỡ và đưa ra nhiều ý kiến quý báu về mặt chuyên môn trong quá trình tôi nghiên cứu và hoàn thành luận văn

Xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu cùng toàn thể các thầy cô trường trung học phổ thông Dương Tự Minh và gia đình tôi đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và làm luận văn

Thái Nguyên, tháng 08 năm 2012

Tác giả luận văn

Đỗ Thị Ngọc Thủy

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các số liệu, kết quả nêu trong luận văn này là trung thực và chưa từng được ai công

bố trong bất kỳ công trình nào khác

Tác giả luận văn

Đỗ Thị Ngọc Thủy

MỤC LỤC

Trang

Trang bìa phụ

Lời cảm ơn

Lời cam đoan

Mục lục i

Danh mục các kí hiệu, các chữ viết tắt iii

Danh mục các bảng iv

Danh mục các hình v

Danh mục sơ đồ vii

Danh mục các phụ lục viii

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Khái quát về các thực vật chi Rubus 3

1.2 Thành phần hóa học các loài thuộc chi Rubus 4

1.2.1 Các hợp chất secquitecpenoit 4

1.2.1.1 Các hợp chất Secquitecpenoit khung eudeusman 4

1.2.1.2 Các hợp chất Secquitecpenoit khung guaiane 5

1.2.2 Các hợp chất ditecpenoit 5

1.2.2.1 Các hợp chất ditecpen khung labdan 5

1.2.2.2 Các hợp chất ditecpen khung ent-kauran 6

1.2.3 Các hợp chất tritecpenoit 10

1.2.3.1 Các hợp chất tritecpen khung oleanan 10

1.2.3.2 Các hợp chất tritecpen khung ursan 11

1.2.4 Các hợp chất flavonoit 15

1.2.4.1 Các hợp chất flavonol 15

1.2.4.2 Các hợp chất flavanol 16

1.2.4.3 Các hợp chất hydroxyflavanol 17

1.2.5 Các hợp chất anthraquinon 18

1.2.6 Các hợp chất khác 18

1.3 Tình hình nghiên cứu hóa thực vật cây Rubus alceafolius 20

Chương 2 THỰC NGHIỆM 11

2.1 Đối tượng và phương pháp nghiên cứu 22

2.1.1 Thu mẫu cây, xác định tên khoa học và phương pháp xử lý mẫu 22

2.1.2 Phương pháp ngâm chiết và phân lập các hợp chất từ dịch chiết 22

2.1.3 Phương pháp xác định cấu trúc hoá học các chất phân lập được 23

2.2 Dụng cụ, hóa chất và thiết bị nghiên cứu 23

2.2.1 Dụng cụ, hoá chất 23

2.2.2 Thiết bị nghiên cứu 24

2.3 Thu nhận các dịch chiết từ cây Mâm xôi 25

2.3.1 Thu nhận các dịch chiết 25

2.3.2 Khảo sát định tính các dịch chiết 26

2.3.2.1 Phát hiện các hợp chất sterol 26

2.3.2.2 Phát hiện các ancaloit 26

2.3.2.3 Phát hiện các flavonoit 27

2.3.2.4 Phát hiện các cumarin 27

2.3.2.5 Định tính các glucosit tim 27

2.3.2.6 Định tính các saponin 28

2.3.2.7 Định tính các tanin 28

2.4.1 Cặn dịch chiết n-hexan của câyMâm xôi (MXH) 29

2.4.1.1 Hợp chất β-sitosterol (MXH1) 29

2.4.1.2 Hợp chất axit ursolic (MXH6) 30

2.4.1.3 Hợp chất Axit euscaphic (MXH14) 31

2.4.2 Cặn dịch chiết etyl axetat của cây Mâm xôi (MXE) 32

2.4.2.1 Hợp chất β-sitosterol-3-O-β-D-glucopyranosit (MXE1) 32

2.4.2.2 Hợp chất 8-methoxy-4H-chromen-4-one (MXE2) 33

2.4.2.3 Hợp chất suavissimoside R1 (MXE18) 33

2.4.2.4 Hợp chất trachelosperoside A1 (MXE21) 33

Chương 3 THẢO LUẬN KẾT QUẢ 36

3.1 Nguyên tắc chung 36

3.2 Phân lập và nhận dạng các hợp chất có trong các dịch chiết khác nhau của cây Mâm xôi 36

3.2.1 Hợp chất steroit 37

3.2.1.1 Hợp chất β-sitosterol (MXH1) 37

3.2.1.2 Hợp chất β-sitosterol-3-O-β-D-glucopyranosit (MXE1) 37

3.2.2 Hợp chất tritecpenoit 40

3.2.2.1 Hợp chất axit ursolic (MXH6) 40

3.2.2.2 Hợp chất axit euscaphic (MXH14) 50

3.2.2.3 Hợp chất suavissimoside R1 (MXE18) 60

3.2.2.4 Hợp chất trachelosperoside A1 (MXE21) 71

3.2.3 Hợp chất poliphenol: 8-methoxy-4H-chromen-4-one (MXE2) 82

KẾT LUẬN 92

TÀI LIỆU THAM KHẢO 93

PHỤ LỤC 98

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DÙNG TRONG LUẬN VĂN

ESI-MS : Electron Spray Ionization Mass Spectroscopy

FT-IR : Fourier Transform Infrared Spectroscopy

NMR : Nuclear Magnetic Resonance

1

H-NMR : 1H-Nuclear Magnetic Resonance

13

C-NMR : 13C- Nuclear Magnetic Resonance

DEPT : Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer

HMQC : Heteronuclear Multiple - Quantum Coherence

HMBC : Heteronuclear multiple - Bond Correlation

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 1.1 Một vài đại diện thuộc khung labdan 6

Bảng 1.2 Một vài đại diện ditecpen khung ent-kauran 7

Bảng 1.3 Một số hợp chất tritecpen khung oleanan 10

Bảng 1.4 Một số hợp chất đại diện khung ursan 12

Bảng 1.5 Một vài đại diện Các hợp chất flavonol 15

Bảng 1.6 Một vài đại diện các hợp chất pentahydroxyflavan 17

Bảng 1.7 Một số đại diện hợp chất hydroxyflavanol 17

Bảng 1.8 Một số hợp chất anthraquinon 18

Bảng 1.9 Một vài đại diện 19

Bảng 2.1 Khối lượng các cặn chiết thu được từ cây Mâm xôi 26

Bảng 2.2 Kết quả định tính các nhóm chất trong cây Rubus alceaefolius 29

Bảng 3.1 Độ dịch chuyển hóa học13C NMR của MXH1 và MXE1 38

Bảng 3.2 Số liệu phổ của MXH.6 và axit ursolic 41

Bảng 3.3 Các số liệu NMR và các tương tác xa trong MXH14 50

Bảng 3.4 Số liệu phổ NMR và các tương tác xa của MXE18 62

Bảng 3.5 Số liệu phổ NMR và các tương tác xa của MXE21 73

Bảng 3.6 Số liệu phổ NMR và các tương tác xa của MXE2 83

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 2.1 Cây Mâm xôi 22

Hình 2.2 Hoa và quả Mâm xôi 22

Hình 3.1 Cấu trúc hóa học của MXH1 và MXE1 38

Hình 3.2 Cấu trúc hóa học của MXH6 41

Hình 3.2.1 Phổ FT-IR của MXH6 43

Hình 3.2.2 Phổ LC-ESI-MS của MXH6 44

Hình 3.2.3 Phổ 1H – NMR của MXH6 45

Hình 3.2.4 Phổ 13C – NMR của MXH6 46

Hình 3.2.5 Phổ 13C-DEPT của MXH6 47

Hình 3.2.6 Phổ HSQC của MXH6 48

Hình 3.2.7 Phổ HMBC của MXH6 49

Hình 3.3 Cấu trúc hóa học của MXH14 51

Hình 3.3.1 Phổ FT-IR của MXH14 53

Hình 3.3.2 Phổ LC-ESI-MS của MXH14 54

Hình 3.3.3 Phổ 1H–NMR của MXH14 55

Hình 3.3.4 Phổ 13C – NMR của MXH14 56

Hình 3.3.5 Phổ 13C-DEPT của MXH14 57

Hình 3.3.6 Phổ HSQC của MXH14 58

Hình 3.3.7 Phổ HMBC của MXH14 59

Hình 3.4 Cấu trúc hóa học của MXE18 61

Hình 3.4.1 Phổ FT-IR của MXE18 64

Hình 3.4.2 Phổ LC-ESI-MS của MXE18 65

Hình 3.4.3 Phổ 1H-NMR của MXE18 66

Hình 3.4.4 Phổ 13C-NMR của MXE18 67

Hình 3.4.5 Phổ 13C-DEPT của MXE18 68

Hình 3.4.6 Phổ HSQC của MXE18 69

Hình 3.4.7 Phổ HMBC của MXE18 70

Hình 3.5 Cấu trúc hóa học của MXE21 72

Hình 3.5.1 Phổ FT-IR MXE21 75

Hình 3.5.2 Phổ LC-ESI-MS của MXE21 76

Hình 3.5.3 Phổ 1H-NMR của MXE21 77

Hình 3.5.4 Phổ 13C-NMR của MXE21 78

Hình 3.5.5 Phổ 13C-DEPT của MXE21 79

Hình 3.5.6 Phổ HSQC của MXE21 80

Hình 3.5.7 Phổ HMBC của S MXE21 81

Hình 3.6 Cấu trúc hóa học của MXE2 83

Hình 3.6.1 Phổ FT-IR MXE2 75

Hình 3.6.2 Phổ LC-ESI-MS của MXE2 85

Hình 3.6.3 Phổ 1H-NMR của MXE2 86

Hình 3.6.4 Phổ 13C-NMR của MXE2 87

Hình 3.6.5 Phổ 13C-DEPT của MXE2 88

Hình 3.6.6 Phổ HSQC của MXE2 89

Hình 3.6.7 Phổ HMBC của S MXE2 90

DANH MỤC SƠ ĐỒ

Trang

MỞ ĐẦU

Việt Nam có một nền y dược học cổ truyền từ lâu đời Trước khi nền y dược học hiện đại thâm nhập vào Việt Nam, y dược học cổ truyền được coi là một hệ thống duy nhất có vai trò và tiềm năng to lớn trong sự nghiệp bảo vệ sức khoẻ nhân dân trong suốt hàng ngàn năm đấu tranh dựng nước và giữ nước

Việt Nam là một nước có thảm thực vật phong phú và đa dạng sinh học với nhiều cây dược liệu quí Các hợp chất thiên nhiên thể hiện hoạt tính sinh học rất phong phú và là nguồn nguyên liệu lý tưởng để tạo ra nhiều loại thuốc mới chống lại các bệnh hiểm nghèo, các chất bảo quản thực phẩm cũng như các chế phẩm phục vụ nông nghiệp có hoạt tính cao mà không ảnh hưởng đến môi sinh

Việc sử dụng các loại thuốc thảo dược theo cách cổ truyền hay từ các hợp chất nguồn gốc tự nhiên có xu hướng ngày càng tăng đã chiếm một vị trí quan trọng trong nền y học (Các thuốc chữa bệnh có nguồn gốc tự nhiên chiếm tới 60% [30] Chế phẩm thảo dược dù chỉ có một loại dược liệu nhưng lại là hỗn hợp của nhiều hợp chất khác nhau và trong mọi trường hợp hầu hết còn chưa xác định được rõ hoạt chất của chúng Vì vậy, những bài thuốc sử dụng thảo dược hay những cây dược liệu là đối tượng để cho các nhà khoa học nghiên cứu một cách đầy đủ về bản chất các hoạt chất có trong cây cỏ thiên nhiên Từ đó định hướng cho việc nghiên cứu, gieo trồng, thu hoạch, chiết xuất ra các loại hoạt chất mới hay bằng con đường bán tổng hợp để tạo

ra những chất có hoạt tính sinh học cao, nhanh chóng đưa vào công tác chữa trị nhiều loại bệnh thông thường cũng như nan y Chính vì vậy, việc nghiên cứu hóa thực vật những cây cỏ thiên nhiên có một ý nghĩa khoa học và thực tiễn cao

Gần đây, việc nghiên cứu và chiết xuất thành công axit shikimic từ cây

Hồi Lạng sơn (Illicium verum), đó là nguyên liệu chính để sản xuất tamiflu

(oseltamivir photphat) làm thuốc trị dịch cúm gia cầm H5N1, hay như chế phẩm Crilla từ cây Náng hoa trắng (Crinum latifolium) trong việc điều trị u

tiền liệt tuyến ở Việt Nam… Những kết quả nói trên có phần đóng góp xứng đáng của các nhà khoa học thuộc nhiều chuyên ngành như sinh học, hoá học, công nghệ học,

Tiếp tục theo hướng nghiên cứu nói trên, cây Mâm xôi có tên khoa học

Rubus alceafolius họ Rosaceae ở Việt nam, lại là cây thuốc dân gian nên được

chọn làm đề tài nghiên cứu cho luận văn này Một vài công trình nghiên cứu

về lá cây Mâm xôi cho biết có triecpenoit và tritecpenoid-glycoside vùng với flavonoit, theo kinh nghiệm dân gian lá cây có tác dụng chữa bệnh viêm gan vàng da, phù thũng, dùng nước sắc uống tốt cho tiêu hoá [1]

Do vậy, chúng tôi đã chọn đề tài với tên: “Nghiên cứu thành phần

hoá học của thân cây Mâm xôi (Rubus alceaefolius Poir.) họ Rosaceae ở

Yên Sơn - Tuyên Quang” làm đối tượng nghiên cứu để tìm hiểu thành phần

hóa học với mục đích tìm ra những hợp chất có hoạt tính sinh học làm sáng tỏ việc sử dụng cây này trong dân gian, và đưa ra hướng bảo tồn và sử dụng hiệu quả cây dược liệu quí này

Chương 1 TỔNG QUAN CÁC THỰC VẬT CHI RUBUS

VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CHÚNG

1.1 Khái quát về các thực vật chi Rubus

Cây Mâm xôi với danh pháp khoa học là Rubus alceaefolius Poir., chi Mâm xôi (Rubus), họ Hoa Hồng (Rosaceae), bộ Rosales, lớp Hai lá mầm

(Plantae)

Ở Việt Nam, theo Phạm Hoàng Hộ chi Rubus có 55 loài [4], còn Võ

Văn Chi [1] đã thống kê được 13 loài, trong đó có tới hơn 30 loài đặc hữu trong hệ thực vật nước ta

Có nhiều loài cây thuộc chi Rubus được sử dụng trong y học dân gian

nhiều dân tộc, ở các nước Châu Phi, Châu Mỹ, Châu Á và Đông Nam Á

Y học cổ truyền ở phía Nam Trung Quốc và các dân tộc sinh sống

trong vùng thường dùng lá cây R pinfaensis để chữa bệnh ngoài da, viêm

nhiễm, và điều trị vết bỏng [11] Ở vùng Tây Nam Trung Quốc, phần ngọn

của cây R pinfaensis được sử dụng trong bài thuốc cổ truyền để làm tăng khả

năng vết thương mau lành hơn [12] Ngoài ra theo một số bài thuốc dân gian

khu vực phía bắc Trung Quốc còn dùng rễ, quả, lá, thân và cành cây R

xanthocarpus [19] để phòng chống bệnh ung thư, chống nhiễm khuẩn, và

chống các tế bào hoạt động trong thời gian dài

Lá cây R ulmifolius ở Italia còn được sử dụng trong y học cổ truyền để

điều trị bệnh áp xe, vết thâm tím, và các vết lở loét [14] Nước sắc của lá cây này còn được dùng để chữa bệnh đau mắt đỏ bên ngoài, bệnh tiêu chảy, viêm tấy [24]

Ở Chile theo kinh nghiệm dân gian người ta dùng cây R ulmifolius để

làm thuốc diệt chuột [14] Ngoài ra còn phát hiện ra một số nhóm chất trong

cây R ulmifolius có hoạt tính kháng khuẩn [32b]

Ở nước ta cũng có một vài loài thuộc chi Rubus được dùng trong y học dân gian Cây Ngấy lá nhỏ (R parvifolius) ở miền trung được dùng để trị bệnh tê thấp, đau gan, viêm đường tiết niệu, ho ra máu [2], cây Mâm xôi (R

alceaefolius) giúp cho dễ tiêu hoá, bổ thận lợi tiểu, ngoài ra còn dùng để

chữa bệnh viêm gan cấp, mãn tính, chữa viêm tuyến vú, viêm loét miệng, dùng cho phụ nữ sau khi sinh uống để thông máu [4] Cây Ngấy hương hay

Đùm đũm (R.cochinchinensis) lá được dùng để uống nước thay chè, thường

dùng để chữa bệnh viêm gan vàng da, tiêu hoá kém, phù thũng, ngoài ra còn

dùng để chữa sản hậu, chữa bệnh đái vàng, đái buốt [5]

Cây Mâm xôi mọc trườn hoang dại ở khắp vùng đồi núi miền Bắc nước

ta có thân, cành, cuống lá, cuống hoa đều có gai nhỏ Lá đơn có cuống dài, mọc so le, phiến lá chia 5 thuỳ không đều, gân chân vịt, mép có răng không đều nhau, mặt trên phủ nhiều lông lởm chởm, mặt dưới có lông mềm màu xám Cụm hoa thành đầu hay chùm ở nách lá, màu hồng Quả hình cầu, gồm

nhiều quả hạch tụ họp lại như dáng mâm xôi, khi chín màu đỏ tươi[1], [3] 1.2 Thành phần hóa học các loài thuộc chi Rubus

Cho đến nay đã có khoảng 30 loài thực vật chi Rubus được nghiên cứu

hoá thực vật [10], đã phân lập và nhận dạng được 112 chất, bao gồm nhiều lớp chất phong phú là tecpenoit, flavonoit và anthraquinon

t Một vài secquitecpenoit tìm thấy trong thực vật chi Rubus có kiểu khung

eudesmen và guaiane

1.2.1.1 Các hợp chất Secquitecpenoit khung eudeusmen (1)

Hợp chất (1) là một secquitecpenoit có cấu trúc 5-eudesmen-11-ol;

(4,7,10) phân lập được từ loài Rubus rosifolius [10]:

(1)

1.2.1.2 Các hợp chất Secquitecpenoit khung guaiane (2)

(2)

Một số hợp chất secquitecpenoit có kiểu khung guaiane đại diện là

10,11-epoxyguaiane; (1,4,5,10) phân lập được từ R rosifolius [10].

1.2.2 Các hợp chất ditecpenoit

Các ditecpenoit được tìm thấy có 22/112 kiểu hợp chất đã phân lập và

nhận dạng được từ các thực vật chi Rubus [10], chủ yếu thuộc vào hai loại

khung ent-kauran và labdan

(3)

Các ditecpenoit thuộc khung labdan khác nhau bởi những nhóm thế gắn vào các vị trí 3, 15, 18 và cấu hình proton ở vị trí C13

Bảng 1.1 Một vài đại diện thuộc khung labdan

Nhóm thế Tên chất

Ký hiệu

Nguồn thực vật

6)--D-OH

OC6H10O5

Arabinofuranosyl

Ent-kauran thuộc loại ditecpenoit bốn vòng dính kết khác nhau bởi số lượng các nhóm thế gắn vào các vị trí 9, 13, 15, 16, 17, 19

(4)

Bảng 1.2 Một vài đại diện ditecpen khung ent-kauran

Vị trí Tên chất

Nguồn thực vật

R

suavissimus

10

1.2.3 Các hợp chất tritecpenoit

Các hợp chất tritecpenoit tìm thấy trong thực vật chi Rubus chủ yếu là những chất thuộc hai loại khung oleanan và ursan

1.2.3.1 Các hợp chất tritecpen khung oleanan (5)

Một số công trình nghiên cứu gần đây đã phát hiện ra tritecpen khung oleane có hoạt tính kháng khuẩn phổ biến trên chủng Staphylococcus aureus [32] Một số hợp chất khác như axit oleanoic có hoạt tính anti-HIV [20]

Ceriric axit OH OH H OH CH2OH COOH 5.5 R alceafolius 10

1.2.3.2 Các hợp chất tritecpen khung ursan (6)

Gần đây người ta đã nghiên cứu và phát hiện một số tritecpen khung ursan cũng như tritecpen khung oleane có hoạt tính kháng khuẩn rất tốt trên

chủng Staphylococcus aureus [14] Axit ursolic có hoạt tính ức chế men

proteasa HIV-1 [25], axit pomolic có hoạt tính anti-HIV [20] Ngoài ra đã có tổng kết về những tritecpenoit kiểu khung ursan tìm thấy trong tự nhiên có nhóm keton ở vị trí C-3 thường có hoạt tính ức chế men proteasa HIV-1 [34]

(6)

Bảng 1.4 Một số hợp chất đại diện khung ursan

Nhóm thế Tên chất R R

K

H

Nguồn thực vật

Tài liệu

Ký hiệu

Nguồn thực vật

cacboxy-3-hydroxy-3-COC5H9O3

Isoquercitrin; 7-O-D-xylosit Gluc C5H9O4 OH 7.3 R spp 10

Bảng 1.6 Một vài đại diện các hợp chất pentahydroxyflavan

Ký

hiệu Tên chất

Nguồn thực vật

Tài liệu dẫn

8.1

pentahydroxyflavan; (2R,3’R,3S,3’R,4S)

3,3’,4’,5,7-pentahydroxyflavan-(46)-3,3’,4’,5,7-R fruticosus

8.2

pentahydroxyflavan; (2R,2’R,3S,3’R,4S)

Ký hiệu

Nguồn thực vật

Tài liệu

pentahydroxyflavylium(1+);

3,3’,4’,5,7-

3-O-(6-O-Oxalylloxalyl--D-glucopyranosit)

C6H10O5Oxalyl H 9.1 R laciniatus 10

pentahydroxyflavylium(1+);

3,3’,4’,5,7-7-O--D-glucopyranosit)

pentahydroxyflavylium(1+);

3,3’,4’,5,7-

3-O-[-D-Xylopyranosyl-(12)- -D-glucopyranosit)

1.2.5 Các hợp chất anthraquinon

Một số hợp chất anthraquinon có hoạt tính sinh học rất đáng chú ý, người ta đã nghiên cứu và phát hiện một vài hợp chất có tác dụng trong việc điều trị bệnh tiểu đường, viêm nhiễm, hạ đường huyết [23]

(10)

Bảng 1.8 Một số hợp chất anthraquinon

Nhóm thế Tên chất R

Ký hiệu Nguồn thực vật

Tài liệu dẫn

Một số hợp chất megastigmadien (11) như là

4,7-megastigmadien-3,9-diol; 3-xeton, 9-O--D-glucopyranosit chỉ khác nhau bởi cấu hình và vị trí ở

3, 7, 9 trong cây R idaeus [10]

Hợp chất 4,7-megastigmadien-9-diol; (6R, 7E, 9R), O-[

-L-arabinofuranosyl-(16)--D-glucopyranosit] (11.3) cũng được tìm thấy trong

cây R idaeus [17]

(11.3)

1.3 Tình hình nghiên cứu hóa thực vật cây Rubus alceafolius Poir

Ở mục 2 đề cập đến những nghiên cứu hoá thực vật của chi Rubus đã

chỉ ra tính đa dạng về thành phần hoá học, những hoạt tính chủ yếu là do các diterpenoit và tritecpenoit, anthraquinon với cấu trúc rất phong phú và đa dạng ở các bộ phận của một loài Một số công trình nghiên cứu gần đây cho

biết các hợp chất ent-kauran ditecpenoit thể hiện hoạt tính kháng khuẩn, gây

độc tế bào, chống khối u và anti-HIV[15] Những năm gần đây có nhiều cây thuốc cổ truyền của Trung Quốc được y học dân gian sử dụng như thuốc chống ung thư hoặc chống viêm và là đối tượng để thử nghiệm lâm sàng đối với ent-kauran trong việc điều trị ung thư [31] Đã có nhận xét rằng, hoạt chất

ở một số cây thuốc có tính kháng khuẩn, chống viêm, chống ung thư, hạ huyết

áp, lợi tiểu và thường có mặt các ent-kauran ditecpenoit [28] Một vài

tritecpenoit khung olean, ursan và flavonoit glycosit được đánh giá là có hoạt tính kháng khuẩn Staphylococcus aureus, chỉ cần một số lượng rất nhỏ thuốc cũng đã chống lại được vi khuẩn này [14]

Rubus alceafolius Poir là loài thực vật có ở Việt Nam, một số địa

phương thường dùng lá của cây này giúp cho dễ tiêu hoá, bổ thận lợi tiểu, ngoài ra còn dùng để chữa bệnh viêm gan cấp, mãn tính, chữa viêm tuyến vú, viêm loét miệng, dùng cho phụ nữ sau khi sinh uống để thông máu [4]

Trước đây đã có công bố kết quả nghiên cứu về thành phần hoá học của

lá cây thực vật Rubus alceafolius thu hái ở Tam Đảo, Vĩnh Phúc kết quả là

đã phân lập và xác định được cấu trúc của 4 tritecpenoit có 2 kiểu khung là

oleanan, và ursan cùng với 2 flavonoit glycosit [21]

Công dụng của cây Rubus alceafolius trong y học cổ truyền:

Cây Mâm xôi có nhiều tác dụng trong điều trị bệnh, người ta thường hái lá và thân cây quanh năm Vị thuốc mới thấy dùng trong phạm vi nhân

dân thường dùng sắc uống để giúp cho sự tiêu hoá, đau gan, kém ăn, ăn uống không tiêu [5]

Ngoài ra kinh nghiệm dân gian còn dùng lá, thân cành cây thuốc này để trị một số bệnh : như chữa cảm thấp, nôn mửa, gai lạnh, chữa tóc khô, chữa những bệnh về tiêu hoá nhất là đau gan, phù thũng [4]

Trong quá trình nghiên cứu hoá học thực vật cây Mâm xôi

(R.alceafolius) chúng tôi cũng quan sát thấy tính đa dạng và phong phú về

thành phần hoá học của nó Kết quả phân tích định tính các nhóm chất trong thân cây cho biết có cumarin, flavonoit, glucosit, sterol, còn lá cây không có phản ứng với glucosit trợ tim và saponin [6] Trong đó đã phân lập và xác định cấu trúc của 2 sterol, 4 tritecpenoit, ngoài ra còn một số hợp chất khác đang được tiếp tục nghiên cứu và làm rõ cấu trúc và hoạt tính sinh học của chúng

Chương 2 THỰC NGHIỆM

2.1 Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

2.1.1 Thu mẫu cây, xác định tên khoa học và phương pháp xử lý mẫu

Nguyên liệu để nghiên cứu là thân cây Mâm xôi Mẫu tươi được thu hái vào tháng 08/2011 tại Yên Sơn, Tuyên Quang

Mẫu cây đem nghiên cứu hoá thực vật được PGS.TS Lê Ngọc Công (Khoa Sinh- KTNN trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên) xác định tên khoa

học là Rubus alceaefolius Poir., thuộc họ Rosaceae

Mẫu thân tươi (11kg) được khử men trong tủ sấy 10 phút ở nhiệt độ

110 oC, sau đó được sấy khô đến khối lượng không đổi (độ ẩm < 10%) ở nhiệt

độ 60 oC thu được (2,5kg) mẫu khô

2.1.2 Phương pháp ngâm chiết và phân lập các hợp chất từ dịch chiết

Mẫu khô (2,5kg) đem nghiền nhỏ, cho vào bình ngâm chiết với metanol

ở nhiệt độ phòng trong thiết bị siêu âm cho đến khi nhạt màu (5 x 6l = 30l metanol) Các dịch chiết gom lại và làm khô bằng natri sunfat (Na2SO4) khan

Sau khi lọc qua giấy lọc, dịch chiết thu được được cất loại dung môi bằng máy cất quay (T < 50 0C) dưới áp suất giảm, cặn chiết thu được đem chiết

phân đoạn lần lượt bằng các loại dung môi có độ phân cực tăng dần (n-hexan,

etyl axetat) Sau đó, đuổi kiệt dung môi và chiết lại cặn còn lại bằng metanol,

thu được 3 cặn tương ứng lần lượt là n–hexan (MXH), etylaxetat (MXE) và

metanol (MXM)

Để phân lập các chất sạch từ hỗn hợp các chất có trong từng loại cặn dịch chiết, các phương pháp sắc ký (Sắc ký lớp mỏng (SKLM), Sắc ký cột thường Silica gel Merck 63-200 nm, với các dung môi và hệ dung môi thích hợp) đã được sử dụng phối hợp cùng các phương pháp kết tinh phân đoạn và kết tinh lại

Quá trình nghiên cứu sẽ nêu chi tiết ở phần thực nghiệm

2.1.3 Phương pháp xác định cấu trúc hoá học các chất phân lập được

Các chất phân lập được ở dạng tinh khiết là đối tượng để khảo sát các đặc trưng vật lý: màu sắc, mùi, dạng thù hình, thời gian lưu Rf, điểm nóng chảy (0C), đo độ quang hoạt (αD) v.v Sau đó, tiến hành ghi các phổ tử ngoại (UV-VIS), phổ hồng ngoại (FT-IR), phổ khối lượng (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều proton (1H-NMR), cacbon-13 (13C-NMR), phổ DEPT, phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều HSQC và HMBC với các kỹ thuật khác nhau tuỳ theo đối tượng cụ thể Các số liệu hóa lý thực nghiệm của các chất sạch được dùng xác định cấu trúc hoá học của chúng

2.2 Dụng cụ, hóa chất và thiết bị nghiên cứu

2.2.1 Dụng cụ, hoá chất

Các dung môi để ngâm chiết mẫu đều dùng loại tinh khiết (pure), khi dùng cho các loại sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng, sắc ký lớp mỏng điều chế sử dụng loại tinh khiết phân tích (p.a)

Sắc ký lớp mỏng tự chế với các kích thước khác nhau đã dùng loại silicagel G60 của hãng Merck tráng trên tấm thuỷ tinh và hoạt hóa ở nhiệt độ

120 0C thời gian từ 6 giờ đến 8 giờ Sắc ký lớp mỏng đế nhôm tráng sẵn Kieselgel 60F254 độ dày 0,2 mm (Art 5554)

Các hệ dung môi triển khai SKLM:

Các giá trị Rf trong hệ dung môi triển khai biểu thị là Rf A (B, C, D, E)x100

Sắc ký cột thường sử dụng silica gel Merck 60, cỡ hạt 70-230 mesh (0,040 - 0,063 mm) và 230-400 mesh (0,063 - 0,200 mm)

2.2.2 Thiết bị nghiên cứu

Nhiệt độ nóng chảy đo trên kính hiển vi Boёtus (Đức) hoặc trên máy Electrothermal IA-9200

Phổ hồng ngoại ghi trên máy IMPACT - 410 (Viện Hoá học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam) dưới dạng viên nén KBr

Phổ khối lượng ghi trên máy sắc ký lỏng ghép khối phổ với đầu dò MSD (LC-MSD-Trap-SL) sử dụng mode ESI và đầu dò DAD

Phổ 1H và 13C-NMR ghi trên máy Bruker 500MHz AVANCE, nội chuẩn TMS, dung môi CDCl3, CD3OD, DMSO-d6

2.3 Thu nhận các dịch chiết từ cây Mâm xôi

2.3.1 Thu nhận các dịch chiết

Mẫu thân cây tươi mới thu hái được sấy khô đem nghiền nhỏ rồi ngâm kiệt với metanol ở nhiệt độ phòng cho đến khi nhạt màu Dịch chiết được cất loại dung môi bằng máy cất quay ở nhiệt độ thấp và áp suất giảm Cặn dịch

chiết metanol được chiết lần lượt với n-hexan, etylaxetat, metanol và thu được

các cặn chiết tương ứng, sau khi đuổi hết dung môi cho các cặn tương ứng là

MXH (cặn n-hexan), MXE (cặn EtOAc) và MXM (cặn metanol) Việc thu

nhận các dịch chiết từ cây Mâm xôi (Rubus alceaefolius) theo sơ đồ sau:

Sơ đồ 2.1 Ngâm chiết mẫu cây Mâm xôi (Rubus alceaefolius)

MÉu M©m x«i kh«

(2,5 kg)

CÆn MeOH 260,1 g

Các phân đoạn dịch chiết nói trên được làm khan bằng Na2SO4 , lọc qua giấy lọc rồi cất kiệt dung môi dưới áp suất giảm, cặn được sấy khô và

cân đến khối lượng không đổi Như vậy, từ cây Rubus alceaefolius thu được

3 loại cặn chiết được ký hiệu lần lượt là: MXH, MXE và MXM

MXM: Cặn chiết MeOH của cây Rubus alceaefolius Poir

Kết quả thu nhận các dịch chiết từ cây Mâm xôi ở Yên Sơn, Tuyên

Quang được nêu trong bảng 2.1

Bảng 2.1 Khối lượng các cặn chiết thu được từ cây Mâm xôi

Khối lượng cặn chiết thu được (g) từ 468,6 g cặn MeOH đem chiết

Mẫu thu vào tháng 8/2011

Khối lượng mẫu khô (g)

Khối lượng cặn metanol tổng

thử, dung dịch xuất hiện màu xanh trong 1 thời gian là phản ứng dương tính

2.3.2.2 Phát hiện các ancaloit

Lấy 0.01g cặn các phân đoạn, thêm 5ml HCl, khuấy đều, lọc qua giấy lọc, lấy vào 3 ống nghiệm, mỗi ống 1ml nước lọc axit

Ống (1): 1 - 2 giọt dung dịch silicostungtic axit 5%, nếu có tủa trắng và nhiều là phản ứng dương tính

Ống (2): 1 - 2 giọt thuốc thử Dragendorff , nếu xuất hiện màu da cam là

phản ứng dương tính

Ống (3): 3 - 5 giọt thuốc thử Mayer, nếu xuất hiện tủa trắng là phản ứng dương tính

2.3.2.3 Phát hiện các flavonoit

Lấy 0,01g cặn của các phân đoạn, thêm 10ml metanol, đun nóng cho tan

và lọc qua giấy lọc Lấy 2ml nước lọc vào ống nghiệm, thêm một ít bột magiê (Mg) hoặc Zn, sau đó cho vào 5 giọt HCl đậm đặc, đun trong bình cách thuỷ vài phút Dung dịch xuất hiện màu đỏ, hoặc màu hồng là phản ứng dương tính với các flavonoit

2.3.2.4 Phát hiện các cumarin

Dịch để thử định tính được chuẩn bị như mục 2.3.2.1 Lấy vào 2 ống

nghiệm, mỗi ống 2 ml dịch thử cho vào một trong 2 ống đó 0,5 ml dung dịch NaOH 10% Đun cách thuỷ cả hai ống trên đến sôi, để nguội rồi cho thêm 4

ml nước cất vào mỗi ống Nếu chất lỏng ở ống có kiềm trong hơn ở ống không kiềm có thể xem là phản ứng dương tính, nếu đem axit hoá ống có kiềm bằng một vài giọt HCl đậm đặc sẽ làm cho dịch đang trong vẩn đục và màu vàng xuất hiện có thể tạo ra tủa là phản ứng dương tính

Ngoài ra, có thể làm phản ứng diazo hoá với axit sulfanilic trong môi trường axit, nếu cho màu da cam đến cam nhạt, cho kết quả dương tính đối với cumarin

2.3.2.5 Định tính các glucosit tim

Chuẩn bị dịch thử định tính cũng làm như mục 2.3.2.1

Phản ứng Legal: cho vào ống nghiệm 0,5ml dịch thử, thêm vào 1 giọt

dung dịch natri prussiat 0,5% và 2 giọt NaOH 10% nếu xuất hiện màu đỏ là phản ứng dương tính với vòng butenolit

Phản ứng Keller - Kilian: Thuốc thử gồm 2 dung dịch

Dung dịch 1: 100ml axit axetic loãng + 1ml FeCl3 5%

Dung dịch 2: 100ml axit H2SO4 đậm đặc + 1ml FeCl3 5%

Cách tiến hành: Lấy 0,01g cặn các dịch chiết cho vào ống nghiệm thêm

vào 1ml dung dịch 1, lắc đều cho tan hết, nghiêng ống nghiệm và cho từ từ 1ml dung dịch 2 theo thành ống nghiệm, quan sát sự xuất hiện của màu đỏ hay nâu đỏ, giữa hai lớp chất lỏng Nếu không xuất hiện màu là phản ứng âm tính với các glucosit tim

2.3.2.6 Định tính các saponin

Chuẩn bị dịch thử như ở mục 2.3.2.1 lấy 2 ống nghiệm mỗi ống cho

2ml dịch thử Ống 1 cho 1 ml HCl loãng, ống 2 cho 1 ml NaOH loãng rồi bịt miệng ống nghiệm, lắc trong vòng 5 phút theo chiều dọc, quan sát sự xuất hiện và mức độ bền vững của bọt Nếu bọt cao quá 3 - 4 cm và bền trên 15 phút là phản ứng dương tính

2.3.2.7 Định tính các tanin

Cân lấy 0,01g cặn chiết, thêm 10ml metanol nước cất, khuấy đều rồi nhỏ 2-3 giọt FeCl3 5%, nếu có màu xanh hoặc lục hoặc đen là phản ứng dương tính

Kết quả phân tích định tính các nhóm chất trong cây Rubus

alceaefolius, được nêu trong bảng 2.2