Luận văn Thạc sĩ Hoá học: Nghiên cứu thành phần hoá học cây Giảo cổ lam (Gynostemma pentaphyll Thunb.) họ Cucurbitaceae ở Bắc Kạn

Mục tiêu nghiên cứu của luận văn nhằm tìm hiểu một số thành phần hoá học có trong cây Giảo cổ lam (Gynostemma pentaphyllum) được trồng tại xã Khang Ninh, huyện Ba Bể, tỉnh Bắc Kạn. Mời các bạn cùng tham khảo!

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

NGÔ TUẤN VINH

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HOÁ HỌC CÂY GIẢO CỔ LAM

(GYNOSTEMMA PENTAPHYLLUM THUNB)

HỌ CUCURBITACEAE Ở BẮC KẠN

LUẬN VĂN THẠC SĨ HOÁ HỌC

Thái Nguyên – 2010

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

NGÔ TUẤN VINH

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HOÁ HỌC CÂY GIẢO CỔ LAM

(GYNOSTEMMA PENTAPHYLLUM THUNB)

HỌ CUCURBITACEAE Ở BẮC KẠN

Chuyên nghành : Hoá hữu cơ

LUẬN VĂN THẠC SĨ HOÁ HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS NGUYỄN QUYẾT TIẾN

Thái Nguyên – 2010

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DÙNG TRONG LUẬN VĂN

EI-MS : Electron Impact Mass Spectroscopy

FT-IR : Fourier Transform Infrared Spectroscopy

1

13

C-NMR : 13C- Nuclear Magnetic Resonance

DEPT : Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer

HMQC : Heteronuclear Multiple - Quantum Coherence

HMBC : Heteronuclear multiple - Bond Correlation

 Các lĩnh vực khác

v/v : Thể tích/thể tích

MỤC LỤC

Trang Lời cam đoan

2.1.1 Thu mẫu cây, xác định tên khoa học và phương pháp

xử lý mẫu

28

2.1.4 Phương pháp nhận dạng cấu trúc hoá học các chất 29

2.3 THU NHẬN CÁC DỊCH CHIẾT TỪ CÂY GIẢO CỔ LAM 31

3.2 Phân lập và nhận dạng các hợp chất có trong các dịch chiết khác

nhau của cây Giảo cổ lam (Gynostemma pentaphyllum)

Danh mục các công trình đã công bố liên quan đến luận văn 65

Mở đầu

Nước ta có diện tích khoảng 330.000 km2 Đồi núi chiếm 3/4 diện tích trong đó núi cao trên 500 m chiếm 1/3 diện tích lãnh thổ Khí hậu nhiệt đới gió mùa, có 2 mùa rõ rệt thay đổi theo địa hình Nhiệt độ trung bình hàng năm trên 22 0C, lượng mưa vào khoảng 1200 – 2800 mm, độ ẩm tương đối cao (trên 80%)

Những đặc thù về điều kiện tự nhiên như vậy rất thuận lợi cho hệ sinh thái phát triển Vì thế nước ta có hệ thực vật vô cùng phong phú và đa dạng Theo số liệu thống kê mới nhất có trên 12000 loài, trong đó có trên 3200 loài thực vật được sử dụng làm thuốc trong y học dân gian [4]

Từ xưa đến nay, những cây thuốc dân gian vẫn đóng vai trò hết sức quan trọng trong đời sống của con người Ngày nay, những hợp chất tự nhiên

có hoạt tính sinh học được phân lập từ cây cỏ đã được ứng dụng trong rất nhiều ngành công nghiệp cũng như ngành nông nghiệp, chúng được sản xuất thuốc chữa bệnh, thuốc bảo vệ thực vật, làm nguyên liệu cho ngành công nghiệp thực phẩm và mỹ phẩm…

Ngày nay, ngành công nghệ tổng hợp hoá dược phát triển mạnh mẽ đã tạo ra các biệt dược khác nhau được sử dụng trong công tác phòng, chữa bệnh nhờ đó giảm tỉ lệ tử vong, nâng cao tuổi thọ Tuy nhiên, vai trò của những thảo dược không vì thế mất đi chỗ đứng trong Y học Nó vẫn tiếp tục được dùng làm nguyên liệu trực tiếp, gián tiếp hoặc cung cấp những chất dẫn đường (lead-compounds) cho công nghệ bán tổng hợp nhằm tìm kiếm những dược phẩm mới đáp ứng cho việc điều trị các chứng bệnh thông thường cũng như các bệnh nan y (Ung thư, HIV, )

kiếm các loại thuốc mới có hiệu lực cao cho công tác phòng và chữa bệnh Việc nghiên cứu cây thuốc đã giúp cho chúng ta hiểu rõ về thành phần và cấu trúc hoá học, hoạt tính sinh học, tác dụng dược lí của cây thuốc Từ đó, người

ta có thể tạo ra các chất mới có hoạt tính sinh học cao hơn để làm thuốc chữa bệnh

Giảo cổ lam (tiếng Trung: 絞股藍) hay còn gọi là dây Lõa hùng, Trường sinh thảo, Thất diệp đảm (七葉膽), Ngũ diệp sâm (五葉蔘), Cổ yếm, Dần toòng, Thư tràng 5 lá, Cam trà vạn hoặc Nhân sâm phương nam với danh

pháp khoa học là Gynostemma pentaphyllum thuộc họ Bầu bí (Cucurbitaceae)

[2][3]

Người Trung Quốc từ lâu xem Thất diệp đảm này như thuốc trường sinh, bởi lẽ người dân ở tỉnh Quý Châu uống trà thất diệp đảm thường xuyên thì sống rất thọ Cây này còn được gọi là nhân sâm phương Nam hay nhân sâm 5 lá, mặc dù thực tế loài này không có họ hàng gì với nhân sâm đích thực Cây này cũng được dùng ở Nhật Bản với tên amachazuru, ở Hàn Quốc với tên gọi dungkulcha và nhiều nước khác

Ở Việt Nam, vào năm 1997 giáo sư Phạm Thanh Kỳ đã phát hiện cây Thất diệp đảm trên núi Phan Xi Păng và được giáo sư Vũ Văn Chuyên xác

định đúng là loại Gynostemma pentaphyllum Thời gian gần đây, ở Việt Nam

được chế biến thành trà túi lọc và dạng viên dùng điều trị tiểu đường rất tốt Tuy nhiên, thành phần hóa học của cây này còn ít được nghiên cứu về cả trong và ngoài nước, mặc dù nó được sử dụng khá phổ biến trong Y học dân tộc Do vậy, chúng tôi chọn cây này làm đối tượng nghiên cứu với tên đề tài:

“Nghiên cứu thành phần hoá học cây Giảo cổ lam (Gynostemma

pentaphyll Thunb.), họ Cucurbitaceae ở Bắc Kạn”

Chương I

TỔNG QUAN

1.1 Cây Giảo cổ lam và sử dụng trong Y học cổ truyền

1.1.1 Mô tả thực vật

Giảo Cổ Lam có tên khoa học là Gynostemma pentaphyllum, thuộc chi

Gynostemma, họ Cucurbitaceae, bộ: Cucurbitales, lớp Magloniopsida, ngành

Magloniophta, giới Platae

Phân bố địa lí:

Cây Giảo Cổ Lam mọc ở rải rác dọc khe suối, trên đá vôi, sa thạch, đất núi lửa, thường dưới tán rừng thưa hay trảng cây bụi Trên độ cao từ 200 – 2.000m tại Trung Quốc, Nhật Bản, Ấn Độ, Indonesia, Triều Tiên, Philippin Việt Nam và một số nước châu Á khác [3]

Thuộc họ bầu bí, loại thảo dược có khả năng chống lão hóa và nhiều

công dụng khác này còn được coi là "nhân sâm phương nam", vì loại thảo

dược này được trồng tại miền núi vùng trung nam Trung Quốc

Đặc điểm sinh trưởng và phát triển:

Cây hàng năm, thân thảo mảnh, leo nhờ tua cuốn đơn ở nách lá Có cây đực và cây cái riêng biệt, với lá kép hình chân vịt, mép răng cưa với lông trắng Lá có cuống chung dài 3-4 cm, phiến do 5-7 lá chét có răng, dài 3-9

cm, rộng 1,5-3 cm Cụm hoa hình chùy mang nhiều hoa nhỏ màu trắng, các cánh hoa xòe hình sao, ống bao hoa rất ngắn, cánh hoa rời nhau cao 2,5mm, nhị 5, bao phấn dính thành đĩa, bầu có 3 vòi nhụy Quả khô hình cầu đường kính 5 – 9mm, có 2-3 hạt, khi chín có màu đen Ra hoa tháng 7-8, quả tháng 9-10 [2],[3],[17]

Hình 2.1: Cây Giảo Cổ Lam ( Gynostemma pentaphyllum )

Một số tác dụng sinh học: [15][25]-[28]

Năm 1976 cây Giảo cổ lam bắt đầu được nghiên cứu ở Nhật Bản Việc phát hiện ra cây này là do tình cờ nghiên cứu một bộ lạc sống trên núi cao có tuổi thọ bình quân là 98 tuổi mà nguyên nhân do người dân sinh sống ở đây thường xuyên dùng cây này để uống Các nghiên cứu về Giảo cổ lam vẫn đang được thực hiện tại nhiều nước như Trung Quốc, Hoa Kỳ, Đức, Italia

Có thể liệt kê một số nghiên cứu điển hình như:

- GS Tan H., Liu Z.L.,Liu MJ Chứng minh GCL có tác dụng kìm hãm

sự tích tụ tiểu cầu, làm tan cục máu đông, chống huyết khối, tăng cường lưu thông máu lên não

- Lin, J.M., và cộng sự chứng minh GCL có tác dụng chống viêm gan, chứng cao huyết áp và chống ung thư Có tác dụng chống viêm mạnh hơn Indomethacin

- Wang C Và cộng sự chứng minh GCL kìm hãm sự phát triển của khối u mạnh

Trong một nghiên cứu mới nhất gần đây phối hợp giữa các nhà khoa học Việt Nam và Hàn Quốc, các nhà khoa học đã tách chiết được một hoạt chất mới trong cây Giảo cổ lam Việt Nam có tác dụng kháng tế bào ung thư Thử nghiệm bước đầu trên sáu dòng tế bào ung thư cho kết quả khả quan Nhất là ung thư vú, tử cung, tuyến tiền liệt, phổi

Ở nước ta, nghiên cứu của GS.TS Phạm Thanh Kỳ cho thấy Giảo cổ lam chứa saponin cấu trúc triterpen kiểu khung dammaran mà trong đó có nhiều cấu trúc giống như saponin của nhân sâm và tam thất Ngoài ra, nó còn chứa flavonoit là các chất có tác đa dụng sinh học như kháng viêm, chống ô

xi hóa Hơn nữa, nó cũng còn chứa nhiều amino axit tan trong nước, các loại vitamin và các nguyên tố vi lượng như Fe, Zn, Se

Các thử nghiệm cho thấy Giảo cổ lam giúp hạ mỡ máu và huyết áp, hạ đường huyết, rất tốt cho tim mạch, giúp dễ ngủ và ngủ sâu giấc, giảm béo Giảo cổ lam giúp kìm hãm sự phát triển của khối u, điều trị chứng xơ vữa động mạch, chữa hen phế quản, viêm gan Trong bối cảnh môi trường ô nhiễm, thực phẩm mất an toàn và công việc căng thẳng, con người có xu hướng sử dụng các sản phẩm từ thiên nhiên để giải độc cơ thể, nâng cao sức

đề kháng, chống lại sự lão hóa, ngăn ngừa và hỗ trợ điều trị bệnh Giảo cổ lam là một lựa chọn tuyệt vời cho mục đích trên, nhất là đối với các bệnh mỡ máu, cao huyết áp, tiểu đường, tim mạch

hạ đường huyết rất tốt (đặt tên là phanoside) Chất này chưa từng được công

bố tìm thấy trong cây Giảo cổ lam mọc ở các nước khác, điều đó chứng tỏ chất lượng giảo cổ lam của Việt Nam có tính đặc hữu

1.1.2 Một số bài thuốc chữa bệnh đái tháo đường trong Y học cổ truyền

[21]-[24]

Cho đến nay, Y học dân gian Việt Nam đã sử dụng khá nhiều bài thuốc, dược liệu để điều trị bệnh hiệu quả Dưới đây là một số bài thuốc và dược liệu

để điều trị đái tháo đường

* Nhân sâm bạch hổ thang: nhân sâm 8-10g, sinh địa 12g, thiên hoa

phấn 12g, ngọc trúc, thiên môn, mạch môn, địa cốt bì, đơn sâm, đơn bì (cùng 12g), thạch cao (sống) 40-60g, tri mẫu 10g, cam thảo tươi 4g Đem sắc (nấu) uống Tùy trường hợp mà gia giảm khác nhau

* Mạch môn đông thang gia giảm: hoàng cầm, mạch môn, cát căn

(cùng 15g), tri mẫu, trúc diệp, ô mai, lô căn (cùng 10g), thiên hoa phấn, sa sâm (cùng 20g) Nếu trường hợp thận âm hư - biểu hiện khát và uống nhiều, tiểu nhiều và tiểu nhiều lần, lòng bàn chân tay nóng, váng đầu, mệt mỏi, đau lưng, mỏi gối, lưỡi đỏ

* Tư thận, dưỡng âm, thanh nhiệt, sinh tân", dùng bài "Lục vị địa hoàng

hoàn gia giảm", gồm các vị: sinh địa, sơn dược (cùng 20g), đơn bì, bạch linh,

mạch đông, thiên hoa phấn, huyền sâm, sơn thù nhục (cùng 12g), tang phiêu tiêu 10g, ngũ vị tử, cam thảo (cùng 4g)

* Ôn bổ thận dương, dùng bài Kim quỹ thận khí hoàn, hoặc Lộc nhung

hoàn gia giảm, gồm các vị: sinh địa 34g, thục địa 24g, hoài sơn, nữ trinh tử,

đơn bì (đều 12g), bạch linh, trạch tả (cùng 10g), phụ tử, nhục quế (đều 6g), đỗ trọng 15g, xương bồ 3g, tang phiêu tiêu 14g, sinh huỳnh kỳ 16g, lộc nhung

Cách nấu những bài thuốc trên: cho các vị thuốc vào cùng 4 chén nước, nấu còn 3 chén; nước thứ hai cho vào cùng 3 chén nước, nấu còn nửa chén Hòa hai nước lại chia làm 3 lần dùng trong ngày, lúc còn nóng ấm

* Lục vị gia giảm: sinh địa, hoài sơn (mỗi vị 50g), đơn bì, bạch linh,

trạch tả (mỗi vị 12g), sơn thù (16g), gia sinh huỳnh kỳ, cát căn, thiên hoa phấn (mỗi vị 20g) Đem sắc uống cả ngày Nếu âm hư cực thịnh (khát nước, uống nhiều, môi khô, họng khô, người gầy, da khô, lưỡi đỏ, khó ngủ ) thì gia thêm các vị: ngũ vị tử, thiên môn, mạch môn (mỗi vị 16g)

* Bát vị tri bá gia giảm: Sinh địa 12g, Sinh hoàng kỳ 12g, Sơn thù nhục

8g, Tri mẫu 10g, Bạch linh 8g, Thiên hoa phấn 8g, Ngũ vị tứ 8g, Đan bì 8g, Trạch tá 8g, Thạch cao 12g và Mạch môn 12g Sắc ngày 1 thang, lấy 300ml nước uống chia làm 2 lần/ngày, uống trước bữa ăn 1 giờ

* Ngọc trúc khổ qua sinh địa thang : Ngọc trúc 10g, Khổ qua 25g, Sinh

địa 10g, Phá cố chỉ 12g, Thổ ty tử 10 Các vị trên cho vào 600ml nước sắc còn 200 m, chia uống 2 lần trên ngày

* Qua lâu điền thảo tân : Thiên hoa phấn (Qua lâu căn) 100g, Từ điền

thảo ( Cỏ bợ ) 100g sấy giòn, tán bộn mịn Ngày uống 2 lần mỗi lần 10g

* Hoài sơn điền thảo thang : Hoài sơ ( sao vàng ) 20g, Từ điền thảo

20g, Nhàu quả 12g, Thổ ty tử : 10g Các vị trên cho vào 600ml nước sắc còn

200 m, chia uống 2 lần trên ngày

Hữu quy ẩm gia giảm : Thục địa 20g, Hoài sơn 15 g, Đỗ trọng 9 g, Kỷ

tử 9g, Cao ban long 6g, Ích trĩ nhân 12g Cao ban long để riêng, các vị cho vào 800ml nước sắc còn 200ml, hoà tan Cao ban long chia làm 2 phần, uống lúc nóng

* Hoa áctisô 50g, ý dĩ 50g, lá lách lợn 150g, gia vị vừa đủ Hoa áctisô,

một liệu trình là 10 ngày, thời gian nghỉ giữa các liệu trình là 5 ngày Cần dùng 3-4 liệu trình

* Bài thuốc: Nhân sâm 15g, thiên môn 30g, sơn thù 25g, câu kỷ 15g, sinh địa 15g Sắc riêng nhân sâm và cô thành 30ml cao, sắc chung 4 dược liệu còn lại và cô thành 170ml cao lỏng, trộn lẫn hai cao này Mỗi lần uống 20ml, ngày dùng 2-3 lần trước bữa ăn

* Bài thuốc: Sinh địa 800g, hoàng liên 600g Giã sinh địa vắt lấy nước, tẩm vào hoàng liên, phơi khô rồi lại tẩm, làm như vậy cho đến hết nước sinh địa Tán nhỏ hoàng liên, làm thành viên Mỗi lần uống 10g, ngày dùng 2-3 lần

* Bài thuốc: Sinh địa, hoài sơn, phục linh, mỗi vị 15g; Sơn thù, trạch

tả, ngưu tất, mỗi vị 10g; Hạt mã đề, mẫu đơn bì, mỗi vị 6g Sắc uống ngày một thang

* Bài thuốc: Thiên môn 12g, thạch cao 20g; Sa sâm, mạch môn, hoài sơn, bạch biển đậu, ý dĩ, mỗi vị 12g; Tâm sen 8g Sắc uống ngày 1 thang

* Bài thuốc: Bạch truật 12g, hoàng kỳ 65g, đảng sâm 25g, hoài sơn 15g, phục linh 12g Sắc uống ngày 1 thang Mỗi đợt điều trị 2 tháng

Theo Võ Văn Chi ghi trong “Từ điển cây thuốc Việt Nam” Giảo cổ lam có vị đắng, tính hàn, có tác dụng tiêu viêm giải độc, ngừng ho và long đờm [2]

Qua nghiên cứu ở Việt Nam và trên thế giới, Giảo cổ lam có tác dụng điều chỉnh các rối loạn chuyển hóa của cơ thể như rối loạn mỡ máu, đường huyết, huyết áp, tim mạch Thành phần hoạt chất trong cây Giảo cổ lam rất đặc biệt, có nhiều saponin giống nhân sâm giúp chống lại sự lão hóa và ngăn ngừa bệnh tật, làm tăng tính thích nghi của cơ thể, nâng cao miễn dịch, giải độc mạnh Trong cây giảo cổ lam có nhiều chất flavonoit có tác dụng chống

Giảo cổ lam một dược liệu quý với rất nhiều tác dụng như: hạ mỡ máu, bảo vệ tim mạch, hạ đường huyết, hạ huyết áp [1] Saponin chiết xuất từ Giảo

cổ lam ức chế sự hình thành và phát triển khối u một cách rõ rệt, ngoài ra còn

có tác dụng hạn chế ngộ độc gan trong mô hình thực nghiệm [7] Sở dĩ Giảo

cổ lam có tác dụng chống u là vì cơ chế giải độc mạnh và giúp điều chỉnh những rối loạn chuyển hóa ở cấp tế bào, chống lại sự đột biến, đồng thời làm tăng miễn dịch của cơ thể

Kết quả thử nghiệm trên chuột cho thấy Giảo cổ lam có tác dụng tăng đáp ứng miễn dịch gây ức chế bằng Cyclophosphamid và tia xạ [5] Cao lỏng giảo cổ lam có tác dụng ức chế sự tăng cholesterol trong máu động vật (chuột nhắt trắng) ở cả hai phương pháp tăng cholesterol nội sinh và ngoại sinh [6] Tăng thể lực toàn diện trên chuột, giúp thời gian và khả năng vận động tăng lên

Gynostemma pentaphyllum được sử dụng phổ biến tại Trung Quốc là

loại thảo dược chống lão hóa hoặc thuốc bổ để điều trị bệnh viêm cuống phổi, tăng cường thể lực cơ thể, giảm mệt mỏi, cải thiện khả năng sinh dục và tăng cường sức đề kháng

1.2 Chi Gynostemma và thành phần hoá học của chúng

1.2.1 Giới thiệu về chi Gynostemma

Theo Danh lục các loài thực vật Việt Nam, chi Gynostemma có 2 loài

là: Gynostemma laxum (Wall) - Cổ yếm lá bóng, Gynostemma pentaphyllum

(Thunb) - Cổ yếm Hiện nay, nước ta trồng Giảo cổ lam chủ yếu ở : Bắc Kạn, Lào Cai, Hà giang, Cao Bằng, Lạng Sơn, Quảng Ninh, Hoà Bình, Huế, Kon Tum, Gia Lai [3]

loài gần giống nhau

1.2.2 Về thành phần hoá học

Từ các bộ phận các loài của chi Gynostemma, người ta đã phân lập

được một số lớp chất như: tecpenoit, tecpenoit - glycosit và flavonoit

14-methylergosta-9(11),24(28)-dien-3 Phân lập từ Gynostemma pentaphyllum

- -Phân lập từ Panax ginseng, Panax

japonicus, Panax quinquefolium và

OH O O HO

O

O O

OH OH OH

7b

Gypenosit LXVIII

-Phân lập từ Panax japonicus và Gynostemma pentaphyllum

-Điểm nóng chảy: 204–206

o

C Trạng thái: tinh thể -Góc quay cực: [  ]22D +6.8 (c, 5,6 trong MeOH)

OH HO HO

7c

Gypenosit LXIX Yesanchinoside H

-Phân lập từ Panax japonicus và Gynostemma pentaphyllum

-Điểm nóng chảy: 204–206

o

C Trạng thái: tinh thể

-Góc quay cực: [  ]22D +6,8 (c, 5,6 trong MeOH)

OH

OH OH

+10,3 (c, 3,4 trong MeOH)

Glu

9a

Gynosaponin TN1

- -Phân lập từ Gynostemma

pentaphyllum

-Điểm nóng chảy: 168–173 o

C Trạng thái tinh thể

-Góc quay cực: [  ]23D +34,5 (c, 0,9 trong MeOH)

O HO HO OH

O O

OH OH HO

Rham-Glu

9b

Gynosaponin TN2

- -Phân lập từ Gynostemma

pentaphyllum

-Điểm nóng chảy: 236– 240 o

C Trạng thái tinh thể

-Góc quay cực: [  ]23D +11,6 (c, 1,0 trong MeOH)

O O

OH OH HO

Rham-Glu

9c

Gypenosit XLV

pentaphyllum và lá của

Gymnema sylvestre

-Điểm nóng chảy: 196– 198oC Trạng thái tinh thể

-Góc quay cực: [  ]23D +9,3 (c, 4,1 trong MeOH)

O O

OH OH HO

9d

Gypenosit LVII

- -Phân lập từ Gynostemma

pentaphyllum

-Điểm nóng chảy: 289 – 191 o

C Trạng thái tinh thể

-Góc quay cực: [  ]23D +11,8 (c, 3,81 trong MeOH)

OH OH

9e

Gypenosit XLVI

- -Phân lập từ Gynostemma

pentaphyllum

- -Điểm nóng chảy: 190 – 192 o

HO OH

OH OH

-Góc quay cực: [  ]14D +11,3 (c, 0,98 trong MeOH)

- -Phân lập từ Gynostemma

pentaphyllum

-Điểm nóng chảy: 248 – 250 o

C Trạng thái tinh thể

-Góc quay cực: [  ]22D - 10,1 (c, 2,3 trong pyridin)

O O

O O

OH OH HO

11a

Gypenosit LVI

- -Phân lập từ Gynostemma

pentaphyllum

O O HO

O O HO

O O HO

HO

O O HO

HO

HO

O

OH HO

HO

OH

11d

Gypenosit XLII

3-O-[β-D-glucopyranosit]

- -Phân lập từ Gynostemma

pentaphyllum

-Trạng thái chất vô định hình

-Góc quay cực: [  ]18D - 2,32 (c, 0,03 trong MeOH)

O O

3-O-[β-D-glucopyranosit]

- -Phân lập từ Gynostemma

pentaphyllum

-Trạng thái chất vô định hình

-Góc quay cực: [  ]18D - 6,0 (c, 0,03 trong MeOH)

HO

HO

O OH

OH

OH

13a

Gypenosit LXXVII

- -Phân lập từ Gynostemma

pentaphyllum

-Điểm nóng chảy: 216–218 o

C Trạng thái tinh thể

-Góc quay cực: [  ]22D +9,0 (c, 6,7 trong MeOH)

OH

O O O

OH

HO

HO

O OH

- -Phân lập từ Gynostemma

pentaphyllum

-Điểm nóng chảy: 173–175oC Trạng thái tinh thể

-Góc quay cực: [  ]22D +13.7 (c, 6,4 trong MeOH)

O O

-Góc quay cực: [  ]22D +15,2 (c, 1,8 trong MeOH)

OH HO

HO

14b

Gypenosit XXXII

- -Phân lập từ Gynostemma

pentaphyllum

-Điểm nóng chảy: 151–153 o

C Trạng thái tinh thể

- -Góc quay cực: [  ]22D 7,0 (c, 1,2 trong pyridin)

O OH

-Góc quay cực: [  ]22D + 16,7 (c, 1,9 trong MeOH)

OH

O O OH

- -Góc quay cực: [  ]22D + 31,4 (c, 3,3 trong MeOH)

C Trạng thái tinh thể

- -Góc quay cực: [  ]22D + 4,9 (c, 1,09 trong MeOH)

OH OH HO

C Trạng thái tinh thể

- -Góc quay cực: [  ] 22

D + 12,7 (c, 2,5 trong MeOH)

- -Phân lập từ Gynostemma

pentaphyllum

-Điểm nóng chảy: 174–176oC Trạng thái tinh thể

- -Góc quay cực: [  ]22D + 7,1 (c, 1,4 trong pyridin)

O OH

- -Góc quay cực: [  ]D + 10,3 (c, 3,4 trong MeOH)

OH

O O

O OH

HO

HO

O OH

- -Góc quay cực: [  ] 22

D + 10,2 (c, 5,1 trong MeOH)

OH HO

HO

15h

3,19,20,21-tetrol-3- O-[α-L-

Dammar-24-ene- (12)-[β-D-

rhamnopyranosyl- α-L-

xylopyranosyl-(13)]-arabinopyranosit], 21-O-β-D-

- -Phân lập từ Gynostemma

pentaphyllum

-Trạng thái chất vô định hình

- -Góc quay cực: [  ]20D - 12,2 (c, 1,14 trong MeOH)

HO

O HO

HO

HO

O HO

HO

O HO

C Trạng thái chất bột

- -Góc quay cực: [  ] 22

D -2,7 (c, 1,3 trong MeOH)

Nhóm 11:

OH

O O O O

OH

HO HO

O O

O O HO

OH OH OH HO

OH OH

O

O OH

OH OH

O

OH OH

O

OH OH OH

19

- Gynosaponin O: + Phân lập từ Gynostemma pentaphyllum

+ Điểm nóng chảy: 202 – 205 o

C + Trạng thái tinh thể

+ Góc quay cực: []22

D - 1,3 (c; 2,5 trong MeOH)

OH

O HO

OH

OH

O

O O

HO

OH OH

O OH OH

O O OH OH

O

OH OH OH

O OH OH OH

20

- Gynosaponin T: + Phân lập từ Gynostemma pentaphyllum

+ Điểm nóng chảy: 177 – 179 o

C + Trạng thái tinh thể

+ Góc quay cực: []22

D - 2.69 (c, 1,3 trong MeOH)

1.2.2.3 Flavonoit:

Từ chi Gynostemma người ta đã phát hiện một vài flavonoit như: các

hợp chất Yixingensin (Ombuin 3-glucosit) (21), 3-O-[α-L-rhamnopyranosyl(1→6)]-β-D-glucopyranosit (22), 5,3’-dihydroxy-

5,7,3’,4’-tetrahydroxyflavon-7,4’-dimetoxyflavon-3-O-[α-L-rhamnopyranosyl(1→6)]-β-D-glucopyranosit

(23) [8] và vitexin (24) [16] từ loài Gynostemma pentaphyllum

21

Yixingensin 3,3’,5-trihydroxy-4’,7-dimethoxyflavon-3-O--D-glucopyranosit

(Ombuin 3-glucosit)

CHƯƠNG 2

PHẦN THỰC NGHIỆM

Cây Giảo cổ lam (Gynostemma pentaphyllum ) mới phát hiện tại Việt

Nam nhưng đã được sử dụng khá nhiều trong các bài thuốc chữa bệnh đái tháo đường Có một số công trình nghiên cứu về Giảo cổ lam nhưng những hiểu biết về thành phần hoá học và tác dụng dược lí của Giảo cổ lam vẫn còn chưa nhiều Mới đây, ở Việt Nam nó được dùng để điều trị tiểu đường rất tốt Tuy nhiên, thành phần hóa học của cây này còn ít được nghiên cứu về mặt hóa học cả trong và ngoài nước, mặc dù nó được sử dụng khá phổ biến trong

Y học dân tộc Vì thế, Giảo cổ lam được chọn làm đối tượng nghiên cứu hoá thực vật

Nhiệm vụ của luận văn là tìm hiểu một số thành phần hoá học có trong

cây Giảo cổ lam (Gynostemma pentaphyllum) được trồng tại xã Khang Ninh,

huyện Ba Bể, tỉnh Bắc Kạn

2.1 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1.1 Thu mẫu cây, xác định tên khoa học và phương pháp xử lý mẫu

Nguyên liệu để nghiên cứu là Giảo cổ lam, cây tươi được thu hái 12/2009 tại Khang Ninh – Ba Bể - Bắc Cạn Mẫu Giảo cổ lam để nghiên cứu hoá thực vật đã được TS Đỗ Hữu Thư (Viện Sinh thái và tài nguyên sinh vật

- Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam) giám định tên khoa học là

Gynostemma pentaphyllum, thuộc chi Gynostemma, họ Cucurbitaceae, bộ:

Cucurbitales, lớp Magloniopsida, ngành Magloniophta, giới Platae

20 kg mẫu thân lá Giảo cổ lam tươi được sấy ở nhiệt độ 110 0C trong 10 phút để diệt men, sau đó hong khô ở nơi thoáng mát rồi sấy ở nhiệt độ 50 0

C -

0C tới khi khối lượng không đổi (độ ẩm dưới 10%) thu được 2,0 kg mẫu

2.1.2 Phương pháp ngâm chiết

Mẫu cây tươi mới thu hái được sấy khô đem nghiền nhỏ rồi ngâm kiệt với metanol ở nhiệt độ phòng cho đến khi nhạt màu Dịch chiết được cất loại dung môi ở áp suất giảm Sau đó, cặn dịch chiết metanol được chiết lần lượt với n-hexan, etylaxetat, metanol và thu được các cặn chiết tương ứng, các dịch chiết n-hexan, etylaxetat và metanol được làm khan bằng NaSO4 và lọc qua giấy lọc, Các dịch lọc được loại bỏ dung môi bằng thiết bị cất quay ở nhiệt ≤ 50 0C dưới áp suất giảm, thu được 3 cặn tương ứng n–hexan (GyH), etylaxetat (GyE) và metanol (GyM) Quá trình nghiên cứu sẽ được trình bày chi tiết ở phần thực nghiệm

2.1.3 Phương pháp phân lập các hợp chất từ dịch chiết

Để phân tích và phân tách hỗn hợp các chất cũng như phân lập các hợp chất cần sử dụng phối hợp các phương pháp sắc ký như:

- Sắc ký lớp mỏng (SKLM)

- Sắc ký cột thường dùng Silica gel Merck 63-200 mesh, cột pha đảo bằng với các dung môi và hệ dung môi thích hợp

- Kết tinh phân đoạn và kết tinh lại

2.1.4 Phương pháp nhận dạng cấu trúc hoá học các chất

Các chất phân lập được ở dạng tinh khiết là đối tượng để khảo sát các đặc trưng vật lý: màu sắc, mùi, dạng thù hình, Rf, điểm nóng chảy (Mp), đo

độ quang hoạt (αD) v.v khi thu được các chất sạch, tiến hành ghi các phổ tử ngoại (UV), phổ hồng ngoại (FT-IR), phổ khối lượng phân giải cao (FT-ICR-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR), cacbon-13 (13C-NMR), phổ DEPT, phổ HSQC và phổ HMBC với các kỹ thuật một chiều (1D-NMR) và

2.2 DỤNG CỤ, HOÁ CHẤT VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU

2.2.1 Dụng cụ, hoá chất

Các dung môi để ngâm chiết mẫu đều dùng loại tinh khiết (pure), khi dùng cho các loại sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng, sắc ký lớp mỏng điều chế phải

sử dụng loại tinh khiết phân tích (PA)

Sắc ký lớp mỏng tự chế với các kích thước khác nhau đã dùng loại silica gel G60 của hãng Merck tráng trên tấm thuỷ tinh và hoạt hoá ở nhiệt độ

độ dày 0,2 mm (Art 5554)

Các hệ dung môi triển khai SKLM:

Các giá trị Rf trong hệ dung môi triển khai biểu thị là Rf A (B, C)x100

Sắc ký cột thường sử dụng silica gel Merck 60, cỡ hạt 70 - 230 mesh (0,040 - 0,063 mm) và 230-400 mesh (0,063 - 0,200 mm)

2.2.2 Thiết bị nghiên cứu

Phổ 1H và 13C-NMR ghi trên máy Bruker 500MHz AVANCE, chuẩn nội TMS, dung môi CDCl3, CD3OD, DMSO-d6

2.3 THU NHẬN CÁC DỊCH CHIẾT TỪ CÂY GIẢO CỔ LAM

2.3.1 Thu nhận các dịch chiết

Mẫu cây tươi mới thu hái được sấy khô đem nghiền nhỏ rồi ngâm kiệt với metanol ở nhiệt độ phòng cho đến khi nhạt màu Dịch chiết được cất loại dung môi ở áp suất giảm Cặn dịch chiết metanol được chiết lần lượt với n-hexan, etylaxetat, metanol và thu được các cặn chiết tương ứng, làm khan bằng Na2SO4 Việc thu nhận các dịch chiết từ cây Giảo cổ lam (Gynostemma

pentaphyllum) xem sơ đồ 2.1

Sơ đồ 2.1: Sơ đồ ngâm chiết mẫu cây Giảo cổ lam

(Gynostemma pentaphyllum)

2,0 kg Gi¶o cæ lam kh«

CÆn kh« Metanol

1 MeOH 2.Lo¹i dung m«i

C« kh« + MeOH C« quay

EtOAc C« quay

n-hexan

C« quay

Cặn được làm khô đến khối lượng không đổi và cân xác định trọng lượng Từ Giảo cổ lam đã thu được 3 loại cặn chiết được ký hiệu là:

GyH; GyE; GyM

Ở đó: GyH : Cặn chiết n-Hexan

GyE : Cặn chiết EtOAc

Kết quả thu nhận các cặn dịch chiết từ cây Giảo cổ lam (Gynostemma

pentaphyllum) ở Khang Ninh – Ba Bể - Bắc Kạn được nêu trong bảng 2.1

Bảng 2.1 : Khối lượng các cặn chiết thu được từ cây Giảo cổ lam

lượng khô)

Khối lượng cặn chiết khô (g)

n-Hexan (% so với trọng lượng khô)

EtOAc (% so với trọng lượng khô)

MeOH (% so với trọng lượng khô)

(10%)

66,26 (3,31%)

( GyH)

21,1 (1,05 %)

( GyE)

174,3 (8,71%)

Ống (2): 1 - 2 giọt thuốc thử Dragendorff , nếu xuất hiện màu da cam là

phản ứng dương tính

Ống (3): 3 - 5 giọt thuốc thử Mayer, nếu xuất hiện tủa trắng là phản ứng dương tính

2.3.2.3 Phát hiện các flavonoit

Lấy 0,01g cặn của các phân đoạn, thêm 10ml mêtanol, đun nóng cho tan

và lọc qua giấy lọc Lấy 2ml nước lọc vào ống nghiệm, thêm một ít bột magiê (Mg) hoặc Zn, sau đó cho vào 5 giọt HCl đậm đặc, đun trong bình cách thuỷ vài phút Dung dịch xuất hiện màu đỏ, hoặc màu hồng là phản ứng dương tính với các flavonoit

2.3.2.4 Phát hiện các cumarin

Dịch để thử định tính được chuẩn bị như mục 2.3.2.1 Lấy vào 2 ống

nghiệm, mỗi ống 2 ml dịch thử cho vào một trong 2 ống đó 0,5 ml dung dịch NaOH 10% Đun cách thuỷ cả hai ống trên đến sôi, để nguội rồi cho thêm 4

ml nước cất vào mỗi ống Nếu chất lỏng ở ống có kiềm trong hơn ở ống không kiềm có thể xem là phản ứng dương tính, nếu đem axit hoá ống có kiềm bằng một vài giọt HCl đậm đặc sẽ làm cho dịch đang trong vẩn đục và màu vàng xuất hiện có thể tạo ra tủa là phản ứng dương tính

Ngoài ra có thể làm phản ứng điazo hoá với axit sulfanilic trong môi trường axit, nếu cho màu da cam đến cam nhạt, cho kết quả dương tính đối với cumarin

2.3.2.5 Định tính các glucosit tim

Chuẩn bị dịch thử định tính cũng làm như mục 2.3.2.1

+ Phản ứng Legal: cho vào ống nghiệm 0,5ml dịch thử, thêm vào 1 giọt

dung dịch natri prussiat 0,5% và 2 giọt NaOH 10% nếu xuất hiện màu đỏ là

phản ứng dương tính với vòng butenolit

+ Phản ứng Keller - Kilian: Thuốc thử gồm 2 dung dịch

Dung dịch 1: 100ml axit axetic loãng + 1ml FeCl3 5%

Dung dịch 2: 100ml axit H2SO4 đậm đặc + 1ml FeCl3 5%

Cách tiến hành: Lấy 0,01g cặn các dịch chiết cho vào ống nghiệm thêm

vào 1ml dung dịch 1, lắc đều cho tan hết, nghiêng ống nghiệm và cho từ từ

1ml dung dịch 2 theo thành ống nghiệm, quan sát sự xuất hiện của màu đỏ

hay nâu đỏ, giữa hai lớp chất lỏng Nếu không xuất hiện màu là phản ứng âm

tính với các glucosit tim

2.3.2.6 Định tính các saponin

Chuẩn bị dịch thử như ở mục 2.3.2.1 lấy 2 ống nghiệm mỗi ống cho

2ml dịch thử Ống 1 cho 1 ml HCl loãng, ống 2 cho 1 ml NaOH loãng rồi bịt

miệng ống nghiệm, lắc trong vòng 5 phút theo chiều dọc, quan sát sự xuất

hiện và mức độ bền vững của bọt Nếu bọt cao quá 3 - 4 cm và bền trên 15

phút là phản ứng dương tính

Kết quả phân tích định tính các nhóm chất trong cây Giảo cổ lam

(Gynostemma pentaphyllum) được nêu trong bảng 2.2