Khảo sát hoạt tính gây độc tế bào in vitro của cao chiết từ cây sài đất (wedelia chinensis (osbeck ) merr ) trên tế bào đơn nhân được chiết từ máu ngoại vi người

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH NGUYỄN THỊ BẢO ANH KHẢO SÁT HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO IN VITRO CỦA CAO CHIẾT TỪ CÂY SÀI ĐẤT (WEDELIA CHINENSIS (OSBECK.) MERR.) TRÊN TẾ BÀO ĐƠN NHÂN ĐƯỢC CHIẾT TỪ MÁU NGOẠI VI NGƯỜI LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC Tp Hồ Chí Minh - 2020 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH NGUYỄN THỊ BẢO ANH KHẢO SÁT HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO IN VITRO CỦA CAO CHIẾT TỪ CÂY SÀI ĐẤT (WEDELIA CHINENSIS (OSBECK.) MERR.) TRÊN TẾ BÀO ĐƠN NHÂN ĐƯỢC CHIẾT TỪ MÁU NGOẠI VI NGƯỜI Luận văn thạc sĩ dược học Chuyên ngành: Dược lý Dược lâm sàng Mã số chuyên ngành: 8720205 Người hướng dẫn khoa học : TS Nguyễn Thị Minh Thuận Thành phố Hồ Chí Minh - 2020 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu khoa học độc lập tôi, hướng dẫn TS Nguyễn Thị Minh Thuận Số liệu đề tài thu thập sử dụng cách trung thực Kết nội dung trình bày luận văn không chép luận văn chưa trình bày hay cơng bố cơng trình nghiên cứu trước Nguyễn Thị Bảo Anh KHẢO SÁT HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO IN VITRO CỦA CAO CHIẾT TỪ CÂY SÀI ĐẤT (WEDELIA CHINENSIS (OSBECK.) MERR.) TRÊN TẾ BÀO ĐƠN NHÂN ĐƯỢC CHIẾT TỪ MÁU NGOẠI VI NGƯỜI Nguyễn Thị Bảo Anh Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Thị Minh Thuận Tổng quan: Sài đất (Wedelia chinensis (Osbeck.) Merr., Asteraceae) có hoạt tính chống oxy hóa, kháng viêm, kháng khuẩn, bảo vệ gan điều hòa miễn dịch Tuy nhiên, nghiên cứu tác động Sài đất tế bào miễn dịch hạn chế Mục tiêu đề tài khảo sát hoạt tính gây độc tế bào in vitro cao chiết từ Sài đất tế bào đơn nhân chiết từ máu ngoại vi người (PBMCs) Phương pháp nghiên cứu: Đánh giá tác động cao toàn phần ethanol 50% Sài đất cao phân đoạn chloroform, ethylacetat, n-butanol) tỉ lệ sống tế bào PBMCs (5 x 105 tế bào/ml) sau 24 giờ, 48 giờ, 72 ni cấy với thuốc thử WST-1 Đánh giáq trình hoại tử apoptosis tế bào PBMCs tác động cao chiết Sài đất 48 72 phương pháp định lượng hoạt độ LDH môi trường nuôi cấy định lượng tỉ lệ ADN phân mảnh Khảo sát khả sản xuất interleukin-1β (IL-1β) tế bào PBMCs mơi trường có cao Sài đất 48 phương pháp ELISA Khảo sát thay đổi tỉ lệ tế bào T CD4+ T CD8+ tác động phân đoạn chloroform phân đoạn nbutanol Sài đất 24 máy flow cytometry Kết quả: Cao chiết phân đoạn chloroform ức chế tăng sinh PBMCs sau 48 mạnh mạnh với IC50 10,35 ppm gây cảm ứng trình apoptosis PBMCs sau 72 mạnh với IC50 9,82 ppm Sự sản xuất IL-1β PBMCs bị ức chế tác động cao chiết Sài đất Tỉ lệ tế bào T CD4+ T CD8+ bị thay đổi tác động phân đoạn chloroform phân đoạn n-butanol sau 24 nuôi cấy Kết luận: Các cao chiết Sài đất có độc tính tiềm ẩn tế bào PBMCs Từ khóa: Sài đất, PBMCs, độc tính IN VITRO CYTOTOXIC ACTIVITIES OF WEDELIA CHINENSIS (OSBECK.) MERR EXTRACTS ON HUMAN PERIPHERAL BLOOD MONONUCLEAR CELLS Nguyen Thi Bao Anh Supervisor: PhD Nguyen Thi Minh Thuan Background: Wedelia chinensis (Osbeck.) Merr., belonging to the Asteraceae family, is a medicinal plant with antioxidant, anti-inflammatory, anti-bacterial, hepato-protective and immunomodulatory activities However, studies on the immunomodulatory effects of Wedelia chinensis are still limited Therefore, this study was conducted with the aim of investigating the effects of the W.chinensis extracts on cell proliferation and cytokine production of human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs), and the change in CD4+/CD8+ ratio of T cells Materials and methods: Effects on PBMC proliferation of 50% ethanol crude extract and its fractions (chloroform, ethylacetat, n-butanol) after 24, 48 and 72 hours were evaluated by using WST-1 reagent Effects of W.chinensis extracts on necrosis and apoptosis process of PBMCs were evaluated after 48 and 72 hours using lactat dehydrogenase (LDH) actitity quantitation and diphenylamin method, respectively Interleukin-1β (IL-1β) concentrations secreted by PBMCs under effects of W.chinensis extracts for 48 hours were quantitated using ELISA method Human CD4+ and CD8+ T cell activation after 24-hour exposure to chloroform and n-butanol fractions of W.chinensis was analysed by flowcytometry Results: Chloroform fractions of W.chinensis induced the strongest effects on inhibition of PBMC proliferation after 48 hours and apoptosis of PBMCs after 72 hours with IC50 at 10,35 ppm and 9,82 ppm, respectively W.chinensis extracts were also inhibited the production of IL-1β after 48 hours The ratio of CD4 + and CD8 + T-cells was chandged after 24-hour exposure to chloroform and n-butanol fractions Conclusion: The results of this study showed that W.chinensis may have potetntial cytotoxic effects on human PBMCs Keywords: Wedelia chinensis, PBMCs, cytotoxic effects i MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tế bào đơn nhân chiết từ máu ngoại vi (PBMCs) 1.1.1 Thành phần 1.1.2 Vai trò tế bào PBMCs hệ miễn dịch 1.1.3 Cytokin 1.1.4 Vai trò tế bào PBMCs nghiên cứu in vitro 1.2 Chu kỳ tế bào điểm kiểm sốt chu trình tế bào 1.3 Các phương pháp đánh giá độc tính tế bào 11 1.3.1 Đánh giá độc tính tế bào phương pháp đo quang 11 1.3.2 Đánh giá độc tính tế bào phương pháp đo huỳnh quang 11 1.3.3 Đánh giá trình necrosis tế bào 12 1.3.4 Đánh giá trình apoptosis tế bào 13 1.4 Cây Sài đất Việt Nam (Wedelia chinensis (Osbeck.) Merr., Asteraceae) 14 1.4.1 Đặc điểm thực vật học loài Wedelia chinensis (Osbeck.) Merr 14 1.4.2 Thành phần hóa học .16 1.4.3 Tác dụng dược lý 17 1.4.4 Kinh nghiệm sử dụng Sài đất dân gian 20 1.4.5 Tình hình nghiên cứu tác dụng điều hòa miễn dịch Sài đất giới Việt Nam 20 ii CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1 Đối tượng nghiên cứu 22 2.2 Dụng cụ, thiết bị, hóa chất, thuốc thử 22 2.2.1 Dụng cụ 22 2.2.2 Thiết bị 22 2.2.3 Hóa chất, thuốc thử 24 2.3 Dược liệu .25 2.3.1 Xác định độ ẩm, độ tro toàn phần dược liệu 25 2.3.2 Điều chế cao toàn phần ethanol 50% 25 2.3.3 Điều chế cao phân đoạn 26 2.3.4 Sơ định tính hóa thực vật 27 2.4 Chiết PBMCs từ máu ngoại vi người 27 2.4.1 Nguyên tắc 28 2.4.2 Tiến hành 28 2.5 Khảo sát độ sống tế bào PBMCs tác động in vitro cao chiết toàn phần cao phân đoạn thuốc thử WST-1 29 2.5.1 Nguyên tắc 29 2.5.2 Tiến hành 29 2.6 Khảo sát hoạt tính độc tế bào cao chiết toàn phần cao phân đoạn tế bào PBMCs 31 2.6.1 Thử nghiệm LDH 31 2.6.2 Định lượng ADN phân mảnh 33 iii 2.7 Khảo sát tác động cao chiết toàn phần cao phân đoạn lên sản xuất IL-1 in vitro tế bào PBMCs 34 2.7.1 Nguyên tắc 34 2.7.2 Tiến hành 34 2.8 Khảo sát tác động cao chiết Sài đất tế bào lympho TCD4+ TCD8+ 35 2.9 Xử lý số liệu 36 CHƯƠNG KẾT QUẢ 37 3.1 Dược liệu .37 3.1.1 Độ ẩm độ tro toàn phần dược liệu 37 3.1.2 Độ ẩm độ tro toàn phần cao toàn phần 37 3.2 Sơ định tính hóa thực vật cao chiết 38 3.3 Khảo sát độ sống tế bào PBMCs tác động in vitro cao chiết toàn phần cao phân đoạn thuốc thử WST-1 39 3.3.1 Sau 24 nuôi cấy 39 3.3.2 Sau 48 nuôi cấy 41 3.3.3 Sau 72 nuôi cấy 43 3.4 Khảo sát hoạt tính độc tế bào cao toàn phần cao phân đoạn tế bào PBMCs 3.4.1 Thử nghiệm LDH 3.4.2 Định lượng ADN phân mảnh iv 3.5 Khảo sát tác động cao toàn phần cao phân đoạn sản xuất IL-1 in vitro tế bào PBMCs .10 3.6 Khảo sát tác động cao chiết Sài đất tế bào T CD4+ T CD8+ 13 CHƯƠNG BÀN LUẬN 15 4.1 Tác động cao Sài đất tỉ lệ sống PBMCs 16 4.2 Các tác động gây độc cao sài đất PBMCs 19 4.3 Tác động cao chiết lên sản xuất IL-1 PBMCs 21 4.4 Tác động cao sài đất phân bố tế bào T CD4+ T CD8+ 22 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 24 5.1 Kết luận .24 5.2 Kiến nghị .25 v DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Vai trị cytokin q trình miễn dịch thể Bảng 1.2 Một vài nghiên cứu tác động in vitro Sài đất hệ miễn dịch 21 Bảng 2.1 Các thiết bị sử dụng nghiên cứu 23 Bảng 2.2 Hóa chất, thuốc thử sử dụng nghiên cứu 24 Bảng 3.1 Độ ẩm độ tro toàn phần 37 Bảng 3.2 Độ ẩm độ tro cao toàn phần 37 Bảng 3.3 Kết sơ định tính hóa thực vật cao toàn phần cao phân đoạn dược liệu Sài đất 38 Bảng 3.4 Tóm tắt kết tác động cao Sài đất lên tỉ lệ sống PBMCs sau 24 39 Bảng 3.5 Tóm tắt kết tác động cao Sài đất lên tỉ lệ sống PBMCs sau 48 41 Bảng 3.6 Kết tác động cao Sài đất lên tỉ lệ sống PBMCs sau 72 43 Bảng 3.7 Kết thử nghiệm LDH sau 48 nuôi cấy Bảng 3.8 Kết thử nghiệm LDH sau 72 nuôi cấy Bảng 3.9 Kết mơ hình ADN phân mảnh sau 48 ni cấy PBMCs Bảng 3.10 Kết mơ hình ADN phân mảnh sau 72 ni cấy tế bào Bảng 3.11 Kết định lượng IL-1β mẫu tế bào nuôi cấy sau 48 11 Bảng 3.12 Sự thay đổi tỉ lệ tế bào lympho T CD3+4+ T CD3+8+ sau 24 13 65 saponin triterpen cao chiết Các hợp chất triterpen vòng ghi nhận có tính ức chế tăng sinh lympho T, nhóm carbonyl gắn vị trí C3 vịng A triterpen dường có liên quan đến tác động ức chế sản xuất cytokin tế bào PBMCs [30] Ngoài ra, saponin ghi nhận có tính điều hịa miễn dịch thơng qua tác động làm giảm sản xuất cytokin PBMCs bao gồm IL-1β, IL6 TNF-α [47] Nồng độ IL-1 giảm dẫn đến giảm kích thích tế bào lympho B tế bào Th tăng sinh biệt hóa Điều phù hợp với kết nghiên cứu trước ghi nhận phân đoạn chloroform từ Sài đất làm giảm nồng độ IL-2, cytokin miễn dịch tế bào Th sản xuất, sau 48 ni cấy [3] IL-2 có vai trị kích thích hầu hết tế bào miễn dịch tăng sinh phát triển [2], [6], nồng độ IL-2 giảm, tăng sinh phát triển tế bào miễn dịch bị ức chế Kết phù hợp với kết mô hình WST-1, cho thấy phân đoạn n-butanol phân đoạn chloroform làm giảm tỉ lệ tế bào hoạt động rõ rệt sau 48 tác động 4.4 TÁC ĐỘNG CỦA CÁC CAO SÀI ĐẤT TRÊN SỰ PHÂN BỐ TẾ BÀO T CD4+ VÀ T CD8+ Khoảng giá trị bình thường tỉ số CD4+/CD8+ người bình thường khỏe mạnh 1,5-2,5 Giá trị CD4+/CD8+ thấp gợi ý suy giảm số lượng tế bào mang dấu ấn CD4 quần thể tế bào lympho T, thường gặp số bệnh lý HIV, nhiễm trùng Do đó, tỉ số CD4+/CD8+ dấu sinh học cho biết tình trạng hệ miễn dịch Tỉ số giảm cho biết thể số tình trạng bệnh lý viêm, nhiễm trùng, bệnh tự miễn [8], [17] Phân đoạn cloroform có xu hướng làm tăng tỉ lệ tế bào mang dấu ấn CD8 quần thể lympho T, từ làm giảm tỉ lệ CD4+/CD8+ Trong đó, phân đoạn chloroform nồng độ 100 ppm làm tỉ lệ CD4+/CD8+ giảm xuống thấp Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn 66 Mặc dù sau 24 giờ, phân đoạn n-butanol không gây ảnh hưởng đáng kể tỉ lệ sống tế bào PBMCs làm thay đổi phân bố tế bào quần thể lympho T, thể qua giảm tỉ số CD4+/CD8+ so với mẫu chứng Một số nghiên cứu trước ghi nhận hợp chất triterpen vòng làm tăng tỉ số CD4+/CD8+ [30] Sự khác biệt kết khác nồng độ thử nghiệm, thời gian tác động, cấu trúc hóa học tinh khiết hợp chất Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn 67 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN Dựa mục tiêu đề ban đầu, thu số kết sau: - Khảo sát tác động cao toàn phần cao phân đoạn tỉ lệ sống tế bào PBMCs: phân đoạn chloroform phân đoạn n-butanol có tác động ức chế PBMCs tốt nhất, tác động ức chế rõ rệt sau 48 nuôi cấy tế bào với IC50 10,35 ppm 54,03 ppm - Khảo sát tác động cao toàn phần cao phân đoạn lên trình apoptosis trình hoại tử PBMCs: cao toàn phần cao phân đoạn làm tăng tỉ lệ ADN phân mảnh PBMCs sau 72 ni cấy, phân đoạn chloroform phân đoạn n-butanol có tác động tốt với IC50 9,82 ppm 16,96 ppm - Khảo sát tác động cao toàn phần cao phân đoạn lên chức sống PBMCs thông qua định lượng cytokin IL-1β: sau 48 giờ, cao toàn phần cao phân đoạn làm giảm lượng IL-1β sản xuất PBMCs, phân đoạn chloroform có tác động ức chế nồng độ thấp (0,1 ppm) - Khảo sát tác động phân đoạn chloroform n-butanol lên thành phần tế bào quần thể lympho T: phân đoạn chloroform n-butanol làm thay đổi thành phần tế bào T CD4+ T CD8+ sau 24 nuôi cấy Nhìn chung, dịch chiết với dung mơi cồn 50% từ Sài đất Việt Nam (Wedelia chinensis) có hoạt tính gây độc tế bào đơn nhân chiết từ máu ngoại vi người qua cảm ứng trình apoptosis, tác động chịu ảnh hưởng thời gian Các phân đoạn khác chứa thành phần hóa học khác nhau, có tác động dược lý khác PBMCs Mặc dù chưa gây tác động rõ rệt số lượng tế bào, cao toàn phần cao phân đoạn thể độc tính tiềm ẩn Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn 68 chức PBMCs, thể qua giảm tiết IL-1β PBMCs thay đổi thành phần tế bào CD4+/CD8+ quần thể lympho T 5.2 KIẾN NGHỊ Do thời gian điều kiện nghiên cứu cịn hạn chế, chúng tơi có đề nghị sau đây: - Tiến hành phân lập hợp chất có phân đoạn cao Sài đất khảo sát tác động hợp chất tinh khiết tế bào PBMCs - Tiến hành nghiên cứu sâu để hiểu rõ chế tác động cao chiết PBMCs, điện di ADN, định lượng cytochrome-c, mơ hình BrdU, định lượng ATP,… - Tiến hành nghiên cứu đánh giá tác động cao chiết chức nhóm tế bào Th1, Th2 thơng qua định lượng số cytokin IL-4, IL-6, IL-10, IL-12, TNF-α,… - Tiến hành nghiên cứu đánh giá tác động cao chiết hợp chất tinh khiết thay đổi số lượng đại thực bào, tế bào NK, lympho B, thông qua định lượng dấu ấn bề mặt tế bào - Tiến hành nghiên cứu đánh giá tác động cao chiết hợp chất tinh khiết thay đổi thành phần tế bào T CD4+ T CD8+ quần thể lympho T thời điểm khác Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt [1] Đỗ Huy Bích cộng (2006), Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội, tr 657-659 [2] 200 Đại học Y Hà Nội (2014), Miễn dịch học, NXB Đại học Y Hà Nội, Hà Nội, tr.1- [3] Lê Thị Thảo Nguyên (2018), Sàng lọc dược liệu tác động lên tăng sinh in vitro tế bào máu ngoại vi người hoạt tính chống oxy hóa, Luận văn Thạc sĩ Dược học, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh, Thành phố Hồ Chí Minh [4] Nguyễn Thị Minh Thuận cộng (2020), “Đánh giá tác động tăng sinh in vitro tế bào đơn nhân máu ngoại vi người hoạt tính chống oxy hóa cao chiết Wedelia chinensis (Osbeck) Merr., Asteraceae”, Y học TP Hồ Chí Minh, 24(2), tr.106-113 [5] Nguyễn Thanh Thy (2018), Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy in vitro tế bào đơn nhân chiết từ máu ngoại vi người, Khóa luận Dược sĩ đại học, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh, Thành phố Hồ Chí Minh [6] Phạm Hồng Phiệt (2010), Miễn dịch - sinh lý bệnh, NXB Y học, Thành phố Hồ Chí Minh, tr.1-100 [7] Trần Thị Phương Uyên (2018), Khảo sát hoạt tính độc tính tế bào ung thư vú cao chiết Hồng quân (Flacourtia indica (Burm.f.) Merr.) dòng tế bào ung thư vú người MDA-MB-231, Luận văn Thạc sĩ Dược học, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh, Thành phố Hồ Chí Minh Tiếng Anh [8] Amadori A et al (1995), "Genetic control of the CD4/CD8 T-cell ratio in humans", Nat Med (12), pp 1279-1283 [9] Archana M et al (2013), "Various methods available for detection of apoptotic cells-A review", Indian journal of cancer 50 (3), pp 274 Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn [10] Aslantürk Ư S (2018), "In Vitro Cytotoxicity and Cell Viability Assays: Principles, Advantages, and Disadvantages", Genotoxicity - A Predictable Risk to Our Actual World [11] Attard E et al (2009), "In vitro immunomodulatory activity of various extracts of Maltese plants from the Asteraceae family", Journal of Medicinal Plants Research (6), pp 457-461 [12] Badria F A et al (2003), "Immunomodulatory triterpenoids from the oleogum resin of Boswellia carterii Birdwood", Z Naturforsch C J Biosci 58 (7-8), pp 505-516 [13] Berridge M V et al (2005), "Tetrazolium dyes as tools in cell biology: New insights into their cellular reduction", pp 127-152 [14] Bhatnagar S (2016), "Phytochemical Analysis and Biological Evaluation of Leaf Extracts of Wedelia chinensis", Pharmacy & Pharmacology International Journal (7) [15] Bora K S et al (2018), "Evaluation of anxiolytic activity of W chinensis Merrill Leaves" [16] Brentnall M et al (2013), "Caspase-9, caspase-3 and caspase-7 have distinct roles during intrinsic apoptosis", BMC Cell Biology 14 (1), pp 32Bruno G et al (2017), "The revival of an "old" marker: CD4/CD8 ratio", AIDS reviews 19 [17] Bruno G et al (2017), "The revival of an "old" marker: CD4/CD8 ratio", AIDS reviews 19 [18] Cherng J.-M et al (2008), "Immunomodulatory activities of common vegetables and spices of Umbelliferae and its related coumarins and flavonoids", Food Chemistry 106 (3), pp 944-950 [19] Chiang L C et al (2003), "Immunomodulatory activities of flavonoids, monoterpenoids, triterpenoids, iridoid glycosides and phenolic compounds of Plantago species", Planta Med 69 (7), pp 600-604 [20] Cummings B S et al (2004), "Measurement of cell death in mammalian cells", Curr Protoc Pharmacol Chapter 12, pp Unit 12 18 Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn [21] Darah I et al (2013), "Effects of methanol extract of Wedelia chinensis (Osbeck.) Asteraceae leaves against pathogenic bacteria with emphasise on Bacillus cereus", Indian Journal of Pharmaceutical Sciences 75 (5), pp 533 [22] Darzynkiewicz Z et al (1994), "Chapter Assays of Cell Viability: Discrimination of Cells Dying by Apoptosis", Flow Cytometry Second Edition, Part A, pp 15-38 [23] de Abreu Costa L et al (2017), "Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Decreases Cell Proliferation and TNF-alpha, IFN-gamma, and IL-2 Cytokines Production in Cultures of Peripheral Blood Lymphocytes", Molecules 22 (11) [24] Deeb D et al (2014), "Pristimerin, a quinonemethide triterpenoid, induces apoptosis in pancreatic cancer cells through the inhibition of pro-survival Akt/NFκB/mTOR signaling proteins and anti-apoptotic Bcl-2", International journal of oncology 44 (5), pp 1707-1715 [25] Evan G I et al (1995), "Apoptosis and the cell cycle", Current Opinion in Cell Biology (6), pp 825-834 [26] Ghițu A et al (2019), "A Comprehensive Assessment of Apigenin as an Antiproliferative, Proapoptotic, Antiangiogenic and Immunomodulatory Phytocompound", Nutrients 11 (4), pp 858 [27] Grigore A (2017), "Plant Phenolic Compounds as Immunomodulatory Agents", Phenolic Compounds - Biological Activity [28] Gupta A et al (2016), "Immunopharmacological Activity Of Saponin From Terminalia arjuna And Prosopis spicigera", Pharmaceutical Bioprocessing (1), pp 1-6 [29] Hartwell L H et al (1989), "Checkpoints: Controls that Ensure the Order of Cell Cycle Events", Science 246 (4930), pp 629-634 [30] Harun N H et al (2020), "Immunomodulatory effects and structure-activity relationship of botanical pentacyclic triterpenes: A review", Chinese Herbal Medicines 12 (2), pp 118-124 [31] Holthaus L et al (2018), "CD4(+) T cell activation, function, and metabolism are inhibited by low concentrations of DMSO", J Immunol Methods 463, pp 54-60 Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn [32] Hosseinzade A et al (2019), "Immunomodulatory Effects of Flavonoids: Possible Induction of T CD4+ Regulatory Cells Through Suppression of mTOR Pathway Signaling Activity", Front Immunol 10, pp 51 [33] Hougee S et al (2005), "Decreased pro-inflammatory cytokine production by LPS-stimulated PBMC upon in vitro incubation with the flavonoids apigenin, luteolin or chrysin, due to selective elimination of monocytes/macrophages", Biochem Pharmacol 69 (2), pp 241-248 [34] Huang Y T et al (2013), "Dietary uptake of Wedelia chinensis extract attenuates dextran sulfate sodium-induced colitis in mice", PLoS One (5), pp e64152 [35] Jalal A A et al (2012), "Hepatoprotective activity of Wedelia chinensis against carbon tetrachloride induced liver damage in rats", Int J Phytopharmacol 3, pp 121-125 [36] Jantan I et al (2015), "Plant-derived immunomodulators: an insight on their preclinical evaluation and clinical trials", Front Plant Sci 6, pp 655 [37] Kang S et al (2012), "Ginseng, the 'Immunity Boost': The Effects of Panax ginseng on Immune System", J Ginseng Res 36 (4), pp 354-368 [38] Khanum S et al (2019), "In vivo Neurological, Analgesic and In vitro Antioxidant and Cytotoxic Activities of Ethanolic Extract of Leaf and Stem Bark of Wedelia chinensis", Bangladesh Pharmaceutical Journal 22 (1), pp 18-26 [39] KI K et al (2006), "Anti-apoptotic activity of caffeic acid, ellagic acid and ferulic acid in normal human peripheral blood mononuclear cells: A Bcl-2 independent mechanism", Biochimica et biophysica acta 1760, pp 283-289 [40] King K L et al (1995), "Cell cycle and apoptosis: Common pathways to life and death", Journal of Cellular Biochemistry 58 (2), pp 175-180 [41] King K L et al (1998), "Cell cycle regulation and apoptosis", Annu Rev Physiol 60, pp 601-617 [42] Kleiveland C R (2015), "Peripheral Blood Mononuclear Cells", K Verhoeckx et al., chủ biên, The Impact of Food Bioactives on Health: in vitro and ex vivo models, Cham (CH), pp 161-167 Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn [43] Kobori M et al (2004), "Wedelolactone suppresses LPS-induced caspase-11 expression by directly inhibiting the IKK complex", Cell Death Differ 11 (1), pp 123130 [44] Koyanagi M et al (2016), "A comparative study of colorimetric cell proliferation assays in immune cells", Cytotechnology 68 (4), pp 1489-1498 [45] Kumar D et al (2012), "A review of immunomodulators in the Indian traditional health care system", J Microbiol Immunol Infect 45 (3), pp 165-184 [46] Kumar S et al (2011), "Immunomodulatory effects of some traditional medicinal plants", Journal of chemical and pharmaceutical research [47] Lee D C et al (2011), "Effects of Panax ginseng on tumor necrosis factoralpha-mediated inflammation: a mini-review", Molecules 16 (4), pp 2802-2816 [48] Lin F M et al (2007), "Compounds from Wedelia chinensis synergistically suppress androgen activity and growth in prostate cancer cells", Carcinogenesis 28 (12), pp 2521-2529 [49] Lin S.-c et al (1994), "Hepatoprotective effects of Taiwan folk medicine: Wedelia chinensis on three hepatotoxin-induced hepatotoxicity", The American journal of Chinese medicine 22 (02), pp 155-168 [50] Lin W.-L et al (2014), "Ethyl acetate extract of Wedelia chinensis inhibits tertbutyl hydroperoxide-induced damage in PC12 cells and D-galactose-induced neuronal cell loss in mice", BMC complementary and alternative medicine 14 (1), pp 1-12 [51] Liu C P et al (2004), "The extracts from Nelumbo nucifera suppress cell cycle progression, cytokine genes expression, and cell proliferation in human peripheral blood mononuclear cells", Life Sci 75 (6), pp 699-716 [52] Lopez-Gonzalez J S et al (2004), "Apoptosis and cell cycle disturbances induced by coumarin and 7-hydroxycoumarin on human lung carcinoma cell lines", Lung Cancer 43 (3), pp 275-283 [53] Maji A K et al (2015), "Immunomodulatory effect of Wedelia chinensis and demethylwedelolactone by interfering with various inflammatory mediators", Oriental Pharmacy and Experimental Medicine 15 (1), pp 23-31 Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn [54] Manjamalai A et al (2013), "Chemotherapeutic effect of essential oil of Wedelia chinensis (Osbeck.) on inducing apoptosis, suppressing angiogenesis and lung metastasis in C57BL/6 mice model", J Cancer Sci Ther 5, pp 271-281 [55] Manjamalai A et al (2012), "Antioxidant activity of essential oils from Wedelia chinensis (Osbeck.) in vitro and in vivo lung cancer bearing C57BL/6 mice", Asian Pacific Journal of Cancer Prevention 13 (7), pp 3065-3071 [56] Manjamalai A et al (2012), "Study on the effect of essential oil of Wedelia chinensis (Osbeck.) against microbes and inflammation", Asian J Pharm Clin Res 5, pp 155-163 [57] Martins P R et al (2017), "Agaricus brasiliensis polysaccharides stimulate human monocytes to capture Candida albicans, express toll-like receptors and 4, and produce pro-inflammatory cytokines", J Venom Anim Toxins Incl Trop Dis 23, pp 17 [58] Mengome L E et al (2014), "In vitro proliferation and production of cytokine and IgG by human PBMCs stimulated with polysaccharide extract from plants endemic to Gabon", Molecules 19 (11), pp 18543-18557 [59] Mishra G et al (2009), "Hepatoprotective activity of alcoholic and aqueous extracts of Wedelia chinensis", Pharmacologyonline 1, pp 345-356 [60] Molaae N et al (2017), "Evaluating the Proliferation of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using MTT Assay", International Journal of Basic Science in Medicine (1), pp 25-28 [61] Nehybova T et al (2014), "Plant Coumestans: Recent Advances and Future Perspectives in Cancer Therapy", Anti-cancer agents in medicinal chemistry 14 [62] Nomani I et al (2013), "Wedelia chinensis (Asteraceae)-an overview of a potent medicinal herb", International Journal of PharmTech Research (3), pp 957964 [63] Otto T et al (2017), "Cell cycle proteins as promising targets in cancer therapy", Nat Rev Cancer 17 (2), pp 93-115 [64] Pourahmad J et al (2015), "Isolated human peripheral blood mononuclear cell (PBMC), a cost effective tool for predicting immunosuppressive effects of drugs and xenobiotics", Iranian journal of pharmaceutical research: IJPR 14 (4), pp 979 Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn [65] Pucci B et al (2000), "Cell cycle and apoptosis", Neoplasia (4), pp 291-299 [66] Py B F et al (2014), "Caspase-11 controls interleukin-1β release through degradation of TRPC1", Cell reports (6), pp 1122-1128 [67] Reyes-Zurita F J et al (2011), "The natural triterpene maslinic acid induces apoptosis in HT29 colon cancer cells by a JNK-p53-dependent mechanism", BMC cancer 11, pp 154-154 [68] Riss T L et al (2004), "Cell Viability Assays", S Markossian et al., chủ biên, Assay Guidance Manual, Eli Lilly & Company and the National Center for Advancing Translational Sciences, Bethesda (MD) [69] Samie A et al (2017), "Effects Of Combretum hereroense And Canthiummundianum Water Extracts On Production And Expression Of Interleukin-4", Afr J Tradit Complement Altern Med 14 (1), pp 302-309 [70] Sipahi H et al (2016), "Bioactivites of two common polyphenolic compounds: Verbascoside and catechin", Pharmaceutical Biology 54 (4), pp 712-719 [71] Thao N P et al (2018), "alpha-Amylase and alpha-Glucosidase Inhibitory Activities of Chemical Constituents from Wedelia chinensis (Osbeck.) Merr Leaves", J Anal Methods Chem 2018, pp 2794904 [72] Top H et al (2017), "Immunomodulatory, hemolytic properties and cytotoxic activity potent of triterpenoid saponins from Cephalaria balansae", Phytochemistry 137, pp 139-147 [73] Tsai C H et al (2017), "A Standardized Wedelia chinensis Extract Overcomes the Feedback Activation of HER2/3 Signaling upon Androgen-Ablation in Prostate Cancer", Front Pharmacol 8, pp 721 [74] Tsai C H et al (2017), "A standardized herbal extract mitigates tumor inflammation and augments chemotherapy effect of docetaxel in prostate cancer", Sci Rep (1), pp 15624 [75] Tsai C.-H et al (2015), "Development of a standardized and effect-optimized herbal extract of Wedelia chinensis for prostate cancer", Phytomedicine 22 Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn [76] Vega-Avila E et al (2011), An overview of colorimetric assay methods used to assess survival or proliferation of mammalian cells, Proc West Pharmacol Soc, pp 1014 [77] von Knethen A et al (1999), "NO-Evoked Macrophage Apoptosis Is Attenuated by cAMP-Induced Gene Expression", Molecular Medicine (10), pp 672684 [78] Yang L L et al (2003), "Cytotoxic activity of coumarins from the fruits of Cnidium monnieri on leukemia cell lines", Planta Med 69 (12), pp 1091-1095 [79] Yue G G et al (2010), "Immunostimulatory activities of polysaccharide extract isolated from Curcuma longa", Int J Biol Macromol 47 (3), pp 342-347 Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn PL-1 PHỤ LỤC Phụ lục Kết phân tích TCD3+CD4+ TCD3+CD8+ (chạy phần mềm Fowing Software 2.0) a Mẫu chứng b Mẫu tế bào tiếp xúc với phân đoạn n-butanol, nồng độ 0,1 ppm c Mẫu tế bào tiếp xúc với phân đoạn n-butanol, nồng độ ppm d Mẫu tế bào tiếp xúc với phân đoạn n-butanol, nồng độ 10 ppm e Mẫu tế bào tiếp xúc với phân đoạn n-butanol, nồng độ 100 ppm f Mẫu tế bào tiếp xúc với phân đoạn chloroform, nồng độ 0,1 ppm a c Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn b d PL-2 f e g Mẫu tế bào tiếp xúc với phân đoạn chloroform, nồng độ ppm h Mẫu tế bào tiếp xúc với phân đoạn chloroform, nồng độ 10 ppm i Mẫu tế bào tiếp xúc với phân đoạn chloroform, nồng độ 100 ppm h g i Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn PL-3 Phụ lục 2: Kết IC50 phân đoạn chloroform phân đoạn n-butanol tỉ lệ sống PBMCs sau 48 tỉ lệ ADN phân mảnh PBMCs sau 72 tính tốn phần mềm GraphPad Prism 8.0 Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn ... Anh KHẢO SÁT HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO IN VITRO CỦA CAO CHIẾT TỪ CÂY SÀI ĐẤT (WEDELIA CHINENSIS (OSBECK. ) MERR .) TRÊN TẾ BÀO ĐƠN NHÂN ĐƯỢC CHIẾT TỪ MÁU NGOẠI VI NGƯỜI Nguyễn Thị Bảo Anh Người. .. Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH NGUYỄN THỊ BẢO ANH KHẢO SÁT HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO IN VITRO CỦA CAO CHIẾT TỪ CÂY SÀI ĐẤT (WEDELIA CHINENSIS (OSBECK. ) MERR .) TRÊN TẾ BÀO ĐƠN NHÂN ĐƯỢC... nghiên cứu tác động Sài đất tế bào miễn dịch hạn chế Mục tiêu đề tài khảo sát hoạt tính gây độc tế bào in vitro cao chiết từ Sài đất tế bào đơn nhân chiết từ máu ngoại vi người (PBMCs) Phương pháp