Xây dựng mô hình nuôi cấy in vitro tế bào đơn nhân được phân lập từ máu ngoại vi của người

BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƢỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH CHƢƠNG TRÌNH KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC XÂY DỰNG MƠ HÌNH NI CẤY IN VITRO TẾ BÀO ĐƠN NHÂN ĐƢỢC PHÂN LẬP TỪ MÁU NGOẠI VI CỦA NGƢỜI Cơ quan chủ trì nhiệm vụ : Khoa Dƣợc, Đại học Y Dƣợc TP.HCM Chủ trì nhiệm vụ: TS Nguyễn Thị Minh Thuận Thành phố Hồ Chí Minh - 2019 i BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƢỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH CHƢƠNG TRÌNH KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ XÂY DỰNG MƠ HÌNH NUÔI CẤY IN VITRO TẾ BÀO ĐƠN NHÂN ĐƢỢC PHÂN LẬP TỪ MÁU NGOẠI VI CỦA NGƢỜI (Đã chỉnh sửa theo kết luận Hội đồng nghiệm thu ngày ) Cơ quan chủ quản Chủ trì nhiệm vụ (ký tên đóng dấu) (ký tên) Cơ quan chủ trì nhiệm vụ (ký tên đóng dấu) ii MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT v DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH v ĐẶT VẤN ĐỀ Chƣơng TỔNG QUAN Y VĂN Chƣơng ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU 2.2 THIẾT BỊ, DỤNG CỤ, HÓÁ CHẤT, THUỐC THỬ 2.2.1 Thiết bị 2.2.2 Dụng cụ 2.2.3 Hóa chất, thuốc thử 2.3 NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1 Tối ƣu hóa quy trình phân lập tế bào PBMCs từ máu ngoại vi ngƣời 2.3.2 Quy trình đánh giá tỷ lệ sống tế bào sử dụng phƣơng pháp nhuộm trypan blue đếm tế bào buồng đếm hemocytometer 10 2.3.3 Khảo sát dung mơi hịa tan tinh thể formazan phƣơng pháp MTT 11 2.3.4 Khảo sát mật độ tế bào PBMCs 14 2.3.5 Khảo sát nồng độ FBS thời gian nuôi cấy tế bào PBMCs 15 2.3.6 Khảo sát môi trƣờng nuôi cấy tế bào PBMCs 16 2.3.7 Khảo sát nồng độ PHA nuôi cấy PBMCs 17 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 19 3.1 KẾT QUẢ 19 3.1.1 Kết khảo sát quy trình phân lập PBMCs từ máu ngoại vi ngƣời 19 3.1.2 Kết khảo sát dung mơi hịa tan tinh thể formazan phƣơng pháp đánh giá tỷ lệ sống tế bào với thuốc thử MTT 20 3.1.3 Kết khảo sát mật độ tế bào PBMCs 24 3.1.4 Kết khảo sát nồng độ FBS thời gian nuôi cấy tế bào PBMCs 26 3.1.5 Kết khảo sát môi trƣờng nuôi cấy tế bào PBMCs 28 iii 3.1.6 Kết khảo sát nồng độ PHA quy trình nuôi cấy PBMCs 29 3.2 BÀN LUẬN 31 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 34 4.1 KẾT LUẬN 34 4.2 ĐỀ NGHỊ 34 TÀI LIỆU THAM KHẢO 35 iv DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Ý nghĩa Chữ tắt Từ nguyên DMSO Dimethyl sulfoxid DNA Deoxyribonucleic acid DPBS Dulbecco's phosphate buffered saline FBS Fetal bovine serum MTNCHC Môi trƣờng ni cấy hồn chỉnh MTT Đệm muối phosphat Dulbecco Huyết thai bò 3-(4,5-dimethylthazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromid Mật độ quang OD Optical density PBMCs Peripheral blood mononuclear cells PBS Phosphate-buffered saline PHA Phytohaemagglutinin RPMI Roswell Park Memorial Institute SD Standard deviation Tế bào đơn nhân máu ngoại vi Đệm muối phosphate Độ lệch chuẩn TB Trung bình v DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Một vài nghiên cứu đánh giá độc tính tế bào phƣơng pháp MTT giới Bảng 1.2 Một vài nghiên cứu đánh giá độc tính tế bào phƣơng pháp MTT ởViệt Nam2 Bảng 2.1 Danh mục thiết bị sử dụng Bảng 1.2 Danh mục hóa chất, thuốc thử sử dụng Bảng 2.3 Mơ hình thử nghiệm tối ƣu quy trình chiết tế bào PBMCs từ máu ngoại vi ngƣời Bảng 2.4 Mơ hình thử nghiệm tối ƣu môi trƣờng phân tán cắn PBMCs Bảng 2.5 Pha loãng nồng độ tế bào 13 Bảng 2.6 Pha dung dịch PHA/môi trƣờng 16 Bảng 2.1 Kết đánh giá khả sống (chết) tế bào môi trƣờng phân tán cắn tế bào khác phƣơng pháp trypan blue 18 Bảng 3.2 Kết đo độ hấp thu formazan dung môi khác 21 Bảng 3.3 Kết đo độ hấp thu formazan đƣợc tạo thành giếng có mật độ tế bào khác 23 Bảng 3.4 Kết đo độ hấp thu formazan đƣợc tạo thành từ giếng nuôi tế bào môi trƣờng với nồng độ FBS khác thời điểm 24, 48, 72 25 Bảng 3.5 Kết đo độ hấp thu formazan đƣợc tạo thành từ giếng nuôi tế bào môi trƣờng khác thời điểm 24, 48, 72 27 Bảng 3.6 Kết đo độ hấp thu formazan đƣợc hình thành từ tế bào nuôi môi trƣờng với nồng độ PHA khác 28 vi DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Máu ngoại vi sau chiết ống Leucosep® Hình 2.2 Quy tắc đếm tế bào buồng đếm hemocytometer Hình 2.3 Tóm tắt quy trình thử nghiệm tối ƣu hóa dung mơi hịa tan formazan 12 Hình 3.1 Ống Leucosep® sau ly tâm 18 Hình 3.2 Phổ formazan dung môi isopropanol 19 Hình 3.3 Phổ formazan dung mơi isopropanol/HCl 19 Hình 3.4 Phổ formazan dung môi DMSO 20 Hình 3.5 Phổ formazan dung môi DMSO/NH3 20 Hình 3.6 Sự thay đổi màu môi trƣờng giai đoạn nuôi cấy tế bào MTNCHC 21 Hình 3.7 Khảo sát độ hấp thu formazan dung mơi hịa tan khác 22 Hình 3.8 Minh họa giếng chứa formazan tan dung môi khảo sát tƣơng ứng thời gian 30 giây dƣới kính hiển vi 22 Hình 3.9 Đồ thị biểu diễn tƣơng quan mật độ tế bào (103-105 tế bào/giếng) độ hấp thu từ mật độ 103 đến 105 tế bào/giếng 23 Hình 3.10 Đồ thị biểu diễn tƣơng quan mật độ từ 103 đến 104 tế bào/giếng độ hấp thu 24 Hình 3.11 Minh họa lƣợng tinh thể formazan hình thành tƣơng ứng mơi trƣờng có mật độ tế bào/giếng giảm dần từ hình 1-6 (105; x 104; 2,5 x 104; 104; 7,5 x 103; x 103 tế bào) 24 Hình 3.12 Kết khảo sát nồng độ FBS thời gian thích hợp cho ni cấy tế bào PBMCs 26 Hình 3.13 Kết khảo sát môi trƣờng nuôi cấy tế bào PBMCs thời điểm khác 26 Hình 3.14 Kết khảo sát nồng độ PHA thích hợp cho tăng trƣởng tế bào PBMCs 28 vii ĐĂT VẤN ĐỀ Các bệnh lý liên quan đến rối loạn hệ miễn dịch ngày phổ biến Ngun nhân tình trạng suy giảm miễn dịch đáp ứng miễn dịch mức cần thiết Trong trƣờng hợp sức đề kháng thể giảm, thể dễ bị cơng tác nhân gây bệnh bên ngồi nhƣ virus, vi khuẩn, nấm,… dễ mắc bệnh lý nhiễm trùng, viêm nhiễm, ung thƣ… Mặt khác, đáp ứng miễn dịch trở nên mạnh, số trƣờng hợp chống lại thể, gây bệnh lý tự miễn nhƣ viêm khớp dạng thấp, thấp khớp, lupus, vảy nến, hen suyễn… [1-3] Hiện nay, giới có nhiều nghiên cứu nhằm tìm hiểu, đánh giá tính hiệu dƣợc liệu điều trị bệnh liên quan đến hệ thống miễn dịch Các nghiên cứu có quy mơ từ in vitro in vivo, đƣợc thực nhằm đánh giá hiệu dƣợc liệu có nguồn gốc tự nhiên tăng sinh, hoạt hóa tế bào miễn dịch ức chế, giảm hoạt tính chúng Một mơ hình đƣợc sử dụng rộng rãi mơ hình in vitro ni cấy tế bào miễn dịch đơn nhân phân lập từ máu ngoại vi ngƣời (PBMC) để thử hoạt tính làm tăng sinh ức chế miễn dịch dƣợc liệu [4-7] Ở Việt Nam, mơ hình nghiên cứu tế bào in vitro đƣợc thực nhiều chủ yếu nghiên cứu đánh giá khả gây độc dƣợc liệu hoạt chất tế bào ung thƣ Thơng thƣờng, dịng tế bào tế bào ung thƣ dễ ni dịng tế bào sơ cấp nhƣ lympho bào [8,9] Mặt khác, chƣa có nhiều nghiên cứu đánh giá tác động thuốc tế bào lympho in vitro Nhằm góp phần phát triển hƣớng nghiên cứu với mục đích tìm kiếm dƣợc liệu có khả kích thích ức chế tăng sinh tế bào lympho miễn dịch để ứng dụng điều trị, thực đề tài “Xây dựng mơ hình ni cấy in vitro tế bào đơn nhân đƣợc phân lập từ máu ngoại ngƣời” với mục tiêu cụ thể sau: Xây dựng quy trình chiết tách phân đoạn PBMC giàu lympho từ máu toàn phần ngƣời Khảo sát yếu tố ảnh hƣởng đến điều kiện nuôi cấy tế bào PBMC in vitro Khảo sát phƣơng pháp đánh giá tăng sinh tế bào thuốc thử MTT (3 – [4,5 – dimethylthiazol – – yl] – 2,5 – diphenyl tetrazolium bromid) Chƣơng 1: TỔNG QUAN Y VĂN 1.1 Tổng quan tình hình nghiên cứu thuộc lĩnh vực đề tài nƣớc Miễn dịch khả thể nhận biết, đáp ứng loại bỏ tác nhân gây hại cho thể Do vậy, miễn dịch phƣơng thức đề kháng tự vệ quan trọng thể Hệ thống miễn dịch bao gồm nhiều loại tế bào khác nhiều protein có chức bảo vệ thể nhƣ bảo vệ da, đƣờng thở, đƣờng tiêu hóa quan khác khỏi tác nhân bên ngồi, ví dụ nhƣ vi sinh vật (vi khuẩn, nấm ký sinh trùng), virus, tế bào ung thƣ nhƣ độc tố Đáp ứng miễn dịch phân loại đơn giản thành hai dòng đáp ứng: đáp ứng miễn dịch tự nhiên (miễn dịch không đặc hiệu) đáp ứng miễn dịch thu nhận (miễn dịch đặc hiệu) [9-11] Đáp ứng miễn dịch tự nhiên xảy sau thể tiếp xúc với tác nhân lạ từ bên ngồi mơi trƣờng vịng vài sau Đây đáp ứng miễn dịch với chế không phụ thuộc vào kháng nguyên, xảy nhanh, không để lại trí nhớ miễn dịch, khơng có khả nhận diện tác nhân gây bệnh lần tiếp xúc Ngƣợc lại, đáp ứng miễn dịch thu nhận có chế phụ thuộc vào kháng nguyên sinh kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên tiếp xúc Đặc điểm đáp ứng miễn dịch đặc hiệu khả tạo trí nhớ miễn dịch, cho phép vật chủ sinh đáp ứng miễn dịch nhanh hiệu lần tiếp xúc với kháng nguyên Cả hai đáp ứng miễn dịch hoạt động thống hỗ trợ để bảo vệ thể, thiếu hụt hai dẫn đến thể dễ bị công tác nhân gây bệnh [9] Các bệnh lý liên quan đến rối loạn hệ miễn dịch ngày phổ biến Nguyên nhân tình trạng suy giảm miễn dịch đáp ứng miễn dịch mức cần thiết Trong trƣờng hợp sức đề kháng thể giảm, thể dễ bị công tác nhân gây bệnh bên nhƣ virus, vi khuẩn, nấm,… dễ mắc bệnh lý nhiễm trùng, viêm nhiễm, ung thƣ…[1] Mặt khác, đáp ứng miễn dịch trở nên mạnh, số trƣờng hợp chống lại thể, gây bệnh lý tự miễn nhƣ viêm khớp dạng thấp, thấp khớp, lupus, vảy nến, hen suyễn [2] Trong dân gian, có nhiều thuốc sử dụng dƣợc liệu y học cổ truyền đƣợc ngƣời dân sử dụng từ hàng ngàn năm qua điều trị bệnh lý liên quan đến bất thƣờng hệ miễn dịch Việc sử dụng dƣợc liệu y học cổ truyền mang lại lợi ích định cho bệnh nhân nhƣ giảm tác dụng phụ đáng kể so sánh với dùng thuốc tân dƣợc Điều mở hƣớng nghiên cứu đầy tiềm cho dƣợc học đại đa dạng có sẵn nguồn nguyên liệu dƣợc liệu Hiện nay, giới có nhiều nghiên cứu nhằm tìm hiểu, đánh giá tính hiệu dƣợc liệu điều trị bệnh liên quan đến hệ thống miễn dịch Các nghiên cứu có quy mô từ in vitro [3,4] in vivo [5-8], đƣợc thực nhằm đánh giá hiệu dƣợc liệu có nguồn gốc tự nhiên tăng sinh, hoạt hóa tế bào miễn dịch (nhƣ đậu bắp (Abelmoschus esculentus) làm tăng nồng độ lympho T, IL-12 INF-) ức chế, giảm hoạt tính tế bào miễn dịch (nhƣ cỏ xạ hƣơng (Thymus vulgaris) ức chế tăng sinh in vitro PBMCs; ngƣu bàng (Arctium lappa) ức chế IL-6 TNF-) Một mơ hình đƣợc sử dụng rộng rãi mơ hình in vitro nuôi cấy tế bào miễn dịch đơn nhân phân lập từ máu ngoại vi ngƣời (PBMCs) để thử hoạt tính làm tăng sinh ức chế miễn dịch dƣợc liệu 1.2 Tính cấp thiết Hiện Việt Nam chƣa có nhiều nghiên cứu đánh giá tác động dƣợc liệu thuốc tăng sinh gây độc tế bào PBMCs ngƣời Mặt khác, điều kiện nuôi cấy tế bào PBMCs ngƣời nghiên cứu giới không thống mục đích nghiên cứu khác Hơn nữa, việc xác định khả sống tế bào thƣờng đƣợc sử dụng để đánh giá hợp chất có ảnh hƣởng lên tăng trƣởng tế bào gây độc tính trực tiếp tế bào, chí gây chết tế bào hay khơng Ngày nay, có nhiều loại phƣơng pháp dùng để định lƣợng tế bào, nhƣng phƣơng pháp MTT (3(4,5-dimethylthazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) [9] hay đƣợc sử dụng đơn giản, nhanh chóng, xác phƣơng pháp đếm tế bào cách nhuộm trypan blue Tuy nhiên, phƣơng pháp định lƣợng MTT phải đƣợc tối ƣu hóa điều kiện thời gian định lƣợng để đạt đƣợc kết tốt Bảng 1.1 Một vài nghiên cứu đánh giá độc tính tế bào phƣơng pháp MTT giới Tác giả Thử nghiệm Dòng tế bào Tên báo Dutra, Đánh giá khả gây C6 Frederico Pittella, Dalton độc tính tinh dầu MeWo (u ác tính and cytotoxicity activity Dittz, et al (2012) Pterodon emarginatus ngƣời), CT26.WT of the essential oil of Rafael C (ung (glioma thƣ đại chuột), tràng chuột), MDA-MB 231 Chemical composition Pterodon emarginatus 3.1.2.1 Kết quét phổ mẫu thử formazan dung mơi hịa tan Độ hấp thu (OD) Hình 3.2 Phổ formazan dung mơi isopropanol Bƣớc sóng (nm) Độ hấp thu (OD) Hình 3.3 Phổ formazan dung mơi isopropanol/HCl Bƣớc sóng (nm) Độ hấp thu (OD) Hình 3.4 Phổ formazan dung mơi DMSO 21 Bƣớc sóng (nm) Độ hấp thu (OD) Hình 3.5 Phổ formazan dung mơi DMSO/NH3 Bƣớc sóng (nm) Nhận xét Đỉnh hấp thu cực đại formazan dung mơi hịa tan thử nghiệm có khác Cụ thể, đỉnh hấp thu cực đại formazan dung môi isopropanol, isopropanol/HCl, DMSO, DMSO/NH3 lần lƣợt 560 nm, 570 nm, 550 nm 555 nm Mặt khác, dung mơi isopropanol isopropanol/HCl, hình dạng phổ formazan khơng thấy rõ đƣợc đỉnh hấp thu Trong dung môi DMSO, formazan cho hai đỉnh hấp thu 550 nm 650 nm, trong dung mơi DMSO/NH3 có đỉnh hấp thu bƣớc sóng 555 nm 22 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 3.1.2.2 Kết đo độ hấp thu thử nghiệm Hình 3.6 Sự thay đổi màu môi trƣờng giai đoạn nuôi cấy tế bào MTNCHC: (A) thời điểm t0, (B) thời điểm nuôi cấy sau 24 giờ, (C) bắt đầu cho thuốc thử MTT, (D) sau hòa tan formazan Bảng 3.2 Kết đo độ hấp thu formazan dung môi khác DMSO DMSO/NH3 Isopropanol Isopropanol/HCl (550 nm) (555 nm) (560 nm) (570 nm) 0,209 0,228 0,191 0,103 0,201 0,222 0,184 0,102 0,196 0,224 0,186 0,104 0,212 0,230 0,192 0,101 0,222 0,229 0,194 0,099 STT Trung bình ± SD 0,208 RSD% (1) ± 0,010 0,048 0,227 (2) ± 0,003 0,015 0,189 (3) ± 0,004 0,022 0,102(4) ± 0,002 0,019 Ghi chú: (2), (1): p = 0,002 < 0,05; (2), (3): p = 1,5.10-7 < 0,05; (2), (4): p = 8,7.10=13 < 0,05 Sau kiểm tra khác biệt phƣơng sai ý nghĩa độ hấp thu dung môi khác phép kiểm F-test, kết tiếp tục đƣợc so sánh công cụ t-Test: Two-Sample Assuming Equal Variances MS – Excel cho thấy khác biệt có ý nghĩa thống kê kết độ hấp thu formazan dung môi DMSO/NH3 so với nhóm dung mơi DMSO, isopropanol isopropanol/HCl (p < 0,05) 23 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Độ hấp thu formazan dung môi 0,25 Độ hấp thu (OD) 0,2 0,15 0,1 0,05 Dung mơi Hình 3.7 Khảo sát độ hấp thu formazan dung mơi hịa tan khác Nhận xét: - Về mặt cảm quan, hòa tan tinh thể formazan dung mơi DMSO DMSO/NH3 tinh thể đƣợc hịa tan hồn tồn vịng 30 giây, soi dƣới kính hiển vi khơng cịn thấy tinh thể formazan Trong khi, với dung mơi isopropanol isopropanol/HCl tinh thể formazan khó tan Phải lắc đĩa vịng 10 phút để formazan tan hết isopropanol/HCl, khoảng 20 phút formazan isopropanol (hình 3.3) - Hình 3.6 cho thấy thay đổi màu môi trƣờng giai đoạn thử nghiệm Màu môi trƣờng sau 24 chuyển sang màu hồng nhạt chứng tỏ tế bào có sử dụng dinh dƣỡng từ mơi trƣờng - Dựa kết hình 3.7, độ hấp thu formazan dung môi DMSO/NH3 cao so với dung mơi cịn lại có ý nghĩa thống kê (p 0,05 nên hệ số b = -0,0098 khơng có ý nghĩa - Xét tính tƣơng thích: p = 1,7 10-7 < 0,05 nên phƣơng trình hồi quy có tính tƣơng thích - Hệ số tƣơng quan r = 0,9969 > 0,90 chứng tỏ mật độ tế bào độ hấp thu formazan có tƣơng quan mạnh Do đó, phƣơng trình hồi quy tuyến tính có dạng: y = 5.10-6 x (R2 = 0,9939) Phƣơng trình tuyến tính từ 103-105 tế bào/giếng 25 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Hình 3.10 Đồ thị biểu diễn tƣơng quan mật độ tế bào/giếng độ hấp thu Nhận xét Dựa vào đồ thị biểu diễn mối tƣơng quan mật độ tế bào độ hấp thu (Hình 3.9), ta thấy mật độ tế bào có mối tƣơng quan thuận với độ hấp thu tinh thể formazan Ở mật độ tế bào thấp độ tuyến tính giảm nhƣ hình 3.10 Hình 3.11 Minh họa lƣợng tinh thể formazan hình thành tƣơng ứng mơi trƣờng có mật độ tế bào/giếng giảm dần từ hình 1-6 (105; x 104; 2,5 x 104; 104; 7,5 x 103; x 103 tế bào) Nhận xét Dựa vào hình 3.11-4, 3.11-5, 3.11-6, mật độ tế bào dƣới 104 tế bào/giếng tinh thể formazan tạo thành ít, khơng nhìn thấy rõ, chí mật độ 103 tế bào/giếng khơng nhìn thấy xuất tinh thể formazan dƣới kính hiển vi Từ kết thực nghiệm trên, chọn khoảng mật độ tế bào tối ƣu để nuôi cấy dành cho thử nghiệm 104 đến 105 tế bào/giếng 3.1.4 Kết khảo sát nồng độ FBS thời gian nuôi cấy tế bào PBMCs Kết khảo sát nồng độ FBS thời gian nuôi cấy tế bào PBMCs tối ƣu đƣợc trình bày bảng 3.4 26 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Bảng 3.4 Kết đo độ hấp thu formazan đƣợc tạo thành từ giếng nuôi tế bào môi trƣờng với nồng độ FBS khác thời điểm 24, 48, 72 Thời gian 24 FBS 5% FBS 10% FBS 15% Lần 0,139 0,141 0,121 Lần 0,158 0,159 0,17 0,15 0,165 Lần Trung bình ± SD 0,154 0,15 (1) ± 0,010 0,15 (2) ± 0,009 0,152(3) ± 0,027 Lần 0,045 0,077 0,027 Lần 0,043 0,08 0,029 Lần 0,042 0,065 0,025 Trung bình ± SD 0,043(4) ± 0,0015 0,074(5) ± 0,0079 0,027(6) ± 0,002 Lần 0,006 0,011 0,009 Lần 0,007 0,009 0,009 Lần 0,008 0,012 0,007 (7) (8) 48 72 Trung bình ± SD 0,007 ± 0,0010 0,011 ± 0,0015 0,008(9) ± 0,0012 Ghi chú: (2), (1): p = 0,48 > 0,05; (2), (3): p = 0,45 > 0,05; (5), (4): p = 0,001 < 0,05 (5), (6): p = 0,0002 < 0,05; (8), (7): p = 0,012 < 0,05; (8), (9): p = 0,051 > 0,05 Kết phân tích thống kê cho thấy khác biệt có ý nghĩa kết độ hấp thu formazan sinh từ tế bào nuôi cấy môi trƣờng có bổ sung FBS 10% so với nhóm mơi trƣờng có bổ sung FBS 5% 15% thời điểm 48 (p < 0,05) Tại thời điểm 24 72 giờ, khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê (p > 0,05) 27 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Độ hấp thu formazan đƣợc hình thành mơi trƣờng có nồng độ FBS thời gian khác 0,2 Độ hấp thu 0,15 0,1 FBS 5% FBS 10% 0,05 FBS 15% Thời gian 24 48 72 Hình 3.12 Kết khảo sát nồng độ FBS thời gian thích hợp cho nuôi cấy tế bào PBMCs Nhận xét: Dựa đồ thị hình 3.12, thời điểm đánh giá 24 giờ, môi trƣờng nuôi cấy với nồng độ FBS khác cho độ hấp thu formazan tƣơng đƣơng Tuy nhiên, sau nuôi tế bào đƣợc 48 giờ, mật độ tế bào giếng ban đầu giảm nhƣng mơi trƣờng có nồng độ FBS 10% cho độ hấp thu formazan cao hẳn hai mơi trƣờng cịn lại Từ kết thực nghiệm trên, chọn điều kiện nuôi cấy tế bào PBMCs MTNCHC có nồng độ FBS bổ sung 10% thời gian nuôi cấy tối ƣu cho thử nghiệm 24-48 3.1.5 Kết khảo sát môi trƣờng ni cấy tế bào PBMCs Hình 3.13 Kết khảo sát môi trƣờng nuôi cấy tế bào PBMCs thời điểm khác 28 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Nhận xét: Dựa đồ thị hình 3.13, thời điểm khảo sát, độ hấp thu formazan môi trƣờng nuôi cấy giảm theo thứ tự DMEM > RPMI-1640 > DMEM F12 Đồng thời, thời điểm, độ hấp thu formazan hình thành từ tế bào giảm dần theo thời gian 24, 48, 72 Bảng 3.5 Kết đo độ hấp thu formazan đƣợc tạo thành từ giếng nuôi tế bào môi trƣờng khác thời điểm 24, 48, 72 Thời gian 24 48 RPMI-1640 DMEM DMEM F12 Lần 0,206 0,226 0,113 Lần 0,215 0,239 0,139 Lần 0,191 0,232 0,12 Trung bình ± SD 0,204(1) ± 0,012 0,232(2) ± 0,006 0,124(3) ± 0,013 Lần 0,153 0,207 0,081 Lần 0,152 0,204 0,083 Lần 0,156 0,211 0,079 Trung bình ± SD 72 0,154 (4) ± 0,002 0,207 (5) ± 0,004 0,081(6) ± 0,002 Lần 0,095 0,106 0,066 Lần 0,089 0,103 0,062 Lần 0,093 0,102 Trung bình ± SD 0,092 (7) ± 0,003 0,104 (8) ± 0,002 0,07 0,066 (9) ± 0,004 Ghi chú: (2), (1): p = 0,01 < 0,05; (2), (3): p = 0,0001 < 0,05; (5), (4): p = 1,1.10-5 < 0,05 (5), (6): p = 3,4.10-7 < 0,05; (8), (7): p = 0,003 < 0,05; (8), (9): p = 6,6.10-5 < 0,05 Kết phân tích thống kê cho thấy khác biệt có ý nghĩa kết độ hấp thu formazan sinh từ tế bào nuôi cấy mơi trƣờng DMEM so với mơi trƣờng cịn lại thời điểm (p < 0,05) 3.1.6 Kết khảo sát nồng độ PHA quy trình ni cấy PBMCs Sự tăng sinh tế bào PBMCs mơi trƣờng ni cấy có nồng độ PHA khác đƣợc trình bày bảng 3.6 29 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Bảng 3.6 Kết tỷ lệ tăng sinh tế bào PBMCs đƣợc nuôi môi trƣờng có nồng độ PHA khác Mơi trƣờng Tỷ lệ tăng sinh tế bào PBMCs nồng độ PHA khác (%) Thử nghiệm PHA 2% PHA 1,5% PHA 1% PHA 0,5% Lần 3,68 12,88 11,31 3,37 Lần 5,69 12,44 3,18 0,37 RPMI- Lần 4,75 13,69 6,31 0,68 1640 Trung bình ± 4,71(1) ± 13(2) ± 0,63 6,94(3) ± 4,1 1,48(4) ± 1,65 SD P DMEM < 0,05 Lần 2,73 9,75 4,42 1,49 Lần 1,95 10,14 3,96 0,84 Lần 2,92 10,14 4,29 1,75 2,53(5) ± 0,51 10,01(6) ± 0,22 4,22(7) ± 0,23 1,36(8) ± 0,46 Trung bình ± SD P < 0,05 Ghi chú: (2), (1): p = 0,0001 < 0,05 ; (2), (3): p = 0,03 < 0,05 ; (2), (4): p = 0,0001 < 0,05 (6), (5): p = 1,06.10-5 < 0,05 ; (6), (7): p = 3,3.10-6 < 0,05 ; (6), (8): p = 4,3.10-6 < 0,05 Kết phân tích thống kê cho thấy khác biệt có ý nghĩa kết tỷ lệ tăng sinh tế bào PBMCs đƣợc kích thích nồng độ PHA 1,5% so với nồng độ cịn lại Hình 3.14 Kết khảo sát nồng độ PHA thích hợp cho tăng trƣởng tế bào PBMCs 30 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Nhận xét: Dựa đồ thị hình 3.24, mức nồng độ PHA 1,5% (tt/tt), tỷ lệ tăng sinh tế bào PBMCs đạt mức độ cao so với nồng độ cịn lại sau 48 ni cấy Ở nồng độ PHA 1%, tế bào tăng nhiều so với giếng có nồng độ PHA 2% Kết phù hợp với môi trƣờng khảo sát RPMI-1640 DMEM Từ kết thực nghiệm trên, chọn nồng độ PHA tối ƣu 1,5% (tt/tt) cho thử nghiệm tế bào PBMCs 3.2 BÀN LUẬN Chúng thực thử nghiệm đề phần phƣơng pháp đạt đƣợc kết chƣơng giải thích nhƣ sau: - Về kết khảo sát dung mơi hịa tan tinh thể formazan, việc đỉnh hấp thu cực đại formazan dung môi thử nghiệm có khác pH dung mơi khác làm chuyển dịch bƣớc sóng hấp thu cực đại - Về kết khảo sát mật độ tế bào, loại tế bào khác sản sinh lƣợng formazan khác Do đó, có loại tế bào dòng nhƣ tế bào dòng ung thƣ hạch chuột, đồ thị biểu diễn mật độ tế bào/giếng theo độ hấp thu formazan tuyến tính từ 200 đến 50000 tế bào giếng [9] Trong đó, từ kết phần 3.3, mật độ tế bào PBMCs nên chọn mức 104 đến 105 tế bào/giếng cho thử nghiệm PBMCs - Về kết khảo sát nồng độ FBS cho môi trƣờng ni cấy, thời gian ni cấy dài lƣợng tế bào giếng khảo sát giảm nhiều tế bào PBMCs loại tế bào sơ cấp, tự tăng sinh đƣợc khơng có chất kích thích phân bào (nhƣ PHA) [10] Mặt khác, môi trƣờng nuôi cấy không đủ chất dinh dƣỡng cung cấp cho trình sống phát triển tế bào thời gian dài - Về kết khảo sát môi trƣờng nuôi cấy, dƣờng nhƣ môi trƣờng DMEM thích hợp cho việc ni cấy PBMCs, thể qua độ hấp thu cao so với kết từ mơi trƣờng cịn lại Trên thực tế, môi trƣờng RPMI-1640 đƣợc thiết kế chuyên biệt cho nuôi cấy tế bào lympho đƣợc sử dụng nhiều thử nghiệm khác liên quan đến tế bào lympho Tuy nhiên, việc lựa chọn môi trƣờng phù hợp cho dịng tế bào ni cấy cịn phải phụ thuộc nhiều yếu tố khác nhƣ mục đích nghiên cứu ngun vật liệu có sẵn phịng thí nghiệm - Về kết khảo sát nồng độ PHA, cho thấy nồng độ PHA 1,5%, tỷ lệ tăng sinh PBMCs 48 cao nhất, phù hợp với hƣớng dẫn nhà sản xuất (1-2%) Ở nồng độ PHA thấp (0,5% hay 1%), tỷ lệ tăng sinh tế bào thấp nồng độ PHA 1,5% 31 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh lƣợng PHA nên tế bào phân chia Nhƣng nồng độ PHA 2%, tỷ lệ tăng sinh tế bào lại thấp giải thích tế bào tăng trƣởng nhanh nên môi trƣờng không đủ dinh dƣỡng cho nuôi cấy tế bào Mặt khác, tế bào sản sinh nhiều độc tố môi trƣờng nuôi cấy gây chết tế bào Kết phù hợp với môi trƣờng khảo sát RPMI-1640 DMEM 32 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 33 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1 KẾT LUẬN Đề tài thu đƣợc số kết sau: - Tối ƣu đƣợc tốc độ thời gian ly tâm mẫu máu để phân lập PBMCs ống Leucosep® thích hợp 1200 x g 20 phút với 95% tế bào sống đƣợc xác định phƣơng pháp nhuộm trypan blue - Xác định đƣợc dung mơi tối ƣu hịa tan tinh thể formazan phƣơng pháp đánh giá tỷ lệ sống độc tính tế bào sử dụng MTT tế bào PBMCs DMSO/NH3 - Xác định đƣợc khoảng mật độ tế bào PBMCs tối ƣu đĩa 96 giếng 104 – 105 tế bào/giếng - Xác định đƣợc nồng độ FBS tối ƣu bổ sung cho môi trƣờng nuôi cấy tế bào PBMCs 10% - Môi trƣờng nuôi cấy tối ƣu đƣợc xác định dựa theo kết DMEM Tuy nhiên, việc lựa chọn mơi trƣờng ni cấy cịn phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhƣ loại tế bào, điều kiện có sẵn, thời gian thử nghiệm… - Tối ƣu hóa đƣợc nồng độ PHA kích thích tăng sinh tế bào PBMCs cho thử nghiệm 48 1,5% 4.2 ĐỀ NGHỊ Do thời gian điều kiện làm đề tài giới hạn nên khảo sát đƣợc điều kiện tối ƣu cỡ mẫu nhỏ Nếu có điều kiện cho phép, chúng tơi đề nghị: - Khảo sát điều kiện nuôi cấy tế bào PBMCs nhƣ với cỡ mẫu lớn để có kết thống kê xác - Thực thử nghiệm máu ngƣời tình nguyện khỏe mạnh cung cấp, ngày khác để xác định thêm độ đúng, độ lặp lại mơ hình thử nghiệm - Khảo sát thêm điều kiện khác nuôi cấy PBMCs nhƣ thay đổi nồng độ CO2, nhiệt độ để xây dựng đƣợc quy trình ni cấy PBMCs in vitro tối ƣu - Khảo sát thêm thử nghiệm tối ƣu hóa nồng độ PHA kích thích tăng sinh tế bào PBMCs thời gian dài (72 - 96 giờ) - Áp dụng quy trình tối ƣu xây dựng đƣợc thử nghiệm khảo sát sơ tác dụng điều hòa miễn dịch dƣợc liệu 34 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Ibramhim J (2015), "Plant-derived immunomodulators: an insight on their preclinical evaluation and clinical trials", Frontiers in Plant Science, 6(655), 655 [2] Wang L., F.S Wang, and M.E Gershwin (2015), "Human autoimmune diseases: a comprehensive update", J Intern Med, 278(4), 369-395 [3] Aldahlawi A.M (2016), "Modulation of dendritic cell immune functions by plant components", Journal of Microscopy and Ultrastructure, 4(2), 55-62 [4] Amirghofran Z., Hashemzadeh R., Javidnia K., et al (2011), "In vitro immunomodulatory effects of extracts from three plants of the Labiatae family and isolation of the active compound(s)”, J Immunotoxicol, 8(4), 265-273 [5] Arreola R (2015), "Immunomodulation and Anti-Inflammatory Effects of Garlic Compounds", Journal of Immunology Research, 2015, [6] Harput U.S., I Saracoglu, and Y Ogihara (2005), "Stimulation of lymphocyte proliferation and inhibition of nitric oxide production by aqueous Urtica dioica extract", Phytother Res, 19(4), 346-348 [7] Sarma D and R Khosa (1994), "Immunomodulators of plant origin – a review", Anc Sci Life, 13(3-4), 326-331 [8] Singh N (2016), "A review on herbal plants as immunomodulators", International Journal of Pharmaceutical Sciences and Research, 7(9), 3602 – 3610 [9] Mosman T (1983), “Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxicity assays”, J Immunol Methods, 65, 55-63 [10] Panda S K., Ravindran B (2013), “In vitro Culture of Human PBMCs”, bioprotocol.org, Feb 5, 2013 [Online] Available: https://bio-protocol.org/e322 [Accessed: Jul 15, 2018] 35 ... hình in vitro nuôi cấy tế bào miễn dịch đơn nhân phân lập từ máu ngoại vi ngƣời (PBMC) để thử hoạt tính làm tăng sinh ức chế miễn dịch dƣợc liệu [4-7] Ở Vi? ??t Nam, mơ hình nghiên cứu tế bào in vitro. .. tăng sinh tế bào lympho miễn dịch để ứng dụng điều trị, chúng tơi thực đề tài ? ?Xây dựng mơ hình ni cấy in vitro tế bào đơn nhân đƣợc phân lập từ máu ngoại ngƣời” với mục tiêu cụ thể sau: Xây dựng. .. tìm đƣợc điều kiện ni cấy tế bào PBMCs đƣợc dùng cho nghiên cứu sâu miễn dịch sau, thực đề tài ? ?Xây dựng mơ hình ni cấy in vitro tế bào đơn nhân đƣợc phân lập từ máu ngoại vi ngƣời” Mục tiêu đề