Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy in vitro trong công tác nhân giống cây mía (Saccharum officinarum L.) docx

ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy in vitro trong công tác nhân giống cây mía (Saccharum officinarum L.) Application of in vitro technique for propagation of sugarcane (Saccharum officinarum L.) Nguyễn Thị Nhẫn Summary In vitro micropropagation of sugarcane varieties F134 and Q15 has been studied. Rapid shoot initiation was found in MS medium containing o,5ppm -NAA and 1ppm BA or kinetin after four weeks. The highest multiplication rate was obtained in the same medium. Good rooting ability was observed on MS medium supplemented with 0.5ppm -NAA or on medium sans phytohormone with 7.5 percent saccharose. Better survival of plantlets was obtained in the humid soil. Keywords: Sugarcane, micropropagation, medium, multiplication 1. Đặt vấn đề Cây mía (Saccharum officinarum L.) là một trong những cây công nghiệp có giá trị kinh tế cao. ở nớc ta, mía là nguồn nguyên liệu duy nhất cho ngành công nghiệp chế biến đờng. Theo dự tính của các nhà chuyên môn thì triển vọng của ngành trồng mía ở nớc ta là rất lớn, vì chúng ta có những điều kiện thuận lợi để nâng cao năng suất và sản lợng mía, đáp ứng đợc lợng đờng tiêu dùng trong nớc và xuất khẩu (Trịnh Minh Châu, 2003). Hiện nay, ngành mía đờng không chỉ tạo ra mặt hàng xuất khẩu quan trọng mà còn tạo công ăn việc làm, giúp ngời dân xoá đói giảm nghèo. Mặt khác, góp phần nâng cao hiệu quả của việc sử dụng tài nguyên đất ở các vùng đất đồi khô hạn. Tuy nhiên, ngành mía đờng đang đứng trớc khó khăn là các nhà máy chế biến cha hoạt động đủ công suất vì thiếu nguyên liệu (Nguyễn Đức Sơn, 2002). Vì vậy, vấn đề trớc mắt là phải mở rộng vùng nguyên liệu, xây dựng cơ cấu giống hợp lý và có các bộ giống chuẩn cho từng vùng có điều kiện sinh thái khác nhau. Mục đích của nghiên cứu này là góp phần giải quyết cây giống phục vụ cho việc mở rộng diện tích vùng mía nguyên liệu. 2. Phơng pháp nghiên cứu Đối tợng nghiên cứu là các giống mía lai : - Quế Đờng 15 (Hoa Nam 52-12 x Nội Giang 59-782) là giống chín muộn đợc lai tạo tại Viện mía đờng Quảng Tây- Trung Quốc. - F134 ( C0 290 x P0J28/78) là giống chín trung bình có nguồn gốc từ Đài Loan Nguyên liệu sử dụng trong thí nghiệm là các mắt mía đợc lấy từ ngọn cây mía sau khi thu hoạch. Ngọn mía thu về đợc rửa sạch, lau cồn (70 o ), sau đó đa vào buồng cấy vô trùng, bóc bẹ lá, cắt các mắt mía và đỉnh sinh trởng ngọn đa vào môi trờng nuôi cấy. Tất cả các thí nghiệm trong công đoạn in vitro đều đợc sử dụng môi trờng dinh dỡng cơ bản là Murashige - skoog (MS) có 3% saccaroza. Riêng môi trờng ra rễ có bổ sung than hoạt tính (0,5g/l). Tuỳ theo mục đích, yêu cầu của từng thí nghiệm có thể sử dụng các chất điều tiết sinh trởng sau: Kinetin (K), Benzin aminopurin (BA), -naphtyl axetic axit (-NAA). Các thí nghiệm đợc bố trí nh sau: Thí nghiệm 1: Tìm hiểu ảnh hởng của BA và K đến khả năng tái sinh chồi từ mẫu cấy ban đầu. Thí nghiệm gồm 5 công thức: CT1(đ/c): MS + 0,5ppm -NAA ; CT2: MS + 0,5ppm -NAA + 0,5ppm BA 1 CT3: MS + 0,5ppm -NAA + 1ppm BA CT4: MS + 0,5ppm -NAA+0,5ppm K CT5: MS + 0,5ppm -NAA + 1ppmK Thí nghiệm 2: Tìm hiểu ảnh hởng của nồng độ xytokinin (BA và K) đến khả năng nhân nhanh chồi mía trong ống nghiệm. Môi trờng nền là MS có 0,5ppm -NAA (đ/c) đợc bổ sung BA hoặc K ở các ngỡng nồng độ: 0,5ppm, 1ppm, 1,5ppm, và 2ppm. Thí nghiệm 3: Xác định môi trờng ra rễ của cây mía trong ống nghiệm. Theo dõi quá trình ra rễ của cây mía in vitro trên môi trờng có bổ sung -NAA với các nồng độ 0ppm (không bổ sung); 0,25ppm; 0,5ppm; 0,75ppm; 1ppm và trên môi trờng có bổ sung hàm lợng Saccaroza với các nồng độ 3%(đ/c); 4,5%; 6%; 7,5%; 9% trong môi trờng không có chất điều tiết sinh trởng. Thí nghiệm 4: Tìm hiểu ảnh hởng của giá thể đến sự sinh trởng, phát triển của cây mía in vitro khi đa ra vờn ơm. Các loại giá thể đợc sử dụng gồm: 1. Cát, 2. Cát + than trấu (1:1), 3. Đất (đất tơi xốp, nghiền nhỏ và tới ẩm), 4. Đất + than trấu (1:1), 5. Đất ớt (đất tơi xốp, tới nhiều nớc, đảo nhuyễn gần giống nh đất gieo mạ). 3. Kết quả và thảo luận 3.1. ảnh hởng của BA và kinetin đến khả năng tái sinh chồi từ mẫu cấy ban đầu Bảng 1. Tỷ lệ tái sinh chồi từ mô cấy ban đầu (%) Chất ĐTST (ppm) Sau 3 ngày Sau 6 ngày Sau 9 ngày Sau 12 ngày Sau 15 ngày Công thức BA K F134 QĐ15 F134 QĐ15 F134 QĐ15 F134 QĐ15 F134 QĐ15 1 2 3 4 5 0,0 0,5 1,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,5 1,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 8,1 10,3 15,7 9,4 13,5 20,1 23,5 30,7 22,4 27,3 21,9 25,5 30,7 26,3 28.4 45,4 48.3 65,7 45,9 63,5 60,0 67,8 80.3 64.7 79,0 61,3 79,3 86,4 73,7 88,5 62,3 83,7 90,4 84,3 89,7 63,5 86.7 92,5 85,9 90,3 Trong nuôi cấy in vitro ngời ta thờng thay đổi tỷ lệ auxin và xytokinin để kích thích khả năng tái sinh chồi từ mẫu cấy (M.A. Mamun, M.B.H.Sikdar, 2004). Với auxin ở nồng độ thấp (0,5ppm -NAA) và thay đổi xytokinin (BA và kinetin) từ 0,5 đến 1,0ppm thì sau 6 ngày nuôi cấy, các mầm mía của cả 2 giống đều bắt đầu hình thành trên cả 5 công thức. Sau 15 ngày, tỷ lệ tái sinh chồi đạt trên 60% ở công thức đối chứng (không có BA và K) và trên 80% ở các công thức thí nghiệm (có BA hoặc K) (bảng 1). Nh vậy, nồng độ thích hợp cho khả năng tái sinh chồi với cả 2 giống là 1ppm BA hoặc 1ppm K. ở ngỡng nồng độ này, tỷ lệ mẫu tạo chồi đạt 89,7 90,4% với giống F134 và 90,3 92,5 % với giống QĐ15 sau 15 ngày nuôi cấy. Khả năng sinh trởng, phát triển của chồi đợc thể hiện qua chỉ tiêu chiều cao và số lá (bảng 2). Các chồi mía sinh trởng, phát triển tốt hơn trên các môi trờng có xytokinin (CT2- CT5). Trên các môi trờng này, sau 30 ngày nuôi cấy, giống F134 có chiều cao cây đạt từ 3,8- 8,2cm tơng ứng với số lá từ 1,3- 2,5 lá. Giống QĐ15 cũng có chiều cao dao động từ 5,1- 12,1cm và số lá từ 1,0- 2,6 lá/cây. Cùng thời gian này, trên môi trờng không có xytokinin (đ/c), chiều cao cây chỉ đạt 1,9cm (F134), 0,9cm (QĐ15) và cả 2 giống đều cha có lá. 2 Bảng 2. Khả năng sinh trởng phát, triển của chồi mía từ mô cấy ban đầu Sau 15 ngày Sau 20 ngày Sau 25 ngày Sau 30 ngày Chất ĐTST (ppm) F134 QĐ15 F134 QĐ15 F134 QĐ15 F134 QĐ15 Công thức (CT) BA K h sl h sl h sl h sl h sl h sl h sl h sl 1 2 3 4 5 0,0 0,5 1,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,5 1,0 0,7 0,8 0,8 0,7 0,6 - - - - - 0,4 0,6 0,6 0,6 0,5 - - - - - 0,9 2,0 1,9 1,0 1,2 - - - - - 0,7 2,4 1,0 1,3 1,7 - 0,5 - - 0,3 1,2 2,4 5,2 2,1 3,7 - 0,5 1,0 0,4 1,3 0,8 7,0 2,6 2,7 6,1 - 2,3 0,5 0,5 1,8 1,9 3,8 8,0 5,0 8,2 - 1,3 2,3 2,0 2,5 0,9 12,1 10,9 5,1 10,6 - 2,6 2,5 1,0 2,5 (Ghi chú: h là chiều cao trung bình của chồi (cm) ; sl là số lá trung bình/chồi) Nh vậy, trên môi trờng dinh dỡng MS có 0,5 ppm -NAA có thể bổ sung BA hoặc kinetin ở nồng độ 1ppm để kích thích khả năng tái sinh chồi mía từ mẫu cấy ban đầu. 3.2. ảnh hởng của nồng độ xytokinin (BA và K) đến khả năng nhân nhanh chồi mía trong ống nghiệm Trên nền MS có 0,5ppm -NAA, khi tăng nồng độ BA và K đã cho thấy tác động của chúng đến hệ số nhân chồi sau 4 tuần cấy chuyển (bảng 3). Bảng 3. Hệ số nhân chồi (HSN) sau 4 tuần cấy chuyển Số chồi cấy* Sau1 tuần* Sau 2 tuần* Sau 3 tuần* Sau 4 tuần* HSN (lần sau 4tuần) CT Nồng độ (ppm) F134 QĐ15 F134 QĐ15 F134 QĐ15 F134 QĐ15 F134 QĐ15 F134 QĐ15 Bổ sung BA 1 2 3 4 5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 4,0 3,9 4,0 4,1 4,0 4,1 4,0 4,2 4,0 4,1 5,5 5,4 6,8 6,1 5,7 6,1 5,3 7,2 5,9 6,1 8,6 8,8 9,7 8,3 8,4 8,9 8,9 10,9 8,5 8,5 12,0 11,6 14,5 10,3 11,1 11,9 11,9 15,0 11,2 11,8 13,2 14,7 17,8 13,9 13,5 13,9 15,8 18,6 15,3 13,6 3,3 3,8 4,5 3,4 3,4 3,4 4,0 4,4 3,8 3,2 Bổ sung kinetin 1 2 3 4 5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 4,0 3,9 3,9 4,1 4,0 4,1 4,2 4,0 4,0 4,0 6,9 6,7 8,5 6,8 5,9 7,5 6,6 9,0 7,0 6,4 9,3 9,7 12,1 9,4 9,6 10,5 9,9 12,7 10,0 10,2 11,4 13,7 16,8 15,1 14,2 12,9 14,6 17,4 15,0 15,4 13,8 17,9 20,7 17,3 16,9 14,3 18,2 22,0 18,3 17,8 3,4 4,6 5,3 4,2 4,2 3,5 4,3 5,5 4,6 4,4 (Ghi chú: * Đơn vị tính là số chồi trung bình/1bình cấy) Khi bổ sung BA và kinetin với nồng độ 1ppm vào môi trờng nuôi cấy, hệ số nhân chồi khi cấy chuyển ở thời điểm 4 tuần là 4,4 4,5 lần với BA (bảng3) và 5,3 5,5 lần với kinetin (bảng 4). Khi tăng BA và Kinetin lên 1,5 và 2ppm thì hệ số nhân của cả 2 giống đều giảm. Tuy nhiên, tốc độ giảm hệ số nhân nhanh hơn khi tăng BA. ở nồng độ 2 ppm, hệ số nhân của giống F134 chỉ còn 3,4 (vợt đ/c 0,1) và giống QĐ15 là3,2 (kém đ/c 0,1). Trong khi cũng ở nồng độ 2ppm của kinetin, hệ số nhân vẫn vợt đối chứng 0,8 (F134) và 0,9 (QĐ15). Nh vậy, môi trờng nhân nhanh đợc chọn vẫn là MS có 0,5ppm -NAA và 1 ppm BA (hoặc 1 ppm kinetin). 3.3. ảnh hởng của hàm lợng -NAA và saccaroza đến quá trình ra rễ của chồi mía trong ống nghiệm Giống QĐ15 Kết quả hình 1a cho thấy: Có 3 trong số 5 công thức có tỷ lệ chồi ra rễ 100% sau 3 tuần nuôi cấy. Tuy nhiên, chất lợng bộ rễ đợc đánh giá cao nhất ở công thức có nồng độ -NAA là 0,5ppm, với số rễ trung bình/cây là 8,3 rễ, sau đó là nồng độ 0,75ppm (3,9 rễ/cây). Trên môi trờng dinh dỡng không có -NAA tỷ lệ chồi ra rễ chỉ đạt 83,3% và trung bình chỉ có 2,8 rễ/cây. 3 100 100 95.8 83.3 100 2.9 3.2 2.6 6.3 3.9 0 20 40 60 80 100 120 0,0(đ/c) 0,25 0,50 0,75 1,00 NAA (ppm) Tỷ lệ cây ra rễ (%) 0 1 2 3 4 5 6 7 Số rễ /cây Tỷ lệ cây ra rễ Số rễ/cây 95.8 100 79 83.3 100 5.2 5.3 3 2.5 8.2 0 20 40 60 80 100 120 3,0(đ/c) 4,5 6,0 7,5 9,0 Saccaroza (%) Tỷ lệ cây ra rễ (%) 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Số rễ/cây Tỷ lệ cây ra rễ Số rễ/cây (a) (b) Hình 1. Khả năng ra rễ của giống QĐ15 sau 3 tuần nuôi cấy Saccaroza là thành phần quan trọng của môi trờng nuôi cấy. Nhng khi sử dụng ở nồng độ cao đã có tác dụng xúc tiến nhanh quá trình ra rễ của chồi mía (hình 1b). Sau 3 tuần nuôi cấy đã có 100% số chồi ra rễ ở hàm lợng saccaroza từ 6% đến 7,5%. Tuy nhiên, số rễ trung bình/cây đạt cao hơn ở hàm lợng saccaroza 7,5%. Khi tăng nồng độ saccaroza lên 9% không chỉ làm giảm số rễ/cây mà tỷ lệ cây ra rễ cũng đã giảm chút ít. Giống F134 Bảng 4. Khả năng ra rễ của giống mía F134 sau 3 tuần nuôi cấy Sau 1 tuần Sau 2 tuần Sau 3 tuần Công thức Nồng độ (ppm) SR % SR % SR % Bổ sung -NAA 1(đ/c) 0,00 1,2 29,2 1,9 38,5 2,7 42,7 2 0,25 1,8 30,5 2,6 47,3 3,2 68,4 3 0,50 2,5 33,5 4,6 62,7 5,6 90.0 4 0,75 1,3 28,7 3,5 54,6 3,8 86,5 5 1,00 1,1 26,8 2,6 45,1 3,8 63,7 Bổ sung hàm lợng saccaroza 1(đ/c) 3,0 1,2 29,2 1,9 38,5 2,7 42,7 2 4,5 0,5 30,0 1,4 35,7 3,0 55,3 3 6,0 1,5 41.1 3,2 69,3 5,3 88,7 4 7,5 1,4 39,0 4,6 76,6 6,5 89,0 5 9,0 2,0 27,6 3,7 53,6 4,2 85,3 Ghi chú: SR là số rễ tb/cây ; % là tỷ lệ cây ra rễ Trên giống F134 cũng có kết quả tơng tự nh giống QĐ15. Nồng độ -NAA thích hợp nhất cho quá trình ra rễ của giống mía này cũng là 0,5ppm. Tuy nhiên, tỷ lệ cây ra rễ của giống này luôn thấp hơn giống QĐ15 ở tất cả các cặp công thức tơng ứng. Sau 3 tuần, công thức có tỷ lệ cây ra rễ cao nhất cũng chỉ đạt 90% (CT3- bảng4) Nồng độ saccaroza có khả năng kích thích nhanh sự ra rễ vẫn là 6 -7,5% (bảng 4). Tuy nhiên, sau 3 tuần nuôi cấy cha có công thức nào đạt tỷ lệ cây ra rễ 100% và nồng độ saccaroza cao (9%) cha biểu hiện rõ ức chế sinh trởng, phát triển của bộ rễ nh giống QĐ15. 3.4. ảnh hởng của giá thể đến khả năng sinh trởng, phát triển của cây mía in vitro khi đa ra vờn ơm 4 Bảng 5. Tỷ lệ sống của cây mía in vitro ngoài vờn ơm(%) Sau 5 ngày Sau 10 ngày Sau 15 ngày Công thức Giá thể Số cây trồng F134 QĐ15 F134 QĐ15 F134 QĐ15 1 2 3 4 5 Cát (đ/c) Cát + than trấu (1:1) Đất Đất + than trấu (1:1) Đất ớt 80 80 80 80 80 97,5 96,2 91,2 93,7 100 97,5 95,0 90,0 97,5 100 95,7 92,5 87, 90,00 100 95,0 95,0 85,0 95,0 97,5 91,2 92,5 86,2 85,5 97,5 90.0 90,0 77,5 92,5 95,0 QĐ15 0 10 20 30 40 50 60 70 80 Ban đầu 1234567 Thời gian theo dõi (tuần) Chiều cao cây (cm) cát cát+trấu đất đất + trấu đất ớt F134 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 Ban đầu 1234567 Thời gian theo dõi (tuần) Chiều cao cây (cm) cát cát+trấu đất đất + trấu đất ớt Hình 2. Động thái tăng trởng chiều cao cây mía Tỷ lệ sống của cả 2 giống thí nghiệm đều đạt cao nhất trên nền đất ớt (95 97,5% sau 15 ngày). Tuy nhiên, ngoài giá thể bằng đất, các giá thể còn lại đều có thể sử dụng để trồng cây mía in vitro khi chuyển từ ống nghiệm ra vờn ơm với tỷ lệ sống đạt trên 90%. Riêng giống F134 có biểu hiện sai khác không rõ trên nền đất (CT3) và đất + than trấu (CT4). Ngoài tỷ lệ sống cao, động thái tăng trởng chiều cao cây của cả 2 giống đều vợt trội trên nền đất ớt (hình2). Nh vậy, đất ớt là loại giá thể rất thuận lợi cho khả năng hồi phục nhanh của cây mía khi chuyển từ điều kiện bán tự dỡng sang tự dỡng hoàn toàn của cây mía khi chuyển từ ống nghiệm ra vờn ơm. 4. Kết luận Trên môi trờng MS có 0,5ppm -NAA, khi bổ sung 1ppm BA hoặc kinetin đều có tác dụng kích thích nhanh sự hình thành chồi từ mẫu cấy ban đầu.Và đây cũng là môi trờng cho HSN cao trong giai đoạn nhân chồi (4,4 - 4,5 lần đối với BA và từ 5,3 5,5 lần đối với kinetin sau 4 tuần). Cây mía in vitro ra rễ thuận lợi hơn trên môi trờng có -NAA ở nồng độ 0,5ppm hoặc trên môi trờng dinh dỡng có hàm lợng saccaroza cao (6 đến 7,5%). Khi đa cây mía ra vờn ơm có thể trồng trên cát, cát + trấu (1:1) hoặc đất + trấu (1:1) nhng tốt nhất là trên nền đất ớt. Cây mía trồng trên nền đất ớt không chỉ có tỷ lệ sống cao hơn và khả năng sinh trởng, phát triển của cây cũng tốt hơn. Có sự sai khác không nhiều giữa giống F134 và QĐ15 trong công đoạn nhân in nhanh in vitro. 5 Tài liệu tham khảo Trịnh Minh Châu (2003), Một số ý kiến về chơng trình một triệu tấn mía đờng mía đờng Tạp chí NN & PTNT- Số 11-2003, trang 47-50. Nguyễn Đức Sơn (2002), Một số biện pháp đẩy mạnh thâm canh tăng năng suất mía của tỉnh Thanh Hoá, Tạp chí NN & PTNT, số 12/2002, trang 69-71. 3.M.A. Mamun, M.B.H.Sikdar (2004), In vitro micropropagation of some inportant sugarcane varieties of Bangladesh, Asian Journal of plant Sciences 3(6),666-669, 2004, pp.72-76. 6 . ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy in vitro trong công tác nhân giống cây mía (Saccharum officinarum L. ) Application of in vitro technique for. 290 x P0J28/7 8) l giống chín trung bình có nguồn gốc từ Đài Loan Nguyên liệu sử dụng trong thí nghiệm l các mắt mía đợc l y từ ngọn cây mía sau khi thu