Ứng dụng kỹ thuật PCR tìm gen DYZ1 để xác định NST Y cho các bệnh nhân chưa rõ giới tính docx

Để khẳng định cho hai trường hợp này chúng tôi tiến hành PCR tìm gen DYZ là gen trên nhánh dài để phát hiện NST Y kết quả cho thấy không tìm thấy gen DYZ trên cả hai bệnh nhân này, do đó

ứng dụng kỹ thuật PCR tìm gen DYZ1 để xác định NST Y

cho các bệnh nhân chưa rõ giới tính

Nguyễn Thanh Thuý 1 , Vũ Triệu An 1 , Văn Đình Hoa 1

Nguyễn Thị Phượng 2 , Vũ Chí Dũng 2

1 Bộ môn Miễn dịch - Sinh lý bệnh, trường Đại học Y Hà Nội

2 Khoa Nội tiết - Chuyển hoá - Di truyền, Viện Bảo vệ sức khoẻ trẻ em

Sau khi tiến hành PCR tìm gen TDF để chẩn đoán giới tính và đối chiếu với kết quả nuôi cấy NST cho 40 bệnh nhân thì thấy 95% phù hợp tức là có mặt song hành TDF và NST Y và ngược lại, còn lại 5 % (2 bệnh nhân) không phù hợp: 46XX nhưng TDF (+) và 46XY/46Xr (X) nhưng TDF (-)

Để khẳng định cho hai trường hợp này chúng tôi tiến hành PCR tìm gen DYZ là gen trên nhánh dài

để phát hiện NST Y kết quả cho thấy không tìm thấy gen DYZ trên cả hai bệnh nhân này, do đó kết luận là không có mặt NST Y

I Đặt vấn đề

ở người và động vật có vú thì nhiễm sắc thể

Y là một trong những nhiễm sắc thể ngắn nhất

Người ta đã tiến hành nghiên cứu trên một số

cá thể có bộ nhiễm sắc thể: 46,XY; 47,XXY và

47,XYY đều có tinh hoàn và là nam Trong khi

đó 46,XX, 47,XXX và 45,XO có kiểu hình là nữ

Do đó, có thể kết luận là kiểu hình nam phụ

thuộc vào nhiễm sắc thể Y Ngày nay ngưòi ta

đi sâu hơn và đã tìm ra ở nhánh ngắn của NST

Y thì có gen mã cho yếu tố TDF (Testis

Determining Factor = Yếu tố quyết định tinh

hoàn), còn nhánh dài thì có gen mã cho sự

sinh tinh trùng AZF (Azoospermie factor) các

gen này chiếm khoảng 2 - 3% NST Y Còn lại

là các trình tự lặp đi lặp lại một cách đặc hiệu

và chỉ có ở NST Y Người ta gọi đó là vùng

Heterochromatin, gen DYZ nằm ở vùng này (D

= DNA; Y = NST Y; Z = Repetive copy DNA -

Đoạn lặp lại trên NST Y) Do NST Y có chức

năng và cấu trúc đặc biệt như vậy, nên việc

xác định NST Y có vai trò quan trọng, quyết

định trong việc chẩn đoán giới tính

Năm 1972, Pearson và cs [ 4 ] bằng kỹ

thuật nhuộm huỳnh quang các tế bào niêm

mạc miệng, tế bào lympho ở metaphase đã

thấy các tế bào lấy từ đối tượng là nam giới có

bắt màu huỳnh quang ở nhánh dài NST Y

người ta gọi đó là vật thể Y Số lượng vật thể Y

chính bằng số NST Y có trong tế bào, nhưng chỉ có khoảng 15% các tế bào 47,XYY và 48,XXYY có hai vật thể Y và 0,05% nam 46,XY bình thường về giới không có vật thể Y

Do vậy kỹ thuật này có độ nhạy kém

Kỹ thuật nuôi cấy xếp bộ NST là một trong

kỹ thuật khá chính xác do Tjio và Levan tìm ra năm 1956 [7] và sau đó năm 1972 được hội nghị ở Pari thống nhất gọi tên các loại băng, từ

đó đến nay nó là kỹ thuật chính để xác định NST Y [5] trong mọi trường hợp Phương pháp này nhiều khi phải làm đi làm lại nhiều lần do kết quả nghi ngờ trong các trường hợp khó: bệnh nhân kiểu hình là nam, có bất thường bộ phận sinh dục, 46,XX TDF (+) do TDF nằm trên NST X, hay có một mẩu NST X hoặc NST mất đoạn thì dễ nhầm với NST Y

Vì vậy năm 1992 Kaoru Suzumori và cs đã ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử tìm gen DYZ trong máu mẹ để chẩn đoán giới tính cho thai nhi [3] Đây là gen được tạo nên bản sao 5 nucleotide (TTCCA) lặp lại 3000 lần trên Y, nếu có mặt thì chắc chắn đó là NST Y

ở nước ta chưa một nghiên cứu nào đề cập

đến việc xác định NST Y qua gen này Chính vì vậy chúng tôi tiến hành đề tài này với các mục tiêu sau:

1 Sử dụng kỹ thuật PCR với cặp mồi SY

160 tìm gen DYZ để xác định NST Y cho các

bệnh nhân chưa rõ giới tính

2 Tiến hành kỹ thuật PCR tìm DYZ để

khẳng định sự có mặt hay không có mặt của

NST Y trong trường hợp không có sự phù hợp

giữa PCR tìm TDF và caryotype

II Đối tượng và phương pháp

nghiên cứu:

1 Đối tượng:

40 bệnh nhân có chẩn đoán là mập mờ giới

tính được vào khoa Nội tiết chuyển hoá di

truyền viện Bảo vệ sức khoẻ trẻ em

2 Phương pháp nghiên cứu:

Chúng tôi tiến hành chiết tách ADN từ bạch

cầu lympho máu ngoại vi của 40 bệnh nhân, sau

đó tiến hành xác định giới tính cho bệnh nhân

này bằng kỹ thuật PCR xác định gen TDF, kỹ

thuật này đã được chuẩn cho phản ứng chính xác

100% các trường hợp [8] Khi có kết quả TDF thì

chúng tôi đối chiếu với caryotype của bệnh nhân

sẽ xảy ra hai trường hợp sau:

- Nếu kết quả TDF phù hợp với caryotype

(TDF luôn có mặt cùng NST Y và ngược lại) thì

chúng tôi lấy làm nhóm chứng để chuẩn kỹ

thuật PCR tìm gen DYZ để xem độ chính xác

của kỹ thuật

- Nếu kết quả TDF không phù hợp với

caryotype của bệnh nhân thì dựa trên kết quả

PCR tìm DYZ, là kỹ thuật đã được chuẩn ở trên

để kiểm tra lại và kết luận xem thật sự có hay

không có mặt NST Y

3 Kỹ thuật:

* Kỹ thuật PCR: tiến hành tại bộ môn Miễn

dịch - Sinh lý bệnh Trường Đại học Y Hà Nội

- Chiết tách ADN từ bạch cầu lympho máu

ngoại vi theo phương pháp chelex

- Thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi của

gen TDF để xác định giới và PCR với cặp mồi

của gen DYZ để xác định NST Y

- Sau đó kiểm tra kết quả bằng điện di trên

gen thạch agarose 2%

- Đọc kết quả bằng đèn tử ngoại λ=310nm như sau:

TDF (+) cho sản phẩm là 425bp.DYZ (+) cho sản phẩm là 236pb

Phân tích kết quả: TDF (+) nam; TDF (-) nữ Nếu DYZ (+): có mặt NST Y

DYZ (-): không có NST Y

TDF (+), DYZ (-): TDF nằm trên NST X

TDF (-), DYZ (+): TDF bị mất đoạn trên Y Chứng nam: TDF (+); DYZ (+); NST 46,XY Chứng nữ: TDF (-); DYZ(-); NST 46,XX

* Kỹ thuật nuôi cấy tế bào định caryotype: được tiến hành tại bộ môn Y sinh

học - Di truyền, trường Đại học Y Hà Nội

III Kết quả

Bảng 1: PCR tìm gen TDF để xác định giớí cho 40 bệnh nhân chưa rõ giới

TDF n %

Các bệnh nhân chưa rõ giới tính được nghiên cứu thì 40 % là nữ bị nam hoá, còn 60%

là nam bị nữ hoá

Bảng 2: Đối chiếu giữa kết quả PCR và caryotype của 40 bệnh nhân

46, XX 15 37,5 TDF (-)

n = 16 46, XY/ 46, X(r)X 1 2,5

46, XY

46, XX/ 46, XY

45, XO/ 46, XY

47, XXY

19

1

2

1 57,5

TDF (+)

n = 24

Nhận xét:

- 15/40 số trường hợp chiếm 37,5 % gen TDF (-) có kết quả phù hợp với kết quả NST là 46,XX Được sử dụng làm nhóm chứng cho PCR tìm DYZ

- 23/40 số trường hợp chiếm 57,5 % gen TDF (+) phù hợp với kết quả NST là 46,XY

Được sử dụng làm nhóm chứng cho PCR tìm

DYZ

- 1/40 số trường hợp chiếm 2,5 % gen TDF

(-) nhưng kết quả nuôi cấy NST là 46, XY /46,

Xr(X)

- 1 /40 số trường hợp chiếm 2,5% gen TDF

(+) nhưng kết quả nuôi cấy NST là 46,XX

Bảng 3: Xác định NST Y bằng PCR tìm DYZ

ở nhóm chứng

TDF(+), 46, XY TDF(-), 46, XX

n % n %

DYZ(-) 0 0 15 100

Nhận xét: với 38 trường hợp có kết quả phù

hợp giữa TDF và caryotype để làm chứng cho

cho kỹ thuật PCR tìm DYZ để xác định NST Y

cho kết quả chính xác 100%, không có trường

hợp nào dương tính hay âm tính giả

Bảng 4: Kết quả PCR tìm DYZ ở nhóm bệnh

nhân có kết quả không phù hợp giữa TDF

và caryotype

Caryotype Kết quả DYZ

TDF (+); 46,XX Âm tính

TDF (-); 46,XY/46,Xr(X) Âm tính

Nhận xét: cả hai trường hợp đếu có DYZ âm

tính, chứng tỏ không có mặt NST Y

IV Bàn luận:

Trong tổng số 40 bệnh nhân nghiên cứu sau

khi đối chiếu giữa TDF và NST Y thì chúng tôi thấy

có 95% phù hợp đã được bàn luận trong nghiên

cứu trước của chúng tôi [9] còn 5% không phù hợp

đó là: trường hợp thứ nhất có gen TDF nhưng nuôi

cấy NST là 46,XX và trường hợp thứ hai là không

có gen TDF nhưng khi nuôi cấy NST là 46,XY/46,

Xr(X) (nhiễm sắc thể X hình nhẫn do mất đoạn

nhánh ngắn và nhánh dài) Khi tiến hành kiểm tra

PCR với SY160 để tìm gen DYZ số bệnh nhân (38

bệnh nhân) có sự phù hợp TDF và nuôi cấy NST

thì có kêt quả phù hợp với DYZ, nghĩa là, DYZ

dương tính thì caryotype có NST Y và DYZ âm tính

thì caryotype không có Y Hai trường hợp còn lại

thì đều có DYZ (-) chứng tỏ không có mặt NST Y

- Theo Cook và cs [2] 1976 đã thấy khoảng 50-70% vùng không bổ cứu trên NST

Y bao gồm các đoạn ADN lặp đi lặp lại và chỉ xuất hiện trên NST Y, hoàn toàn đặc hiệu cho NST Y, nó khư trú trên nhánh dài NST Y

ở vùng heterochromatin Người ta gọi nó là gen DYZ1 và DYZ2 DYZ là chỉ sự nhắc lại trên NST Y, số 1 và 2 để chỉ trình tự phát hiện ra DYZ 1 có kích thước 3,4kb với 5 nucleotit được lặp lại TTCCA (khoảng 3000 bản lặp lại) còn DYZ 2 thì có 2000 bản lặp lại Do vậy người ta lợi dụng tính chất này để xác định NST Y bằng kỹ thuật PCR khi khó xác định nó bằng phương pháp nuôi cấy NST, hay khi gen TDF không nằm trên NST

Y Các tác giả nước ngoài đã sử dụng kỹ thuật này trong chẩn đoán giới như Kaoru Suzumori và cộng sự 1992 [3] đã áp dụng trong việc chẩn đoán giới tính thai nhi từ máu

mẹ, ngoài ra còn được Tanoue A và cộng sự năm 1992 [6] áp dụng để nghiên cứu trên đối tượng 46,XX nam và 46,XX ái nam ái nữ thật (có mặt đồng thời cả tinh hoàn và buồng trứng) đã phát hiện ra TDF (+),và DYZ (-)

- Từ bảng 4 cho thấy một bệnh nhân là 46,XX có gen TDF (+) chiếm 2,5% số trường hợp ở bệnh nhân này gen TDF nằm hoàn toàn trên NST X vì kết quả DYZ (-) Do đó phù hợp về lâm sàng bệnh nhân này có ngoại hình nam hoàn toàn, có tinh hoàn, nhưng vào viện vì có tật lỗ đái thấp Kết quả nghiên cứu của chúng tôi phù hợp với một số nghiên cứu của các tác giả khác trong y văn [6] Bằng phương pháp lai tại chỗ (FISH) Abbas N et al 1993 [1] đã chứng minh nguyên nhân của các trường hợp này là do trên nhánh ngắn NST X(Xp22) của bệnh nhân có mang gen TDF và vùng giả NST thường (pseudo autosome region) NST X bệnh lý này là do cha truyền cho con, vì người ta đã tìm thấy ở cha bệnh nhân này có

2 gen TDF một trên NST Y và một gen trên NST X [1]

- Ngoài ra từ bảng 4 còn thấy 1 bệnh nhân khác chiếm 2,5% số trường hợp không

có sự phù hợp giữa kết quả PCR với nuôi

cấy NST: bộ NST đọc là 46,XY/46,Xr (X) có

mặt NST Y nhưng khi tiến hành PCR thì kết

quả cho thấy TDF (-); DYZ (-) tức là hoàn

toàn không có mặt NST Y và các gen trên

nó Trường hợp này khi đối chiếu với lâm

sàng của bệnh nhân thì phù hợp: bệnh nhân

có ngoại hình nữ hoàn toàn, có tử cung và

buồng trứng vào viện vì chiều cao chậm phát

triển có ngoại hình gần giống hội chứng

Turner Do đó sơ bộ chúng tôi khẳng định

rằng trong caryotype của bệnh nhân này

không có NST Y Nhận xét này của chúng tôi

phù hợp hoàn toàn với y văn, vì nếu

46,XY/46,Xr(X) mà TDF (-) nghĩa là có sự đột

biến 2 dòng tế bào trên cùng một hợp tử thì

rất hiếm gặp

V Kết luận

1 ở 38 bệnh nhân chưa rõ giới (chiếm 95

% tổng số) có kết quả phù hợp giữa PCR tìm

TDF và caryotype đã sử dụng làm nhóm

chứng cho chuẩn kỹ thuật PCR tìm gen DYZ

để xác định nhiễm sắc thể Y cho kết quả

chính xác 100% không có trường hợp nào âm

tính hay dương tính giả

2 Còn 2 bệnh nhân (chiếm 5 %) có kết

quả PCR tìm TDF và caryotype không phù

hợp đều không tìm thấy gen DYZ, do đó

khẳng định là không có mặt NST Y trong 2

trường hợp này

3 Phát hiện và khẳng định một trường

hợp TDF trên NST X đầu tiên ở Việt Nam

Tài liệu tham khảo

1 Abbas N.; McElreavey K.; Fellous M.;

et al (1993) Familial case of 46,XX male and

46,XX true hermaphrodite associated with

paternal -derived SRY -bearing X

chromosome C.R.Acad Sci III 1993;

316(4): 375-383

2 Cooke HJ.(1976) Repeated sequence specific to human males Nature

262:182-186

3 Kaoru Suzumori et al (1992) Fetal cell

in maternal circulation; detection of Y sequence by gene amplification Obstet.gynecol 1992;80:150-60

4 Pearson P et al (1972) The use of new staining techniques for human chromosome identification J.Med.Genet 9;

264 - 75

5 Polani P.E et al (1981) Abnormal sex development in man The mecanisme of the sex differentiation in animals and man (Austin C.R et Edwards R.G.; eds); 465 -

547 Academic Press London

6 Tanoue A., Nakamura T., Endo F et al (1992) Sex determining region Y (SRY) in a patient with 46 XX true hermaphroditism Jpn J Hum Genet DEC; 37 (4); 311 - 20

7 Tjio J.H et Levan A (1956) The chromosome number of man Hereditas; 42:

1 - 6

8 Nguyễn Thanh Thuý, Vũ Triệu An, Trần Thị Chính và cs (1997) Bước đầu hoàn chỉnh

kỹ thuật PCR và áp dụng trong việc xác định giới tính Tạp chí nghiên cứu Y học Đại học

Y Hà Nội Tập 4 Số 4: 33-35

9 Nguyễn Thanh Thuý, Vũ Triệu An,Văn

Đình Hoa, Nguyễn Thị Phượng, Vũ Chí Dũng (2002) áp dụng kỹ thuật PCR tìm gen TDF

và gen Amelogenin để xác định giới tính cho bệnh nhân chưa rõ giới tính và đối chiếu với kết quả nuôi cấy NST Tạp chí Nghiên cứu y học Đại học Y Hà Nội 18.số 2 6/2002 tr 3-6

Summary The application of the PCR technique to find the DYZ

gene for the Y chromosome determination

(We would like to thank Dr.McElreavey Ken for your help) The authors studied DNA samples with were extracted from the peripheral blood by the PCR technique with the primers TDF (to amplify the TDF gene on the short arm of the Y chromosome) and compared this PCR result with their karyotype:

95% accord with karyotype and except 5%: 46XX, TDF(+) and 46XY/Xr(X) TDF(-) The authors amplified the DYZ gene with primers SY160 to determine the Y chromosome in this 5% and the results showed that:

- DYZ(-) in both 2 cases

- TDF (+) on the X chromosome