Ứng dụng kỹ thuật giải trình tự chuỗi để xác định kiểu gen virus viêm gan B Những tiến bộ của kỹ thuật sinh học phân tử vào những năm cuối thế kỹ 20 đã giúp khám phá ra sự đa dạng trong trình tự chuỗi của vi rút viêm gan B, và từ đó một dấu ấn (marker) mới của HBV ra đời là HBV genotype. Tám kiểu gen của HBV đã được xác định (Từ A đến H) dựa vào sự khác nhau trên 8% của toàn bộ trình tự chuỗi của bộ gen HBV, và sự phân bố của các kiểu gen khác nhau ở các châu lục, các nước khác nhau. Tuy nhiên sự phân loại các HBV genotypes có thể chỉ cần dựa trên trình tự chuỗi (sequence) của một đoạn gen nào đó của HBV như trên một phần trình tự chuỗi của gen pre-S; S. Có nhiều phương pháp đã được nghiên cứu và dùng trong việc xác định HBV genotypes như giải trình tự chuỗi (sequencing), RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism), LiPA (Line Probe Assay), phản ứng miễn dịch men (Enzyme-linked Immunoassay). Mỗi phương pháp có những ưu và nhược điểm khác nhau, tuy nhiên phương pháp giải trình tự chuỗi có thể xem như có nhiều ưu điểm nổi bật vì bên cạnh việc xác định được trình tự chuỗi các Nucleotids trong bộ gen của HBV để từ đó so sánh với thư viện gen và xác định được HBV genotypes mà còn dựa vào kết quả giải trình tự này chúng ta có thể xác định được một số dạng đột biến kháng thuốc của HBV để từ đó có phát đồ điều trị tối ưu 1. Khái niệm về cấu trúc phân tử DNA DNA là một chuỗi xoắn kép, hai mạch đơn được nối với nhau bằng liên kết Hydro. Mối liên kết này có thể bị phá vỡ bởi nhiệt độ cao (Thường là trên 90oC, và ứng dụng thực tế là 940C), làm cho phân tử DNA biến thành 2 mạch đơn. Có 4 loại Nucleotid (Nu ) căn bản cấu tạo nên DNA: A(Adenine), T(Thymine), G(Guanine), C(Cytosine). Việc xác định được thứ tự các Nu gắn kết với nhau dọc theo chiều dài của bộ gen (DNA) gọi là việc giải trình tự chuỗi (Sequencing), và trình tự gắn kết nhau của các Nu gọi là trình tự chuỗi (Sequence). 2. Cấu tạo bộ gen HBV HBV có bộ gen là phân tử DNA, chiều dài khoảng 3200 bases. Hoạt động nhân đôi của HBV nhờ hoạt tính của men polymerase. Trên vùng gen P (Polymerase) được chia làm 4 vùng, mỗi vùng có một chức năng riêng: Terminal protein, Spacer, RT domains và RNAase H . Trong đó, vùng sao mã ngược (RT domains: Reverse Transcription) chịu trách nhiệm cho việc tổng hợp men RNA-dependent DNA và DNA-dependent DNA được chia ra thành 7 vùng đặt tên từ A – G. Vì vùng RT là đích tác động của thuốc Lamivudine nên những đột biến của vùng này trong quá trình phát triển tự nhiên của siêu vi B cũng như dưới tác động của thuốc điều trị sẽ dẫn tới vấn đề đột biến kháng thuốc. 3. Quy trình giải trình tự chuỗi: Thực hiện PCR: Để khuếch đại gene của HBV ta dùng kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction: Phản ứng trùng hợp chuỗi) . Mục đích của giai đoạn này là khuếch đại đoạn gen đặc hiệu cho HBV có ở trong máu bệnh nhân: Từ một phân tử ban đầu thành hàng tỷ bản sao DNA, từ đó mới thực hiện được giải trình tự chuỗi của HBV. Đây là giai đoạn quan trọng, quyết định cho sự thành công khi thực hiện giải trình tự chuỗi. Một chu kỳ của phản ứng PCR gồm có 3 giai đoạn: Giai đoạn biến tính: Nhiệt độ của ống mẫu sẽ được tăng lên đến 94o C, làm cho phân tử DNA biến tính tách ra làm đôi hoàn toàn, tất cả hoạt động của các men đều dừng lại, phân tử DNA duỗi thẳng ra hoàn toàn, từ đó dễ dàng cho việc bắt cặp và gắn các Nu vào mạch đơn đó theo nguyên tắc bổ sung. Giai đoạn bắt cặp: Các Primer (Các đoạn mồi) có gắn Biotin là các đoạn Nu ngắn (Khoảng 20-25 Nu) có sẵn trong ống mẫu sẽ bắt cặp vào các chuỗi đơn DNA sau khi biến tính theo nguyên tắc bổ sung. Sự bắt cặp này sẽ có 2 ý nghĩa đặc hiệu: Đặc hiệu theo nguyên tắc bổ sung với đoạn gen mà ta cần khuếch đại và đặc hiệu theo chiều dài của đoạn gen khuếch đại. Giai đoạn kéo dài: Sau khi primer bắt cặp đặc hiệu với các mạch đơn DNA, nhờ tác dụng của men Taq polymerase ở điều kiện thích hợp sẽ gắn các Nu có sẵn trong ống nghiệm vào các primer theo nguyên tắc bổ sung, từ đó làm cho đoạn mồi dài ra và hình thành nên một mạch đơn mới bổ sung với mạch đơn cũ. Và một bản sao DNA mới đã được hình thành. Như vậy, sau giai đoạn này ta có được hai phân tử DNA có cấu trúc giống hệt như phân tử DNA ban đầu. Như vậy, sau mỗi chu kỳ khuếch đại thì từ một phân tử DNA ban đầu sẽ thành 2 phân tử DNA giống hệt nhau, và sau 30 chu kỳ khuếch đại ( thời gian khoảng 2 – 3h ) sẽ có khoảng 230 phân tử DNA giống hệt nhau (Khoảng 1 tỷ DNA), lượng DNA này đủ để ta làm phản ứng cắt cho giải trình tự chuỗi. Sau khi đã thực hiện phản ứng PCR, ta điện di trên gel agarose 2%, mục đích chủ yếu của bước này là xem có sản phẩm của PCR không và đánh giá kích thước của sản phẩm khuếch đại có đúng là đoạn dài như ta đã biết (Có nghĩa là có bắt cặp của primer và chiều dài của amplicon đúng cho HBV). Thực hiện phản ứng cắt: Nguyên tắc của phản ứng này giống hệt phản ứng PCR. Tuy nhiên có một điểm khác căn bản là thành phần các Nu trong Clip buffer để khuếch đại ngoài A, T, G, C còn có thêm dd Nucleotides. Trong giai đoạn kéo dài của phản ứng cắt, lúc các Nu dưới tác động của men Polymerase gắn vào cặp mồi sẽ có sự gắn ngẫu nhiên của các dd Nucleotides, khi đó thì sự kéo dài sẽ lập tức ngừng lại ở vị trí đó (Là vị trí ta đã biết). Khi điện di trong gel có độ ly giải cao ta sẽ có các trình tự của Nu, dựa vào phần mềm của máy sẽ cho ra được trình tự chuỗi của DNA HBV. So sánh trên thư viện gen của máy tính se cho ta biết kiểu gen của vi rút này là kiểu gen nào và các đột biến đã được công bố của HBV (Bao gồm các đột biến kháng thuốc). 4. Các đột biến của virus B Nhiều kiểu đột biến của HBV đã được nhận diện. Đa số các đột biến này là thầm lặng hoặc không có một ý nghĩa lâm sàng nào, tuy nhiên có một số đột biến có ý nghĩa trong quá trình diễn tiến của bệnh Đột biến trên gen S: Một số đột biến trên gen S có ý nghĩa là đột biến “thoát”, ví dụ như đột biến G145A, làm cho việc tiêm ngừa không có hiệu quả và bệnh nhân vẫn nhiễm bệnh. Đột biến vùng trước lõi (Pre-core) và Core promoter: Đột biến hay gặp là đột biến Pre core (G1896A), từ đó không tạo ra HBeAg cho nên dù tình trạng vi rút đang tăng sinh nhưng HBeAg (-) và chỉ có thể đánh giá tình trạng vi rút tăng sinh qua xét nghiệm tìm HBVDNA. Đột biến vùng DNA Polymerase: Đột biến vùng này càng ngày càng được quan tâm, vì là đích tác động của thuốc Lamivudine Đột biến kháng Lamivudine hay được gọi dưới tên là YMDD. Khi kết quả có đột biến thì người BS sẽ biết bệnh nhân này có kháng với thuốc nào và cần phải thay đổi chế độ thuốc cho bệnh nhân ra sao để từ đó đạt kết quả điều trị được tốt nhất. Đột biến trên gen X (HBX): những kết quả nghiên cứu bước đầu cho thấy các đột biến này có liên quan đến ung thư tế bào gan. Nhờ các kỹ thuật sinh học phân tử mà cho đến nay người bác sĩ có thể đánh giá và biết chi tiết, toàn diện vi rút viêm gan B ở mỗi người bệnh nhân để từ đó có một phác đồ điều trị tối ưu. Tuy nhiên, cuộc chiến chống lại vi rút viêm gan B vẫn chưa có hồi kết, HBV cũng như mọi vi rút nói chung luôn luôn biến đổi cấu trúc di truyền của nó để tránh được tác động của các thuốc đặc trị. . Ứng dụng kỹ thuật giải trình tự chuỗi để xác định kiểu gen virus viêm gan B Những tiến b của kỹ thuật sinh học phân tử vào những năm cuối thế kỹ 20 đã giúp khám phá. nổi b t vì b n cạnh việc xác định được trình tự chuỗi các Nucleotids trong b gen của HBV để từ đó so sánh với thư viện gen và xác định được HBV genotypes mà còn dựa vào kết quả giải trình tự. cho ta biết kiểu gen của vi rút này là kiểu gen nào và các đột biến đã được công b của HBV (Bao gồm các đột biến kháng thuốc). 4. Các đột biến của virus B Nhiều kiểu đột biến của HBV đã được