Xác định kiểu gen virus viêm gan C trong huyết thanh bệnh nhân viêm gan C bằng kỹ thuật sinh học phân tử RT-PCR

Phương Thị166 Hà Header Page of Luận văn Thạc sĩ khoa học ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh viêm gan virut C có ảnh hưởng lớn đến tình trạng sức khỏe người toàn giới , sau bị nhiễm virus viêm gan C cấp tính có khoảng 70-90% bệnh nhân chuyển từ giai đoạn cấp tính sang giai đoạn mạn tính có tới 20-25% số bệnh nhân chuyển qua giai đoạn xơ gan ung thư gan [17,33,36] Theo tổ chức y tế giới có khoảng 170 triệu người nhiễm virut viêm gan C (HCV), tương ứng với khoảng 2-3% tổng dân số toàn giới [14,26].Theo ghi nhận tình hình nhiễm virut viêm gan C Việt Nam tỉ lệ người bình thường bị nhiễm bệnh khoảng 6% [42], xem thuộc nhóm quốc gia có tỉ lệ nhiễm viêm gan C cao giới [13,42] HCV virut có gen ARN, chu kỳ nhân đôi virut phải sử dụng men ARN polymerase, mà men khả sửa sai trình tổng hợp ARN, từ làm cho gen virus đa dạng nên người ta phân virus thành nhiều loại (type) khác nhau[7,50] đường lây nhiễm chủ yếu HCV qua đường máu Sau xác định người dương tính với anti-HCV, Bác sĩ trước cho đinh điều trị phải làm xét nghiệm hai yếu tố quan trọng có vai trò tiên lượng cho thành công thời gian điều trị cần thiết định lượng số lượng siêu vi máu (HCV-ARN) định kiểu gen siêu vi gây viêm gan C (HCV Genotypes) [1,37] Kiểu gen HCV phân bố khác tùy theo vùng địa lý, châu lục hay nước có kiểu gen trội riêng [41,43] Hiện giới biết loại genotypes khoảng 50 subtype (dưới type)[3,7], Việt Nam phổ biến genotypes 1,2, 6, kiểu genotype gặp [1,50] Để xác định genotypes HCV ngày với phát triển công nghệ sinh học, đặc biệt chuyên ngành công nghệ sinh học phân tử phát minh nhiều kỹ thuật để xác định kiểu gen HCV Trên giới có nhiều công ty: Bayer, Beckman Coulter, QIAgen, Roche… cho đời kit xác định genotypes HCV với độ xác cao Tuy nhiên, giá thành kit cao nên chưa áp dụng rộng rãi Ở Việt Nam phổ biến hai kỹ thuật xác định genotypes Footer Page of 166 Phương Thị166 Hà Header Page of Luận văn Thạc sĩ khoa học HCV: Real-time PCR (RT-PCR) kỹ thuật giải trình tự gen (sequencing) Kỹ thuật Sequencing chuẩn đoán có nhiều tính ưu việt việc xác định kiểu gen xác cao, tránh nhầm lẫn type subtype phương pháp cần có máy móc trang thiết bị đại điều kiện kỹ thuật cao nên gía thành cao chủ yếu thực trung tâm nghiên cứu Kỹ thuật RT-PCR tiến hành tất phòng thí nghiệm PCR dễ thực không đòi hỏi máy móc trang thiết bị kỹ thuật cao, giá thành rẻ phù hợp với điều kiện kinh tế đa số người dân Việt Nam,tuy nhiên không xác định đến subtype có nhầm lẫn type1 type6 Với mục đích khuyến cáo bệnh nhân lựa chọn phương pháp xác định genotype, chọn đề tài: “Xác định kiểu gen virus viêm gan C huyết bệnh nhân viêm gan C kỹ thuật sinh học phân tử RT-PCR”, với mục tiêu sau : 1) Xác định tỉ lệ người mang kiểu gen HCV phương pháp RT-PCR sử dụng Taqman probe 2) Xác định lại kiểu gen Type phương pháp giải trình tự gen (Sequencing) đoạn gen NS5B Footer Page of 166 Phương Thị166 Hà Header Page of Luận văn Thạc sĩ khoa học Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đặc điểm sinh học virut viêm gan C (HCV) 1.1.1 Lịch sử nghiên cứu phân loại Vào năm 1970, Harvey J.Alter Trưởng khoa nhiễm trùng phận truyền máu Viện Quốc gia Sức khỏe Hoa Kỳ chứng minh nhiễm virut sau truyền máu phần lớn virut viêm gan A B đặt tên virut không A-không B.Mười bảy năm sau (năm 1987) Michael Houghton, Qui-lim Choo tập đoàn, Gorge K dung sinh học phân tử định clon để định tính virus không A không B , năm 1989 xác định virut không A không B có tên thức virut viêm gan C công bố báo Science[7] Virus viêm gan C ( Hepatitis C virus - HCV) thuộc nhóm IV (+ssARN) virus ARN Họ Flaviridae, họ với virus Dengue, Flavivirus West Nile, virus tiêu chảy bò ( Bovine viral diarrhea - BVDV) Thuộc loài Hepacivirus[4,8,9] Virut Viêm gan C xem nguyên nhân phổ biến gây bệnh viêm gan mạn tính, xơ gan ung thư gan nguyên phát [6,12] 1.1.2 Hình thái cấu trúc virut viêm gan C Virut viêm gan C loại virut hướng gan kính hiển vi điện tử người phát HCV có hình cầu, hình đa diện hình que kích thước nhỏ (Hình 1.1) Hình 1.1 Hình thái HCV kính hiển vi điện tử Footer Page of 166 Phương Thị166 Hà Header Page of Luận văn Thạc sĩ khoa học Về cấu trúc virut viêm gan C bao gồm lõi ARN, nhân core, gai glycoprotein màng vỏ (Hình 1.2) Màng vỏ glycoprotein Core Màng vỏ ARN virus Kích thước khoảng 60nm Hình 1.2 Cấu trúc virut viêm gan C 1.1.3 Genome HCV Genome HCV có lõi chứa vật liệu di truyền sợi ARN có tính phân cực dương, bao quanh màng protein có chức bảo vệ tạo hình đa diện gói lại màng lipid từ nguồn tế bào gan, kích thước chuỗi đơn ARN (+) 9,6 kb Giống chuỗi ARN dương loại virut khác, tổ chức genome virut viêm gan C mang vai trò ARN thông tin (mARN) truyền đạt thông tin di truyền cho protein virut [17,40,47] Tổ chức Genome HCV chia làm hai vùng Vùng cấu trúc mã hóa cho protein cấu trúc gồm: - Gen C mã hóa cho protein nuclecapsit p22 làm nhiệm vụ gắn với ARN để tạo nuclecapsit - Gen E1 mã hóa cho glycoprotein vỏ p33 - Gen E2 mã hóa cho protein vỏ gp 70 Vùng không cấu trúc mã hóa cho protein không cấu trúc bao gồm: Footer Page of 166 Phương Thị166 Hà Header Page of Luận văn Thạc sĩ khoa học - Gen NS2 mã hóa cho protein gắn vào màng (p23) - Gen NS3 mã hóa cho proteaza helicaza (p72) - Gen NS4 chia thành NS4A mã hóa cho protein p10 NS4B mã hóa cho protein p27 - Gen NS5 chia thành NS5a mã hóa cho replicaza NS5b mã hóa cho ARN-Polymeraza phụ thuộc ARN cần cho trình chép Phân tử ARN dạng mạch thẳng có chứa đơn khung mở (ORF- open reading frame), mã hóa cho tiền chuỗi protein với chiều dài khoảng 3000 gốc amino axit (Hình 1.3) Trong trình virrut chép chuỗi protein kích hoạt enzyme virut giống tế bào chủ ba protein cấu trúc (gồm nhân lõi-core, E1,E2) bảy protein không cấu trúc (bao gồm: p7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B)[31] Một protein khác (kí hiệu F-Temed) ARF (khung đọc thay thế) dự đoán kết khung đọc thay riboxome trình chép với vùng nhân hệ gen ARN[39,43,46] Cấu trúc Không cấu trúc Tổng hợp chuỗi polyprotein Protein Core Glycoprotein vỏ Protease Proteaza helicaza Replica ARN-polymerase Hình 1.3: Tổ chức genome HCV Footer Page of 166 Phương Thị166 Hà Header Page of Luận văn Thạc sĩ khoa học Các gen cấu trúc mã hóa cho lõi protein virut protein vỏ virut E1,E2 đặt phần đuôi 5’ khung đọc mở theo chiều ngược vùng mã hóa cho protein phi cấu trúc p7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B (Hình 1.3) Các protein cấu trúc hợp phần quan trọng virut viêm gan C, protein phi cấu trúc gắn kết với virut xong lại nằm trình chép ARN morphogenesis virut [50] ORF (Open reading frame) cố định vùng không bị mã hóa vùng 5’ vùng 3’ (NCRs- Noncoding regions) bao gồm chuỗi nucleotit có liên quan đến điều chỉnh trình chép virut Tất NCR có chứa vùng miền bảo tồn cao so với vùng protein mã hóa genome HCV Mức độ chuyển hóa cao NCRs làm cho chúng thành mục tiêu nghiên cứu: + Nâng cao chất lượng việc chẩn đoán phân tử + Nghiên cứu cho việc điều trị kháng virut + Nghiên cứu kháng sinh chống HCV Phần 5’ NCR có khoảng 341 nucleotit có cấu trúc phức thứ hai với bốn vùng khác (I-IV) [30], 125 nucleotit 5’ NCR phân ba vùng I II phần trình chép ARN virut [ 21,52] Các vùng (II-IV) thiết lập tâm đầu vào ribosome bên (IRES) bao gồm ribosome liên kết độc lập khởi động cho trình chép tương ứng[7,52] Chuỗi 3’ NCR có chứa ba vùng chức khác nhau: vùng thay đổi, chuỗi U/UC có chiều dài thay đổi đuôi X chuyển đổi mức độ cao đuôi 3’ hệ gen HCV, vùng thay đổi có chứa khoảng 40 nucleotit không quan trọng trình chép ARN Tuy nhiên bỏ chuỗi dẫn đến việc giảm sút đáng kể hiệu trình chép[21] Chiều dài chuỗi vùng U/UC thay đổi theo chuỗi HCV khác nằm khoảng từ Footer Page of 166 Phương Thị166 Hà Header Page of Luận văn Thạc sĩ khoa học 30- 80 nucleotit [35] Chiều dài nhỏ vùng trình chép ARN cho có chứa 26 nucleotit homouridine môi trường tế bào [22,49] Đuôi X với mức chuyển hóa cao có khoảng 98 nucleotit có chứa ba stem-loops (SL1-SL3) [23] trình tiêu hủy thay nucleotit vùng thường không gây tử vong [23] Một cách gọi tên khác trình tương tác đuôi 3’ X SL2 “ kissing-loop” phần phức hợp vùng mã hóa NS5B mô tả [23,35] Sự tương tác bao gồm cấu trúc ARN tertiary genome HCV, phần quan trọng trình chép HCV hệ thống môi trường tế bào [23,49] Cuối NCRs xuất để làm việc với tương tác ARN-ARN theo chiều dài hình thành vòng tuần hoàn gen tạm thời [46] 1.1.4 Gen Protein Như mô tả phần trên, trình chuyển hóa chuỗi protein HCV khởi động thông qua tương tác số phần NCRs hệ genome HCV ARN Chuỗi protein sản phẩm có chứa 10 protein đồng thời chuyển hóa chuyển hóa bước đầu kích hoạt từ chuỗi protein Các protein đuôi N C, E1, E2 p7 kích hoạt tín hiệu peptit tế bào (SP)[15,20] Lõi tiền protein tạo có chứa tần số tín hiệu E1 đuôi C Tiếp theo kích hoạt tần số tín hiệu tín hiệu peptit peptidase (SPP) dẫn đến việc hình thành lõi protein hoàn chỉnh [15,20] Các protein phi cấu trúc NS2 đến NS5B chuỗi protein HCV kích hoạt hai protease có virut mã hóa ( NS2-NS3 NS3) với protease NS2-NS3 cysteine kích hoạt chỗ ghép nối NS2-NS3 protease NS3 serine kích hoạt protein trì chức [17,51] Các vị trí nucleotit virut gốc amino axit theo HCV chuỗi H77 kiểu gen 1a, tiếp nhận theo số NC_004102 Một số thông số đặc trưng cho protein HCV tập hợp bảng Footer Page of 166 Phương Thị166 Hà Header Page of Luận văn Thạc sĩ khoa học Bảng 1.1: Tổng quan kích thước protein HCV Protein Số aa Vị trí aa chuỗi Trọng lượng protein Core: protein core HCV có độ pH kiềm cao protein gắn ARN tạo nucleocapsid HCV Protein core báo cáo tương tác với nhiều loại protein tế bào tác động đến chức nhiều protein tế bào chức tế bào túc chủ gen dịch mã, chuyển hóa lipid, chết theo chương trình nhiều tín hiệu dẫn đường Ngoài protein core mồi dẫn gan hóa mỡ ung thư gan ( UTG)[51,52] E1 E2: protein type I xuyên màng có đoạn cuối C nước làm neo Được chuyển vị đến ruột ergoplasme glycosyl hóa Do kết nối mạnh với N liên kết glycosyl hóa E1,E2 tạo thành non-covalent heterodimer cho tạo thành vỏ HCV Quá trình đóng gói phần tử HCV trồi chưa hiểu thấu đáo nên cần nghiên cứu có hệ thống vấn đề này[15,20,48] F-Protein, ARFP: Tổng hợp protein khung đọc mở thay nội gen core Được đặt tên khung protein đọc mở thay ( ARFP ) khung F ( F frame shift ) có 160 amino acid ARFP hay F cần thiết cho ARN-HCV tăng sinh Được thể diễn biến tự nhiên nhiễm HCV cần làm sáng tỏ [7,46] Protein P7: P7 polypeptide có 60 amino acid, nằm vị trí giao gen cấu trúc gen không cấu trúc Chưa biết chắn P7 có đóng gói Footer Page of 166 Phương Thị166 Hà Header Page of Luận văn Thạc sĩ khoa học không với phần tử khác HCV, P7 gồm vùng để tạo thành hexamer kênh cho ion hoạt động, cho P7 có vai trò quan trọng đóng gói protein virus gây tiêu chảy Bò ( BVDV- bonine diarrhea virus) chứng minh cần thiết để sản sinh virus-progeny tăng sinh ARN virus [28] Protein tự tiêu NS2-3 ( autoprotease): kết nối NS2/3 bị tách autoprotease để có NS2 đoạn cuối N thứ ba NS3 Mặc dù hoạt tính protease NS2-3 cho genome HCV tăng sinh chu kỳ sinh trưởng nội bào in vitro cho subgenomic replicon cần để biết NS2 có chức khác sau tách rời NS3[7,48,51] Protein NS3-4A-NS3: protein đa chức có chứa serin protease phần ba đoạn N-cuối chịu trách nhiệm dòng xuôi tách biệt vùng không cấu trúc NTPase/ARN vùng helicase hai phần ba C tận NS4A :là 154 polyamino acid tác động đến NS3 tế bào nội màng cần đồng yếu tố cho NS3 serin protease Cấu trúc tinh thể phức hợp cho thấy NS3-4A thành phần tích hợp enzyme nhân Đáng ngạc nhiên NS3 seri protease có ảnh hưởng tới đề kháng miễn dịch tế bào tự nhiên túc chủ ức chế tín hiệu RIG-1 TLR Nhận xét hấp dẫn NS3 hướng cho thuốc chống HCV Chất ức chế serin protease lên thành phần có hiệu trở thành nguyên lý hàng đầu để nghiên cứu điều trị bệnh nhân HCV mạn tính Tác dụng men hoạt tính NS3NTP-ase /helicase cần thiết cho ARN-HCV tăng sinh Đích chức trình sinh trưởng không xoắn vòng tăng sinh, ARN trung gian làm loại trừ ARN cấu trúc thứ phát tách rời genome với protein gắn kết Những tiến hiểu biết chế phân tử enzyme chiến lược mơi thuốc ức chế HCV NS4B : Do tính chất nước nên NS4B thành phần HCV khó nghiên cứu hiểu biết chưa nhiều, biết NS4B với 27-kDa thành phần Footer Page of 166 Phương Header Page 10Thị ofHà 166 Luận văn Thạc sĩ khoa học tích hợp với protein màng khu trú ergoplasme xuất xứ từ thành phần riêng lẻ màng Đáng ý biểu NS4B mồi dẫn tổn thương màng đặc hiệu đặt tên web-màng tác dụng giàn giáo để tạo thành cấu tạo phức hợp tăng sinh HCV NS5A :là kẽm phosphoryl hóa protein kim loại chức chưa biết, có nhiều tài liệu nói chức có NS5A danh mục khổng lồ tương tác với yếu tố khác NS5A nên chức phận NS5A lại không rõ ràng Khởi đầu hấp dẫn NS5A có tiềm điều hòa đáp ứng interferon, kết nghiên cứu trái ngược Một nhận xét bật replicon thích ứng nuôi cấy tế bào thấy độ tập trung đột biến cao phần trung tâm NS5A, tượng NS5A có tác động hiệu điều hòa tăng sinh HCV Yếu tố liên kết màng NS5A làm trung gian amphipathic alpha helix khu trú N-đoạn cuối, thực nghiệm tiêu hủy protein cho phép định nghĩa ba vùng protein domain cytosolic Gần cấu trúc ba chiều đoạn N- cuối domain giải chụp hình Sau dimer hóa cấu trúc tạo basic groove đối diện với cytosol bề mặt màng tế bào Cấu trúc kiểu claw like cho cung cấp chỗ cho ARN gắn kết tham dự vào việc điều hòa đích genome phức hợp sinh trưởng HCV [7,48,51] NS5B: Chìa khóa replicase khởi hoạt tổng hợp genome ARN NS5B ARN- phụ thuộc ARN polymerase (RdRp) NS5B kích thước đo theo mấu protein neo màng (tail-anchored protein) có đặc trưng domain xuyên màng C- đoạn cuối protein chịu trách nhiệm tác động hậu dịch mã màng Cấu trúc NS5B điển hình cấu tạo polymerase dáng hình bàn tay phải với vùng ngón tay, mu bàn tay, ngón tay bao bọc thành vòng tròn nơi có hoạt tính cao Quá trình tăng sinh thông qua tổng hợp vòng ARN bổ sung mang dấu (-) sử dụng genome khuôn mẫu hậu tổng hợp ARN (+) từ ARN(-) Footer Page 10 of 166 10 Phương Header Page 41Thị ofHà 166 Luận văn Thạc sĩ khoa học Qua bảng 3.5 hình 3.4 ta thấy phân bố tỉ lệ kiểu gen hai giới nhau, type cao sau type thấp type 3.2.4 Sự phân bố kiểu gen theo nhóm tuổi Độ tuổi tổng số 228 bệnh nhân nghiên cứu thấp 21 tuổi, cao 75 tuổi Bảng 3.6 Phân bố kiểu gen theo nhóm tuổi Độ tuổi Không Type1 Type2 Type6 xác định Tổng số Tỉ lệ 21-29 14 11 26 11.4% 30-39 59 30 89 39.06% 40-49 37 14 53 23.24% 50-59 26 13 43 18.85% 60-69 12 14 6.14% >70 0 1.31% Theo bảng 3.6 ta thấy phân bố kiểu gen nhóm độ tuổi có chênh lệch đó: + Nhóm tuổi từ 30-39 chiếm tỉ lệ nhiều 39.06% + Nhóm tuổi từ 40-49 tuổi chiếm tỉ lệ cao thứ hai 23.24% Footer Page 41 of 166 41 Phương Header Page 42Thị ofHà 166 Luận văn Thạc sĩ khoa học + Nhóm tuổi từ 50-59 tuổi chiếm tỉ lệ cao thứ ba 18.85% + Nhóm tuổi từ 20-29 tuổi chiếm tỉ lệ 11.4% + Nhóm tuổi từ 60-69 tuổi chiếm tỉ lệ 6.14% + Nhóm tuổi >70 tuổi chiếm tỉ lệ 1,97% Sự phân bố kiểu gen theo nhóm tuổi thể hình 3.3 Tỉ lệ % Tỉ lệ % theo nhóm tuổi 45 39.06 40 35 30 23.24 25 18.85 20 15 11.4 10 6.14 1.31 21-29 30-39 40-49 50-59 60-69 >70 Nhóm tuổi Hình 3.5 Sự lưu hành kiểu gen nhóm tuổi Trong nhóm tuổi từ 21 đến 59 lưu hành virut có tỉ lệ cao, mà nhóm tuổi nằm độ tuổi lao động xã hội, ảnh hưởng đến kinh tế gia đình nói riêng xã hội nói chung lớn Footer Page 42 of 166 42 Phương Header Page 43Thị ofHà 166 Luận văn Thạc sĩ khoa học 3.3 Xác định lại kiểu gen Type phương pháp giải tình tự gen (Sequencing) đoạn NS5B Đối với hệ mồi mẫu dò vùng 5’NC HCV thiết kế thí nghiệm sử dụng RNA chứng dương HCV genotype đưa vào hỗn hợp cho phản ứng revers transcription RT- PCR chứa probe đặc trưng cho HCV genotype 1,2,3 Việc bố trí thí nghiệm tiến hành tương tự cho genotype lại Kết có hỗn hợp chứa mẫu dò Probe đặc trưng cho HCV genotype cho tín hiệu dương tính Kết tương tự cho genotype lại (Hình 3.6) HCV genotype HCV genotype HCV genotype2 HCV genotype Chứng âm Hình 3.6 Kết khảo sát khả khuếch đại mồi mẫu dò vùng 5’NC HCV Hình 3.6 cho thấy phản ứng có kiểu gen tương ứng với mẫu dò đặc trưng tín hiệu huỳnh quang vượt tín hiệu nền, mẫu chứng âm (được thiết kế với thành phần tương tự cho phản ứng real-time PCR real-time RT PCR) có tín hiệu huỳnh quang thấp tín hiệu Tuy nhiên 228 bệnh phẩm xác định genotype HCV có 59 trường hợp kết cho hai tín hiệu dương tính đặc trưng cho HCV genotype (Hình 3.7) Footer Page 43 of 166 43 Phương Header Page 44Thị ofHà 166 Luận văn Thạc sĩ khoa học Tín hiệu mẫu dò type Tín hiệu mẫu dò type Tín hiệu mẫu dò type Tín hiệu mẫu dò type Hình 3.7 Tín hiệu dương tính genotype Vậy tín hiệu mẫu dò type type có tương đồng cao.Theo số nhà nghiên cứu giới [18] chứng minh định genotype HCV vùng NS5B phân biệt subtype tốt dựa vùng 5’NC, phân biệt type với subtype 1b Trong số 151 mẫu bệnh nhân xác định genotype l ta l ngẫu nhiên 30 trường hợp đem giải trình tự gen đoạn NS5b kết bảng sau: Bảng 3.7 Kết giải trình tự gen đoạn NS5b HCV Kiểu gen Số mẫu Type Type 1a Type 1b Tổng 16 Tỉ lệ % 53.33 Footer Page 44 of 166 Type 6k Type Type 6e Type 6f 11 36.67 44 Type 6h Không xác định 3 10.0 Phương Header Page 45Thị ofHà 166 Luận văn Thạc sĩ khoa học Trong 30 mẫu giải trình tự gen có 16 mẫu huyết type 11 mẫu huyết xác định type có mẫu không giải trình tự gen, không xác định type mà giải trình tự gen xác định đến subtype Như có 11 mẫu huyết định type phương pháp RT- PCR dùng taqman probe gắn huỳnh quang FAM phát genotype HCV cho tín hiệu dương tính với genotype phương pháp giải trình tự gen cho kết type 6, có mẫu type 6k, mẫu type 6e, mẫu type 6f mẫu type 6h (Bảng 3.7 ) Kết định type kỹ thuật RT- PCR cho tín hiệu dương tính với genotype1 ta đem giải trình tự kết hình dưới,kết giải trình tự gen type 6h (Hình 3.8) 78 HCV GAGGTACTTGCCACATATTGCGGCTTTCCCTCCTTGGGCGATAAGTTTGGCCCTGACCGCTCGGGCTC GGTGTCTCCAAGCTCTCAAGGGAGGAGCCCCAAGTTTTCTGAGGCATGATGCCACCCGATTGAGTTCGCCG GGAGAGTACCCATGGAGTGAGAATGCGGCCATGCCGTGGAGTCTTTGAATGATCACTGGGAGATCAAGCG GAGTGATTGAATATGTGACTCCGTAGATATCGAAGTCAAGTGCCCTGTCCAAAGTCTCCTGTGCCTGGAGT ATTTGAAAGAAATGGGTCATGAGTACCATACGCACCCAAATGGTGGGGGCATACATAATGATGTTCCCTAA CCATGAATTCACAGGAGTGTGGCGAGCGGTCTCCCAGGCCGCCCTCGCCAGTGGAGTGACAGGGTCACGA GTGAGGTAGTAATATCTTCTGCCGTCTCCATCGTGGGCCACGGAAACATTGGATGAGCATGATGTTA Hình 3.8 Kết giải trình tự gen đoạn NS5b Trong mẫu không giải trình tự gen có mẫu có ARN-HCV thấp 1,1x102 4,2x102 có mẫu 5,8x103 Như giải trình tự gen có xác Footer Page 45 of 166 45 Phương Header Page 46Thị ofHà 166 Luận văn Thạc sĩ khoa học định kết xác đến subtype tránh nhầm lẫn type type định lượng ARN-HCV có số copies< 103 ta không định type, điều nhà sản xuất kit hóa chất khuyến cáo Ta thấy tỉ lệ nhầm lẫn type type 30 mẫu định type phương pháp Real-time PCR với phương pháp giải trình tự gen 11/27 mẫu 40,74% Như định type phương pháp Real-time PCR xét mặt kinh tế phù hợp với đa số điều kiện bệnh nhân, nhiên không xác định subtype tỉ lệ nhầm lẫn type type 40,74% ảnh hưởng đến kết điều trị bệnh nhân,do genotype HCV có khác độc lực, khả gây bệnh khả đáp ứng điều trị genotype thường đáp ứng thấp với genotype khác (Genotype thường điều trị vòng 48 tuần genotype khác điều trị 24 tuần) Do bệnh nhân xác định type phương pháp RT- PCR có kết định lượng >103copies/ml nên kiểm tra lại phương pháp giải trình tự gen Footer Page 46 of 166 46 Phương Header Page 47Thị ofHà 166 Luận văn Thạc sĩ khoa học KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Qua kết nghiên cứu định genotype HCV kỹ thuật sinh học phân tử Real-time PCR cho tỉ lệ genotype cao chiếm 66,23%, tiếp type chiếm tỉ lệ 30,7%, type có tỉ lệ thấp 2,19%, type 228 trường hợp nghiên cứu Lấy ngẫu nhiên 30 mẫu xác định genotype kỹ thuật Real-time PCR giải trình tự gen có 16 mẫu huyết type 1trong có mẫu type 1a mẫu type 1b , có 11 mẫu huyết xác định type mẫu type 6k, mẫu type 6e, mẫu type 6f mẫu type 6h Ta thấy tỉ lệ nhầm lẫn type type 30 mẫu định type phương pháp Realtime PCR với phương pháp giải trình tự gen 40,74%, nhiên nồng độ virut thấp không làm giải trình tự gen KIẾN NGHỊ: Vẫn dùng kỹ thuật Real-time PCR để định type nồng độ virut thấp Khi xác định type phương pháp Real-time PCR có kết định lượng >103copies/ml nên kiểm tra lại phương pháp giải trình tự gen (Sequencing) Footer Page 47 of 166 47 Phương Header Page 48Thị ofHà 166 Luận văn Thạc sĩ khoa học TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng viêt: Nguyễn Thanh Bảo, Phạm Hùng Vân (2008), “ Áp dụng kỹ thuật giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR thu nhận từ thử nghiệm RT Real-time PCR vùng 5’-NC để làm xét nghiệm định kiểu gen HCV”, Y học TP Hồ Chí Minh, 13(1), pp.243-248 Hồ Huỳnh Thùy Dương (2008), Sinh học phân tử, NXB Giáo dục, TP Hồ Chí Minh Lê Thanh Hòa, Lê Thanh Hà, Hoàng Quang (2007), “ Định typ (genotyping), virus viêm gan C (HCV) sử dụng thị 5’ UTR bệnh nhân viêm gan virus Hà Nội”, Tạp chí y học Việt Nam, 7, pp.29-36 Học viện quân y (2008), Bệnh học truyền nhiễm nhiệt đới, NXB y học Hà Nội Võ Thị Thương Lan (2008), Sinh học phân tử, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội, Hà Nội Hà Văn Mạo (2006), Ung thư gan nguyên phát, NXB y học, Hà Nội Phạm Song (2009), Viêm gan virut B,D,C,A,E,GE bản, đại cập nhật, NXB Y học, Hà Nội Trường Đại học Y Hà Nội (2006), Bài giảng vi sinh vật y học, NXB y học, Hà Nội Phạm Văn Ty (2005),Virut học, NXB giáo dục, Hà Nội 10 Phạm Hùng Vân (2009), PCR Real-time PCR vấn đề áp dụng thường gặp, NXB y học, TP Hồ Chí Minh Tài liệu tiếng Anh 11 Akazawa D., Date T., Morikawa K., Murayama A., Miyamoto M., Kaga M., Barth H., Baumert T.F., Dubuisson J., Wakita T (2007), “ CD81 expression is important the permissiveness of huh7 cell clones for heterogeneous hepatitis C virus infection”, Journal of Virology, 81, pp.5036-5045 Footer Page 48 of 166 48 Phương Header Page 49Thị ofHà 166 Luận văn Thạc sĩ khoa học 12.Alfonso V., Mbayed V.A., Sookozian S., Campos R.H (2005), “Intra-host evolutionary dynamies of hepatitis C virus E2 in treated patients”, Journal of General Virology, 86, pp.2781-2786 13.Alter M.J (2007), “Epidemiology of hepatitis C virus infection”, World J Gastroenterol, 13(17), pp.2436-2441 14 Batey R.G (2007), “ Controversies in and challenges to our understanding of hepatitis C”, World Journaly Gastroenterology,13(31), pp.4168-4176 15 Barth H., Schafer C., Adah M.I., Zhang F., Linhardt R.J., Toyoda H., Toyoda A.K., Toida T., Kuppevelt T.H., Depla E., Weisackev F.V., Blum H.E., Bacmert T.F (2003), “ Cellular Binding of hepatitis C virus envelope glycoprotein E2 requires cell surface heparin sulfate”, The Journal of Biologycal chemistry, 278 (42), pp 41003-41012 16 Blanchard E., Blouzard S., Goueslain L., Wakita T., Dubuisson J., Wychowski C., Rouille Y (2006), “ Hepatitis C virus entry depends on clathrin-mediated endocytosis”, Journal of Virology, 80(14), pp.6964-6972 17 Branch A.D., Stump D.D., Gutierrez J.A., Eng F., Walewski J.L (2005), “ The hepatitis virus alternate reading frame (ARF) and its family of novel products: the alternate reading frame protein/F-protein, the double-frameshift, and others”, Seminars in liver disease 2005, 25(1), pp.105-117 18 Donahue J.G., D.V.M., Munoz A., Paul M., Ness M.D., Donald E., Broun J.R., David H., Yawn M.D., Hugh A., McAllister J.R., Bruce A., Rettz M.D (1992), “ The declining risk of post-transfusion hepatitis C virus in fection”, The new England Journal of Medicine, 327(6), pp.369-373 19 Duvet S., Beeck A.O.D., Cocquerel L., Wychowski C., Cacan R., Dubuisson J (2002), “ Glycosylation of the hepatitis C virus envelope protein E1 occurs posttranslationally in a mannosylphosphorylclolichol-deficient CHO mutant cell Footer Page 49 of 166 49 Phương Header Page 50Thị ofHà 166 Luận văn Thạc sĩ khoa học line”, Insttutde Biologie delille/ Instiut Pasteur delille, BP447,59021 LILLE Cedex, France 20 Esfahani S.N., Shahhosseing M.H., Yaghmai P., Praivar K., Moslemi E., Amini H.K (2010), “ Rapid and simple detection of Hepatitis C virus by reverse transcriptaseloop-mediated isothermal amplification method”, African Journal of Microbiology Research, 4(23), pp.2580-2586 21 Friebe P., Bartenschlager R (2002), “Genetic analysis of sequences in the 3’ nontranslated region of hepatitis C virus that are important for RNA replication”, Journal of Virology, 76(11), pp.5326-5338 22 Friebe P., Boudet T., Simorre J.P., Bartenschlager R (2005), “ Kissing-loop interation in the 3’ end of the hepatitis C virus genome essential for RNA replication”, Journal of Virology, 79(1), pp.380-392 23 Fu Y., Wang Y., Xia W., Pybus O.G., Qin W., Lu L., Nelson K (2011), “New treds of HCV infection in China revealed by genetic analysis of viral sequences deter mined from firt-time volunteer blood donors”, Journal of viral hepatitis, 18, pp.42-52 24 Germer J.J., Rys P.N., Thorvilson., Persing D.H (1999), “ Determination of hepatitis C virus genotype by direct sequence analysis of products generated with the amplicon HCV test”, Journal of Clinical Microbiology, 37(8), pp.2625-2630 25 Gastaminza P., Cheng G., Wieland S., Zhong J., Liao W., Chisari F.V (2008), “ Cellular determinants of hepatitis C virus assembly, maturation, degradation and seretion”, Journal of Virology, 82(5), pp.2120-2129 26 Halfon P., Trimoulet P., Bourliere M., Khiri H., Deledinghen V., Couzigou P., Feryn J.M., Alcaraz P., Renou C., Fleury H.J.A., Ouzan P (2001), “ Hepatitis C virus genotyping based on 5’ noncoding sequence analysis (Trugene)”, Journal of Clinical Microbiology, 39(5), pp.1771-1773 Footer Page 50 of 166 50 Phương Header Page 51Thị ofHà 166 Luận văn Thạc sĩ khoa học 27 Haqshenas G., Mackenrie J.M., Dong X., Gowans E.J (2007), “ Hepatitis C virus p7 protein is localized in the endoplasmic reticulum when it is encoded by a replication-competent genome”, Journal of General Virology, 88, pp.134-142 28 Helle F., Dubuisson J (2008), “Hepatitis C virus entry into host cells”, Cellularand Molecular Life Sciences, 65, pp 100-112 29 Honda M., Beared M.R., Ping L.H., Lemon S.M (1999), “ A phylogenetically conserved stem-loop structure at the 5’ border of the internal ribosome entry site of hepatitis C virus is required for cap-independent viral translation”, Journal of Virology, 83(2), pp.1165-1174 30 Hotta H., Handajami R., Lusida M.I., Soemarto W., Doi H., Miyajama H., Homma M (1994), “ Subtype analysis of hepatitis C virus in Indonesia on the basis of NS5b region sequences”, Journal of Clinical Microbiology, 32(12), pp.3049-3051 31 Hsu M., Zhang J., Flint M., Logvinoff C., Cheng-Mayer C., Rice C., McKeating J.A (2003), “ Hepatitis C virus glycoproteins mediate pH-dependent cell entry of pseudotyped retro viral particles”, 1230 York Avenue, New York 32 James G., Donahue Jr., David H., Yawn M.D., Hugh A., McAllister J.R., Bruce A., Rettz M.D., Kenrad E (1992), “The declining risk of post-transfusion hepatitis C virus infection”, The new England Journal of Medicine, 327(6), pp.369-373 33 Kapadia S.B., Barth H., Baumert T., Mekeating J.A., Chisari F.V (2007), “ Initiation of hepatitis C virus infection is dependent on cholesterol and cooperativity between CD81 and scavenger receptor B type 1”, Journal of Virology, 81(1), pp.374-383 34 Kolykhalov A.A., Feinstone S.M., Rice C.M (1996), “ Identification of a highly conserved sequence element at the 3’ terminus of hepatitis C virus genome RNA”, Journal of Virology, 70(6), pp 3363-3371 Footer Page 51 of 166 51 Phương Header Page 52Thị ofHà 166 Luận văn Thạc sĩ khoa học 35 Marshall D.J., Heisler L.M., Lyamichev V., Murvine C., Olive D.M., Ehrlich G.D., Neri B.P., deArruda M (1997), “ Determination of hepatitis C virus genotypes in the United States by Cleavase fragment length polymorphism analysis”, Journal of Clinical Microbiology, 35(12), pp.3156-3162 36 Martell M.,Gomez J., Esteban T., Sauleda S., Quer J., Cabot B., Esteban R., Guardia J (1999), “ High-throughput Real-time reverse transcription – PCR quantitation of hepatitis C virus RNA”, Journal of Clinical Microbiology, 37(2), pp.327-332 37 Martial J., Morice Y., Albel S., Cabie A.,Rat C., Lombard F., Edouard A., Bierrelouis S., Chout R., Gordien E., Deny P., Cesaire R (2004), “ Hepatitis C virus (HCV) genotypes in the Caribbean island of martinique: evidence for a large radiation of HCV for a recent introduction from Europe of HCV-4”, Journal of Clinical Microbiology, 42(2), pp.784-791 38 McOmish F., Yap P.L., Dow B.C., Follett E.A.C., Seed C., Lin C., Lai C., Leong S., Medgyesi G.A., Hejjas M., Kiyokawa H., Fukada K., Cuypers T., Saeed A.A., Alrasheed A.M (1994), “ Geographical distribution of hepatitis C virus genotypes in blood donors : an international collaborative survey”, Journal of Clinical microbiology, 32(4), pp.884-892 39 Moradpour D., Cerny A., Heim M H., Blum H.E (2003), “ Hepatitis C: an update”, Swiss Med Wkly, 131, pp.291-298 40 Ndjomou J., Dybus O.G., Matz B (2003), “ Phylogentic analysis of hepatitis C virus isolates indicates a unique pattern of endemic infection in Cameroon”, Journal of General Virology, 84, pp 2333-2341 41 Pybus O.G., Barnes E., Taggart R., Lemey P., Markov P.V., Rasachak B., Syhavong B., Phetsouvanah R., Sheridan I., Humphrey I.S., Lu L., Newton P.N., Klenerman P (2009), “ Genetic history of hepatitis C virus in East Asia”, Journal of Virology, 83(2), pp.1071-1082 Footer Page 52 of 166 52 Phương Header Page 53Thị ofHà 166 Luận văn Thạc sĩ khoa học 42 Simmonds P., Holmes E.C., Cha T.A., Chan S.W., McOmish F., Irvine B., Beall E., Yap P.L., Kolberg J., Urdea M.S (1993), “ Classification subtype by phylogenetic analysis of the NS-5 rigion”, Journal of General Virology, 74, pp 2391-2399 43 Simmonds P (2004), “Genetic diversity and evolution of hepatitis C virus-15 years on”, Journal of General Virology, 85, pp.3173-3188 44 Simmonds P., Bukh J., Combet C., et al (2005), “ Consensus proposals for a unified system of nomenclature of hepatitis C virus genotypes”, Hepatology 2005, 42, pp 962-973 45 Song Y., Friebe P., Tzima E., Junemann C., Bartenschlager R., Niepmann M (2006), “ The hepatitis C virus RNA 3’-untranslated region entry site”, Journal of Virology, 80(23), pp.11579-11588 46 Walewski J.L., Keller T.R., Stump D.D., et al (2001), “ Evidence for a new hepatitis C virus antigen encoded in an overlapping reading frame”, RNA 2001, 7, pp.710721 47 Xu Z., Fan X., Xu Y., Bisceglie A.M.D (2008), “ Comparative analysis of nearly full-length hepatitis C virus quasispecies from patients experiencing viral break through during antiviral therapy: clustered mutations in three functional genes, E2,NS2 and NS5a”, Journal of Virology, 82(19), pp.9417-9424 48 You S., Rice C.M (2008), “ 3’RNA elements in hepatitis Cvirus replication: kissing partners and long poly (U)”, Journal of Virology, 82(1), pp.184-195 Trang web 49 http://www.drthuthuy.com 50 http://www.HepatologyTextbook.com 51 http://www.ncbi.nlm.nih.gov Footer Page 53 of 166 53 Phương Header Page 54Thị ofHà 166 Footer Page 54 of 166 Luận văn Thạc sĩ khoa học 54 Phương Header Page 55Thị ofHà 166 Luận văn Thạc sĩ khoa học 45-42,40,38-37,35,33,30,25-22,13,11,5-3 1-2,6-10,12,14-21,26-29,31-32,34,36,39,41,46-53 Footer Page 55 of 166 55 ... pháp x c định genotype, chọn đề tài: X c định kiểu gen virus viêm gan C huyết bệnh nhân viêm gan C kỹ thuật sinh h c phân tử RT-PCR , với m c tiêu sau : 1) X c định tỉ lệ người mang kiểu gen HCV... Primer R Mồi ngư c Probe1 Mẫu dò 5’-FAM-TGCCAGGACGACCGGGTCCTTTCTTG- 22 BHQ1-3’ Probe2 Mẫu dò 5’-Cy5-AAGGACCCAGTCTTCCCGGCAATTCBHQ2-3 Probe Mẫu dò 25 ’ 5’-ROX-ACCCGGTCACCCCAGCGATTCC- 23 BHQ2-3’ Mẫu... phân định loại HCV (Genotype HCV) Cu c xét nghiệm phân định loại HCV dùng để x c định bạn bị nhiễm loại HCV Ðiều hữu ích cho vi c định c ch chữa trị, chọn lựa loại thu c, c n điều trị 1.4 C c