Nghiên cứu đặc tính sinh học phân tử virus dịch tả vịt tại Việt Nam qua khảo sát các gen UL5, UL32 và DNA-polymerase

VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT Hán Thị Hƣơng Nghiên cứu đặc tính sinh học phân tử virus dịch tả vịt Việt Nam qua khảo sát gen UL5, UL32 DNA-polymerase Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60.42.30 Ngƣời hƣớng dẫn: PGS.TS Lê Thanh Hòa Hà Nội – 2012 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CẢM ƠN Em xin đƣợc bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến PGS.TS.Lê Thanh Hòa - Trƣởng phòng Miễn dịch học - Viện Công nghệ sinh học tận tình hƣớng dẫn, bảo tạo điều kiện thuận lợi cho em trình học tập hoàn thành luận văn Em xin chân thành cảm ơn TS.Lê Thị Kim Xuyến - phòng Miễn dịch học - Viện Công nghệ sinh học hƣớng dẫn, bảo giúp đỡ em hoàn thành luận văn Em xin chân thành cảm ơn NCS.Tạ Hoàng Long - Giám đốc trung tâm kiểm nghiêm thuốc thú y trung ƣơng tạo điều kiện thuận lợi cho em trình học tập hoàn thành luận văn Em xin cảm ơn hỗ chợ kinh phí đề tài nhánh “Giải mã gen đặc trƣng xây dựng liệu sinh học phân tử chủng virus gia cầm quốc gia” PGS.TS Lê Thanh Hòa làm chủ nhiệm thuộc đề tài “Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử để xây dụng danh mục giống virus gia cầm quốc gia” năm 2011 Trung tâm kiểm nghiệm thuốc thú y chủ trì nằm “Chƣơng trình công nghệ sinh học Nông nghiệp” Nông nghiệp Phát triển nông thôn Em xin chân thành cảm ơn Cơ sở đào tạo Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật, Ban lãnh đạo Viện sinh thái Tài nguyên sinh vật thầy cô tạo điều kiện thuận lợi cho em trình học tập hoàn thành luận văn Em xin đƣợc bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới tất cô chú, anh chị phòng Miễn dịch học, Viện Công nghệ sinh học nhiệt tình giúp đỡ trình tiến hành thí nghiệm nhƣ tạo điều kiện để luận văn đƣợc hoàn thiện Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Cuối em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới ngƣời thân, gia đình bạn bè khuyến khích, động viên nhƣ chia sẻ khó khăn với em suốt trình học tập hoàn thành nghiên cứu Học viên Hán Thị Hƣơng Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỤC LỤC Lời cảm ơn…………………………………………………………………….…….i Mục lục………………………………………………………………………… iii Danh mục ký hiệu, chữ viết tắt ……………………………… ….…iv Danh mục bảng…………………………………………………………… …v Danh mục hình…………………………………………………………… …vi ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu bệnh dịch tả vịt virus gây bệnh 1.1.1 Lịch sử địa dƣ bệnh 1.1.2 Đƣờng xâm nhập, cách lây lan chế gây bệnh 1.1.3 Triệu chứng lâm sàng 1.1.4 Bệnh tích 1.1.5 Vaccine phòng bệnh 1.2 Sinh học phân tử virus dịch tả vịt 11 1.2.1 Cấu trúc hệ gen virus dịch tả vịt 11 1.2.2 Sự nhân lên virus 16 1.3 Tình hình nghiên cứu virus dịch tả vịt giới Việt Nam 18 CHƢƠNG 20 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1 Vật liệu 20 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 21 2.2.1 Phƣơng pháp tiếp truyền 21 2.2.2 Phƣơng pháp tách chiết DNA tổng số 22 2.2.3 Kỹ thuật PCR 23 2.2.4 Phƣơng pháp tinh sản phẩm PCR 24 2.2.5 Phƣơng pháp giải trình tự 25 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 2.2.6 Phƣơng pháp xử lý số liệu sử dụng phần mềm tin-sinh học 26 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28 3.1 Kết tiếp truyền virus 28 3.2 Kết thu nhận chuỗi gen nghiên cứu 30 3.2.1 Kết thu nhận chuỗi gen DNA-polymerase giải trình tự 30 3.2.2 Kết thu nhận chuỗi gen helicase (UL5) giải trình tự 32 3.2.3 Kết thu nhận chuỗi gen kháng nguyên (UL32) giải trình tự 35 3.3 Kết phân tích, so sánh thành phần gen chủng virus dịch tả vịt Việt Nam với chủng giới dựa gen UL5 UL32 39 3.3.1 Kết phân tích gen UL5 40 3.3.2 Kết phân tích gen UL32 46 3.4 Bàn luận chung 52 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO 56 PHỤ LỤC……………………………………………… ………………… 63 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Tiếng Anh Tiếng Việt bp base pair Cặp bazơ cDNA complementary DNA DNA bổ sung Da dalton DEV Duck Enteritis Virus Virus gây bệnh dịch tả vịt DNA Deoxyribonucleic acid Axit deoxyribonucleic kDa kilo dalton nm nanometer ORF Open Reading Frame Khung đọc mở RNA Ribonucleic Acid Axit ribonucleic PCR Polymerase chain reaction Phản ứng trùng hợp chuỗi gen UL Unique long Vùng dài US Unique short Vùng ngắn UTR Untranslated region Vùng không mã hóa IRS short internal repeat vùng lặp ngắn TRS short terminal repeat vùng lặp ngắn cuối Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng Trang Bảng 2.1 Thành phần phản ứng PCR chu trình nhiệt nghiên cứu sinh học phân tử virus dịch tả vịt Bảng 2.2 Các cặp mồi (primer) đƣợc sử dụng nghiên cứu 23 Bảng 3.1 Kết tiếp truyền virus cƣờng độc dịch tả vịt vịt 27 Bảng 3.2 Danh sách chủng Dịch tả vịt Việt Nam giới sử dụng phân tích so sánh Tỷ lệ (%) đồng nucleotide (trên đƣờng chéo) tƣơng đồng amino acid (dƣới đƣờng chéo) gen UL5 Bảng 3.3 chủng DTVCDKN (Việt Nam) với chủng DTVVXKN (Việt Nam) 07 chủng DTV giới Tỷ lệ (%) đồng nucleotide (trên đƣờng chéo) Bảng 3.4 tƣơng đồng amino acid (dƣới đƣờng chéo) gen UL32 chủng DTVCDKN (Việt Nam) với chủng DTVVXKN (Việt Nam) 07 chủng DEV giới Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 23 39 44 50 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Tên hình Trang Hình 1.1 Triệu chứng vịt bị bệnh dịch tả Hình 1.2 Bệnh tích vịt bị bệnh dịch tả vịt Hình 1.3 Cấu trúc không gian Herpesviruses 11 Hình 1.4 Cấu tạo hạt virus dịch tả vịt 12 Hình 1.5 Chu trình nhân lên Herpesvirus tế bào vật chủ 18 Hình 3.1 Triệu chứng bệnh tích vịt bệnh dịch tả vịt 28 29 Hình 3.3 Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR thạch agarrose 1% Trình tự gen DNA-polymerase chủng DTVCDKN Hình 3.4 Trình tự gen DNA-polymerase chủng DTVVXKN 31 32 Hình 3.6 Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR thạch agarrose 1% Trình tự gen UL5 chủng DTVCDKN Hình 3.7 Trình tự gen UL5 chủng DTVVXKN 34 35 Hình 3.9 Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR thạch agarrose 1% Trình tự gen UL32 chủng DTVCĐKN Hình 3.10 Trình tự gen UL32 chủng DTVVXKN 37 Hình 3.2 Hình 3.5 Hình 3.8 Hình 3.11 Hình 3.12 Hình 3.13 Hình 3.14 Kết so sánh thành phần nucleotide chủng dịch tả vịt Việt Nam với chủng giới dựa gen Helicase (UL5) Kết so sánh thành phần amino acid chủng dịch tả vịt Việt Nam với chủng giới dựa gen Helicase (UL5) Kết so sánh thành phần nucleotide chủng dịch tả vịt Việt Nam với chủng giới dựa gen kháng nguyên (UL32) Kết so sánh thành phần amino acid chủng dịch tả vịt Việt Nam với chủng giới dựa gen kháng nguyên (UL32) Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 30 33 36 42 43 48 49 ĐẶT VẤN ĐỀ Dịch tả vịt (duck plague) bệnh truyền nhiễm cấp tính, lây lan nhanh, gây bệnh cho nhiều loài thuỷ cầm, trƣớc hết loài vịt, ngỗng, ngan, thiên nga, hầu hết lứa tuổi từ vài ngày vài tháng tuổi, chí vịt giống nuôi hàng năm (Wobeser, 1997), gây nhiều thiệt hại cho ngành chăn nuôi giới nhƣ Việt Nam Virus dịch tả vịt (duck enteritis virus-DEV) thành viên họ Herpesviridae, có hệ gen DNA sợi đôi có độ dài khoảng 150-170kb giống nhƣ nhiều loại virus thuộc họ Herpesviridae khác Phân bố thành phần nucleotide hệ gen thiên G+C (Guanine Cytosine), chiếm tỷ lệ 64,3%, cao nhiều so với Herpesvirus khác gia cầm (Gardner cs., 1993) Mặc dù nay, virus gây bệnh dịch tả vịt đƣợc phân nhóm vào dƣới họ Alphaherpesvirinae (Shawky Schat, 2002) nhƣng đặc tính sinh học phân loại học loại virus gặp nhiều vấn đề, nên Ủy ban phân loại virus học quốc tế (ICTV) tạm thời xếp vào nhóm virus chƣa xác định cụ thể thuộc họ Herpesviridae (Fauquet cs., 2005; Liu cs., 2008) Về cấu trúc phân tử, hệ gen DEV chia làm hai vùng gen quan trọng hay gọi vùng độc (unique region, U), bao gồm UL (vùng dài) US (vùng ngắn), bao bọc hai đầu vùng ngắn hai vùng lặp ký hiệu IRS TRS Vì hệ gen virus dịch tả vịt tƣơng đối lớn nên đến có vài hệ gen đƣợc giải mã (Wang cs., 2011), nhiên số hợp phần gen quan trọng đƣợc giải mã phân tích Trong số gen hệ gen virus dịch tả vịt, ngƣời ta thƣờng sử dụng số gen đặc thù để làm thị phân tử chẩn đoán, giám định xác định đặc tính sinh học hệ gen virus dịch tả vịt, trƣớc hết gen DNA-polymerase (DNA-pol), gen UL32 mã hoá cho glycoprotein vỏ hay đƣợc coi gen kháng nguyên (Hansen cs., 2000) gen UL5 (Pan cs., 2008) Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Cho đến virus dịch tả vịt diễn biến phức tạp gây nhiều ổ dịch khắp địa phƣơng nƣớc Tuy nhiên, Việt Nam lại chƣa có nghiên cứu đầy đủ đặc tính phân tử, nguồn gốc phả hệ, tính tƣơng đồng chủng virus cƣờng độc chủng virus vaccine Xuất phát từ yêu cầu thực tế đó, tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu đặc tính sinh học phân tử virus dịch tả vịt Việt Nam qua khảo sát gen UL5, UL32 DNA-polymerase” - Đối tƣợng nghiên cứu: - Chủng virus cƣờng độc dịch tả vịt Trung tâm Kiểm nghiệm thuốc thú y Trung ƣơng cung cấp, đƣợc kí hiệu DTVCDKN - Chủng virus nhƣợc độc vaccine Trung tâm Kiểm nghiệm thuốc thú y Trung ƣơng cung cấp, đƣợc kí hiệu DTVVXKN - Mục tiêu đề tài là: Giải mã gen UL5, UL32 DNA-polymerase chủng virus cƣờng độc nhƣợc độc vaccine Việt Nam; phân tích so sánh đặc điểm sinh học phân tử với chủng giới Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read ... hành nghiên cứu đề tài: Nghiên cứu đặc tính sinh học phân tử virus dịch tả vịt Việt Nam qua khảo sát gen UL5, UL32 DNA-polymerase - Đối tƣợng nghiên cứu: - Chủng virus cƣờng độc dịch tả vịt. .. 1.2 Sinh học phân tử virus dịch tả vịt 11 1.2.1 Cấu trúc hệ gen virus dịch tả vịt 11 1.2.2 Sự nhân lên virus 16 1.3 Tình hình nghiên cứu virus dịch tả vịt giới Việt Nam. .. ta thƣờng sử dụng số gen đặc thù để làm thị phân tử chẩn đoán, giám định xác định đặc tính sinh học hệ gen virus dịch tả vịt, trƣớc hết gen DNA-polymerase (DNA-pol), gen UL32 mã hoá cho glycoprotein