Nghiên cứu đặc tính sinh học phân tử của virus gây tiêu chảy thành dịch (porcine epidemic diarrhea) trên lợn và một số đặc điểm bệnh lý của bệnh

Xuất phát từ tình hình thực tiễn trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu đặc tính sinh học phân tử của virus gây tiêu chảy thành dịch Porcine epidemic diarrhea trên lợn

1.1 Những nghiên cứu về hội chứng tiêu chảy 3

1.1.2 Một số nguyên nhân gây tiêu chảy ở lợn 5 1.2 Lịch sử và tình hình nghiên cứu bệnh tiêu chảy thành dịch trên lợn

1.2.1 Tình hình nghiên cứu bệnh tiêu chảy thành dịch do virus PED gây ra

1.8.1 Giải trình tự DNA theo phương pháp Maxam và Gilbert 21 1.8.2 Giải trình tự DNA theo phương pháp dideoxy 22

Chương 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

2.4.3 Phương pháp làm tiêu bản vi thể theo quy trình tẩm đúc bằng Parafin,

2.4.4 Phương pháp tách chiết RNA tổng số bằng hóa chất 29 2.4.5 Phương pháp tiến hành phản ứng RT-PCR 30 2.4.6 Phương pháp điện di kiểm tra sản phẩm PCR 31

3.1 Kết quả phản ứng RT-PCR chẩn đoán lợn mắc PED 34 3.2 Triệu chứng lâm sàng chủ yếu ở lợn mắc PED 37 3.3 Kết quả nghiên cứu bệnh tích đại thể ở lợn mắc PED 42 3.4 Kết quả nghiên cứu bệnh tích vi thể ở lợn mắc PED 46

v

3.5 Kết quả giải trình tự gen, so sánh thành phần và sự tương đồng

nucleotide, axit amin của các chủng virus PED nghiên cứu và một số

3.5.1 Kết quả so sánh sự tương đồng nucleotide của các chủng virus PED nghiên

3.5.2 Kết quả so sánh sự tương đồng nucleotide của các chủng virus PED

nghiên cứu được với một số chủng virus PED trên thế giới 52

3.5.3 Kết quả so sánh sự tương đồng axit amin của các chủng virus PED

3.5.4 Kết quả so sánh sự tương đồng về thứ tự axit amin của các chủng virus

PED nghiên cứu được với một số chủng tham chiếu trên thế giới 59

DANH MỤC VIẾT TẮT

Cs : Cộng sự FMDV : The foot-and-mouth disease virus

M : Membrain protein

N : Nuclecapxit protein NXB : Nhà xuất bản ORF3 : Open reading flame PED : Porcine epidemic diearrhea PEDV : Porcine epidemic diearrhea virus

Pp : Page paper PRRSV : Porcine reproductive and respiratory

syndrome virus

RT-PCR : Reverse transcription polymerase chain reaction

S : Spike protein TGEV : Transmissible gastroenteritis virus

Tr : Trang

với một số chủng virus PED trên thế giới (%) 57 Bảng 3.10 Sai khác về thứ tự axit amin được mã hóa ở gen M của các chủng

Bảng 3.11 Sự tương đồng về thứ tự axit amin được mã hóa của gen M giữa

Bảng 3.12 Sự tương đồng về thứ tự axit amin ở gen M giữa các chủng virus

PED nghiên cứu với một số chủng virus PED trên thế giới (%) 61

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Những không bào trong bào tương của một tế bào hấp thu ở

ruột non lợn, chứa các hạt virus PED có đường kính từ

Hình 1.2 Virus PED chủng KPEDV-9 phân lập tại Hàn Quốc nhuộm

với urany acetat 2% Chiều dài thanh nằm ngang tương

Hình 1.4 Mô hình nguyên lý của phản ứng RT-PCR 20

Hình 3.13 Ruột non sung huyết, xuất huyết (HE 10X) 48Hình 3.14 Tĩnh mạch chứa nhiều hồng cầu (HE 10X) 48Hình 3.15 Lớp đệm nhiều bạch cầu, lông nhung đứt nát (HE 10X) 48

Hình 3.17 Thâm nhiễm tế bào viêm ở ruột (HE 40X) 48Hình 3.18 So sánh thành phần nucleotit chuỗi gen giải trình tự 50

Hình 3.19 So sánh thành phần nucleotide giữa các chủng virus PED

nghiên cứu với một số chủng virus PED trên thế giới 56Hình 3.20 So sánh thành phần axit amin được mã hóa của chuỗi gen

Hình 3.21 So sánh thành phần axit amin giữa các chủng virus PED

nghiên cứu với một số chủng virus PED trên thế giới 60Hình 3.22 Cây phả hệ của các chủng virus PED nghiên cứu dựa trên

trình tự nucleotide (hiển thị dạng cây theo boot trap) 62Hình 3.23 Cây phả hệ của các chủng virus PED nghiên cứu dựa trên

trình tự nucleotide (hiển thị dạng cây theo cây gốc) 63

1

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Xét trên bình diện thế giới, nhất là với các nước châu Á, chăn nuôi luôn là một ngành kinh tế nông nghiệp quan trọng Hệ thống nông nghiệp Việt Nam đã đạt được thành tích đáng ghi nhận không chỉ ở lĩnh vực lương thực và cây công nghiệp mà còn ở lĩnh vực chăn nuôi gia súc và thủy sản Cùng với sự phát triển của quá trình công nghiệp hóa – hiện đại hóa đất nước, công nghệ hiện đại ngày càng được áp dụng sâu rộng đã giúp cho năng suất chăn nuôi ngày càng tăng cao, thời gian nuôi được rút ngắn, do đó lợi nhuận thu được từ chăn nuôi cũng có xu hướng tăng Bên cạnh đó, mức sống của con người ngày càng nâng cao kéo theo

sự thay đổi trong cơ cấu tiêu dùng thức ăn, xu hướng tiêu dùng sản phẩm trồng trọt giảm đi, nhanh chóng nhường chỗ cho sản phẩm chăn nuôi Nhu cầu về thịt trên thị trường ngày càng tăng lên, đặc biệt là nhu cầu về sản phẩm thịt lợn

Tình hình trên chính là động lực để thúc đẩy ngành chăn nuôi lợn ngày càng phát triển mạnh mẽ Chăn nuôi lợn là ngành chăn nuôi không mới nhưng trong điều kiện Việt Nam hiện nay, đó lại là ngành chăn nuôi có triển vọng nhất Tuy nhiên, ngành chăn nuôi nói chung và chăn nuôi lợn nói riêng cũng gặp không ít khó khăn, đặc biệt là vấn đề dịch bệnh đã mang lại những thiệt hại không nhỏ cho người chăn nuôi

Bệnh tiêu chảy thành dịch ở trên lợn do virus PED (Porcine Epidemic Diarrhea) - một virus thuộc họ Coronavirus đang là một trong những vấn đề rất được quan tâm hiện nay do bệnh đã gây thiệt hại nghiêm trọng trên đàn lợn Bệnh PED xảy ra quanh năm, nhưng thường phổ biến hơn vào mùa đông và trên 90% ca bệnh xảy ra ở lợn dưới 10 ngày tuổi Bệnh xuất hiện lần đầu tiên ở nước Anh vào năm 1972, sau đó lây lan ra nhiều quốc gia ở châu Âu và châu Á như Trung Quốc, vũng lãnh thổ Đài Loan, Nhật, Hàn Quốc và Thái Lan Năm 2008, virut PED đã được phát hiện trong một số đàn lợn bị tiêu chảy ở Việt Nam

2

Cho tới nay, ở Việt Nam, chưa có nhiều công trình nghiên cứu về bệnh tiêu chảy thành dịch ở trên lợn do virus PED cũng như nghiên cứu đặc điểm bệnh lý, sinh học phân tử của virus PED, đặc biệt là ở khu vực phía Bắc Việt Nam Bên cạnh đó, có một thực tế đặt ra là: các biểu hiện triệu chứng lâm sàng ở trên lợn ốm do nhiễm virus PED giống và rất dễ nhầm lẫn với các biểu hiện triệu chứng lâm sàng ở lợn bị nhiễm virus gây viêm dạ dày ruột truyền nhiễm (TGEV)

Xuất phát từ tình hình thực tiễn trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài:

“Nghiên cứu đặc tính sinh học phân tử của virus gây tiêu chảy thành dịch (Porcine epidemic diarrhea) trên lợn và một số đặc điểm bệnh lý của bệnh”

2 Mục đích của đề tài

- Xác định được các đặc điểm bệnh lý chủ yếu (bao gồm triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đại thể, vi thể) của lợn mắc bệnh tiêu chảy thành dịch do virus PED gây ra

- Xác định được mối quan hệ di truyền của chủng virus PED nghiên cứu tại Việt Nam so với các chủng tham chiếu trên thế giới dựa trên trình tự gen M của virus gây bệnh

3

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Những nghiên cứu về hội chứng tiêu chảy

Tiêu chảy là một biểu hiện lâm sàng của quá trình bệnh lý đặc thù ở đường tiêu hóa Biểu hiện lâm sàng tùy theo đặc điểm, tính chất, diễn biến, độ tuổi mắc bệnh Tùy theo yếu tố nào được xem là nguyên nhân chính mà nó được gọi với nhiều tên khác nhau: Bệnh lợn con ỉa phân trắng, bệnh tiêu chảy sau cai sữa, chứng khó tiêu, chứng rối loạn tiêu hóa hay Colibacillosis, Salmonellosis,… hoặc tiêu chảy là triệu chứng thường gặp ở nhiều bệnh ký sinh trùng, bệnh do virus, bệnh do vi khuẩn

Tiêu chảy thường gặp ở gia súc, đã và đang gây thiệt hại lớn cho ngành chăn nuôi Trong lịch sử nghiên cứu về hội chứng tiêu chảy, nhiều tác giả đã nghiên cứu, tìm hiểu nguyên nhân gây ra hội chứng tiêu chảy Tuy nhiên, tiêu chảy là một hiện tượng bệnh lý, có liên quan đến rất nhiều các yếu tố, có yếu tố

là nguyên nhân nguyên phát, có yếu tố là nguyên nhân thứ phát Việc phân biệt rạch ròi nguyên nhân gây tiêu chảy không đơn giản Ngày nay, người ta thống nhất rằng, phân loại nguyên nhân gây tiêu chảy chỉ có ý nghĩa tương đối, chỉ nêu lên yếu tố nào là chính, xuất hiện đầu tiên, yếu tố nào là phụ xuất hiện sau, từ đó vạch ra phác đồ phòng và điều trị bệnh có hiệu quả Nhưng cho dù bất cứ nguyên nhân nào dẫn đến tiêu chảy thì hậu quả của nó cũng gây ra viêm nhiễm, tổn thương thực thể đường tiêu hóa và cuối cùng là nhiễm trùng

Theo Fairbrother J.M (1992) tiêu chảy là một bệnh gây thiệt hại đáng kể cho ngành chăn nuôi lợn

Theo Trịnh Văn Thịnh (1995), Lê Minh Chí (1995) lợn bị tiêu chảy thường mất nước, mất chất điện giải và kiệt sức Những lợn khỏi thường bị còi cọc, thiếu máu, chậm lớn hoặc hiện tượng viêm nhiễm, tổn thương thực thể đường tiêu hóa và cuối cùng là quá trình nhiễm trùng dẫn đến lợn chết với tỷ lệ cao, gây thiệt hại lớn về kinh tế Đó cũng là nguyên nhân làm cho hiệu quả chăn nuôi không cao

4

Sử An Ninh (1993), Phan Thanh Phượng và cs (1995) cho biết ở nước ta

bệnh tiêu chảy xảy ra quanh năm, đặc biệt vào vụ đông xuân, khi thời tiết thay

đổi đột ngột và vào những giai đoạn chuyển mùa trong năm

Khi nghiên cứu về tình hình dịch tễ, các nhà khoa học đã nhận xét bệnh

tiêu chảy xảy ra ở mọi nơi, mọi lúc trên thế giới (Lecce J.G., 1976); (Griffin

J.F.T., 1989)

Kết quả nghiên cứu của Hoàng Văn Tuấn và cs (1998) cho thấy bệnh tiêu

chảy xảy ra ở mọi lứa tuổi, từ sơ sinh cho đến độ tuổi sinh sản, nhưng trầm trọng

nhất là ở lợn sơ sinh đến cai sữa

1.1.1 Đặc điểm tiêu hóa của lợn con

Ở gia súc non sau khi sinh ra, chức năng của các cơ quan trong cơ thể nhất

là cơ quan tiêu hóa chưa hoàn chỉnh, nồng độ HCl và các men tiêu hóa chưa đảm

nhiệm đầy đủ chức năng tiêu hóa, rất dễ gây rối loạn trao đổi chất, hậu quả dễ

nhận biết là rối loạn tiêu hóa, gây tiêu chảy, còi cọc, thiếu máu và chậm lớn

Trong dịch vị của gia súc non chưa có đủ axit HCl tự do nên không hoạt hóa

được men pepsin vì vậy không tiêu hóa hết sữa mẹ, trong khi đó sữa mẹ lại là

môi trường phát triển tốt của nhiều loại vi khuẩn

Ở lợn con, có giai đoạn không có HCl trong dạ dày, đây được coi

là giai đoạn thích ứng cần thiết tự nhiên Chính nhờ sự thích ứng này, cơ thể lợn

con mới có khả năng hấp thu được kháng thể miễn dịch qua sữa đầu Trong giai

đoạn này dịch vị lại không có hoạt tính phân giải protein mà chỉ có hoạt tính làm

vón sữa đầu và sữa Albumin và Globulin được chuyển xuống ruột và thẩm thấu

vào máu Nhưng trên 14 - 16 ngày tuổi, tình trạng thiếu HCl ở dạ dày không còn

là sự cần thiết sinh lý bình thường nữa Việc tập ăn cho lợn con sớm và cai sữa

sớm đã rút ngắn được giai đoạn thiếu HCl, hoạt hóa hoạt động tiết dịch, giúp tăng

khả năng tạo các đáp ứng miễn dịch của cơ thể

Nhưng giai đoạn sau cai sữa là một giai đoạn khó khăn đối với lợn con khi

chuyển từ sữa mẹ sang thức ăn ở dạng rắn Điều đó có thể gây mất cân bằng hệ vi

sinh vật đường ruột tạo điều kiện cho vi khuẩn có hại phát triển và cũng là

nguyên nhân gây ra bệnh, dẫn đến kết quả là lợn con chậm lớn và có thể chết

5

Ngoài ra, lợn con còn chịu nhiều tác động của lợn mẹ, sự thay đổi ngoại cảnh cũng góp phần làm tăng stress của lợn con

1.1.2 Một số nguyên nhân gây tiêu chảy ở lợn

Tiêu chảy là một hiện tượng bệnh lý có liên quan đến nhiều yếu tố, có yếu

tố là nguyên nhân nguyên phát, có yếu tố là nguyên nhân thứ phát Vì vậy, việc phân biệt rạch ròi giữa các nguyên nhân gây tiêu chảy là rất khó khăn

Đã có nhiều công trình nghiên cứu về nguyên nhân gây nên hội chứng tiêu chảy, có thể là nguyên phát hay thứ phát Dưới đây là một số nguyên nhân cơ bản:

1.1.2.1 Do môi trường ngoại cảnh

Môi trường ngoại cảnh là một trong 3 yếu tố cơ bản gây ra bệnh dịch, mối quan hệ giữa cơ thể - mầm bệnh - môi trường là nguyên nhân của sự không ổn định về sức khỏe, đưa đến phát sinh bệnh (Nguyễn Như Thanh, 2001)

Môi trường ngoại cảnh bao gồm các yếu tố: nhiệt độ, ẩm độ, các điều kiện

về chăm sóc nuôi dưỡng, vệ sinh chuồng trại, sự di chuyển, thức ăn, nước uống…

Khi gia súc bị nhiễm lạnh kéo dài làm giảm phản ứng miễn dịch, giảm tác dụng thực bào, làm cho gia súc dễ bị nhiễm khuẩn và gây bệnh Khẩu phần ăn cho vật nuôi không thích hợp, thức ăn kém chất lượng như thối, mốc và nhiễm các tạp chất, các vi sinh vật có hại dễ dẫn đến rối loạn tiêu hóa kèm theo viêm ruột, ỉa chảy ở gia súc

Đào Trọng Đạt và cs (1995); Phạm Khắc Hiếu và cs (1998) cũng cho rằng các yếu tố stress lạnh, độ ẩm ảnh hưởng rất lớn đến lợn sơ sinh, lợn con vài ngày tuổi Độ ẩm thích hợp cho lợn là từ 75% đến 85% Việc làm khô và giữ ấm chuồng nuôi là vô cùng quan trọng

Sử An Ninh và cs (1981); Niconxki V.V (1986); Phạm Khắc Hiếu và cs (1998) cho rằng các yếu tố khí hậu, thời tiết không thuận lợi là yếu tố tác động rất mạnh đến quá trình loạn khuẩn ở lợn và là nguyên nhân gây ra bệnh tiêu chảy

Như vậy, nguyên nhân môi trường ngoại cảnh gây tiêu chảy không mang tính đặc hiệu mà mang tính tổng hợp Lạnh và ẩm gây rối loạn hệ thống điều tiết trao đổi nhiệt của cơ thể lợn, dẫn đến rối loạn quá trình trao đổi chất, làm giảm

6

sức đề kháng của cơ thể, từ đó các mầm bệnh trong đường tiêu hóa có thời cơ tăng cường độc lực và gây bệnh

1.1.2.2 Chế độ chăm sóc nuôi dưỡng không đúng kỹ thuật

Thức ăn kém chất lượng, ôi thiu, khó tiêu… là nguyên nhân gây ỉa chảy ở gia súc Thức ăn thiếu các chất khoáng, vitamin cần thiết cho cơ thể, đồng thời phương thức chăn nuôi không phù hợp sẽ làm giảm sức đề kháng của cơ thể gia súc và tạo cơ hội cho các vi khuẩn đường tiêu hóa phát triển và gây bệnh (Hồ Văn Nam và cs., 1997)

Theo Hoàng Văn Tuấn (1998); Đoàn Kim Dung (2004); cho rằng: Tỷ lệ mắc tiêu chảy trong một số cơ sở chăn nuôi lợn phụ thuộc vào điều kiện chăm sóc, vệ sinh thú y, còn tỷ lệ chết, mức độ trầm trọng của bệnh ở một đàn phụ thuộc vào giai đoạn mắc bệnh

Theo Trịnh Văn Thịnh (1995); Đào Trọng Đạt và cs (1995) trong quy trình kỹ thuật chăm sóc, nuôi dưỡng lợn thì công tác chăm sóc, nuôi dưỡng lợn con và lợn mẹ đúng kỹ thuật phù hợp với lứa tuổi là yếu tố quan trọng quyết định đến tỷ lệ tiêu chảy cao hay thấp, trong thành phần và sự cân đối các chất dinh dưỡng trong khẩu phần đóng vai tò quan trọng

1.1.2.3 Tiêu chảy do vi khuẩn

Trong đường tiêu hóa của gia súc có hệ vi khuẩn gọi là hệ vi khuẩn đường ruột, được chia thành 2 loại, trong đó vi khuẩn có lợi tác dụng lên men phân giải các chất dinh dưỡng giúp cho quá trình tiêu hóa được thuận lợi và vi khuẩn có hại thì khi có điều kiện thuận lợi sẽ gây bệnh

Họ vi khuẩn đường ruột là họ vi khuẩn cộng sinh thường trực trong đường ruột Họ vi khuẩn này muốn từ vi khuẩn cộng sinh trở thành vi khuẩn gây bệnh thì phải có 3 điều kiện

- Trên cơ thể vật chủ có cấu trúc giúp cho vi khuẩn thực hiện được chức năng bám dính

- Vi khuẩn phải có khả năng sản sinh các yếu tố gây bệnh, đặc biệt sản sinh độc tố, trong đó quan trọng nhất là độc tố đường ruột Enterotoxin

7

- Có khả năng xâm nhập vào lớp tế bào biểu mô của niêm mạc ruột và từ

đó phát triển lên

Một số vi khuẩn thuộc họ vi khuẩn đường ruột là E.coli, Salmonella

sp.shigella, Klebsiella, Clostridium perfringens…đó là những vi khuẩn quan trọng, gây rối loạn tiêu hóa, viêm ruột tiêu chảy ở người và nhiều loài động vật

Đào Trọng Đạt và cs (1996) cho biết: chiếm tỷ lệ cao nhất trong số các vi

khuẩn đường ruột gây tiêu chảy là E.coli (45,6%) Cũng theo tác giả, vi khuẩn yếm khí C perfringens gây bệnh khi có điều kiện thuận lợi và khi nó trở thành

vai trò chính

Cù Hữu Phú và cs (2004) khi nghiên cứu về E.coli và Salmonella ở lợn tiêu chảy cho biết tỷ lệ phát hiện E.coli độc trong phân là 80 -90% số mẫu xét

nghiệm

Phan Thanh Phượng và cs (1996) vi khuẩn yếm khí C perfringens là một

trong những tác nhân gây bệnh quan trọng trong hội chứng tiêu chảy của lợn ở lứa tuổi từ 1-120 ngày tuổi Ở lợn con theo mẹ, tỷ lệ mắc bệnh do vi khuẩn này gây ra có thể đến 100% và tỷ lệ chết là 60%

Hồ Văn Nam và cs (1997) nhấn mạnh: vi khuẩn đường ruột có vai trò không thể thiếu được trong hội chứng tiêu chảy

Nguyễn Như Pho (2003) cho rằng, khả năng gây bệnh của các loại vi khuẩn đối với lứa tuổi lợn khác nhau Đối với lợn con theo mẹ, lợn sau cai sữa hoặc giai đoạn đầu nuôi thịt thì tỷ lệ mắc tiêu chảy do Salmonella cao hơn; giai

đoạn lúc sơ sinh đến sau cai sữa thường do E coli; lứa tuổi 6-12 tuần tuổi thì thường do xoắn khuẩn Treponema hyodysenterriae; vi khuẩn yếm khí C

perfringens thường gây bệnh nặng cho lợn con theo mẹ trong khoảng 1 tuần tuổi đến cai sữa

1.1.2.4 Tiêu chảy do virus

Virus cũng là tác nhân gây bệnh tiêu chảy ở lợn Sự xuất hiện của virus làm tổn thương niêm mạc ruột, làm suy giảm sức đề kháng của cơ thể và thường gây ỉa chảy ở dạng cấp tính với tỷ lệ chết cao

8

Khooteng Hoat (1995) đã thống kê có hơn 10 loại virus có tác động làm

tổn thương đường tiêu hóa, gây viêm ruột ỉa chảy như: Enterovirus, Rotavirus,

Coronavirus, virus dịch tả lợn

Rotavirus và Coronavirus là những virus gây tiêu chảy quan trọng ở gia

súc non mới sinh như nghé, dê, cừu con, lợn con, ngựa con và đặc biệt là bê do những virus này có khả năng phá hủy màng ruột và gây tiêu chảy nặng (Archie.H, 2000)

Lecce J.G (1976); Nilson O (1984) nghiên cứu về virus gây bệnh đường tiêu hóa đã xác định được vai trò của Rotavirus trong hội chứng tiêu chảy ở lợn

Các nghiên cứu trong nước của Nguyễn Như Pho (2003) cũng đã cho

rằng: Rotavirus và Coronavirus gây bệnh tiêu chảy chủ yếu cho lợn con trong

giai đoạn theo mẹ, với các triệu chứng tiêu chảy cấp tính, nôn mửa, mất nước với

tỷ lệ mắc bệnh và tỷ lệ chết cao

Theo Bergenland H.U (1992) trong số những mầm bệnh thường gặp ở lợn trước và sau cai sữa bị bệnh tiêu chảy có rất nhiều loại vi rút, 29% phân lợn bệnh tiêu chảy phân lập được Rotavirus, 11,2% có vi rút TGE, 2% có Enterovirus, 0,7% có Parvovirus

1.1.2.5 Tiêu chảy do nấm mốc

Thức ăn khi chế biến hoặc bảo quản không đúng kỹ thuật dễ bị nấm mốc

Một số loài như: Aspergillus, Penicillium, Fusarium…có khả năng sản sinh

nhiều loại độc tố Afratoxin (Afratoxin B1, B2, G1, G2, M1)

Độc tố Afratoxin gây độc cho người và gia súc gây bệnh nguy hiểm nhất cho con người là ung thư gan, hủy hoại gan, độc cho thận, sinh dục và thần kinh Afratoxin gây độc cho nhiều loài gia súc, gia cầm, mẫn cảm nhất là vịt, gà, lợn và các gia súc khác Lợn khi nhiễm độc thường bỏ ăn, thiếu máu, vàng da, ỉa chảy,

ỉa chảy ra máu Nếu trong khẩu phần có 500 - 700µg Afratoxin/kg thức ăn sẽ làm cho lợn con chậm lớn, còi cọc, giảm sức đề kháng với các bệnh truyền nhiễm khác (Lê Thị Tài và cs., 1997)

9

1.1.2.6 Tiêu chảy do ký sinh trùng

Có nhiều loại ký sinh trùng gây bệnh tiêu chảy ở lợn như: Cầu trùng

Eimeria, Isospora suis, Crystosporidium, Ascaris suum, Trichuris suis…hoặc một số loài giun tròn lớp Nematoda (Ascaris suum, Trichuris suis, Strongloides,

Haemonchus, mecistocirrus…)

Bệnh do Isospora suis, Crytosporidium thường tập trung vào giai đoạn

lợn con từ 5 - 25 ngày tuổi, còn ở lợn trên 2 tháng tuổi do cơ thể đã tạo được miễn dịch đối với bệnh cầu trùng, nên lợn chỉ mang mầm bệnh mà ít khi xuất hiện triệu chứng tiêu chảy (Nguyễn Như Pho, 2003)

Cầu trùng và một số loại giun tròn (giun đũa, giun tóc, giun lươn) là một trong những nguyên nhân gây tiêu chảy ở lợn sau cai sữa nuôi trong các hộ gia đình tại Thái Nguyên (Nguyễn Thị Kim Lan và cs., 2006a) Đặc điểm chủ yếu của tiêu chảy do ký sinh trùng là con vật mắc bệnh tiêu chảy nhưng không liên tục, có sự xen kẽ giữa tiêu chảy và bình thường, cơ thể thiếu máu, da nhợt nhạt, gia súc kém ăn, thể trạng sa sút

Tác giả Nguyễn Kim Thành (1999) cho biết trong đường ruột của lợn tiêu chảy đã tìm thấy giun đũa ký sinh với lượng không nhỏ

Theo Phan Địch Lân và Phạm Sỹ Lăng (1995) giun đũa ký sinh trong ruột non của lợn là loài Ascarissuum Giun đũa lợn phát triển và gây bệnh không cần vật chủ trung gian, lợn trực tiếp nuốt phải trứng (ấu trùng gây nhiễm), khi vào cơ thể lợn trứng sẽ thực hiện quá trình di hành và phát triển thành giun trưởng thành

ký sinh ở đường tiêu hóa

Theo Phạm Văn Khuê và Phạm Lục (1996) sán lá ruột lợn và giun đũa lợn trong đường tiêu hóa, chúng làm tổn thương niêm mạc đường tiêu hóa gây viêm ruột ỉa chảy

Như vậy, có thể thấy có rất nhiều nguyên nhân gây tiêu chảy, nhưng theo chuyên gia chuyên nghiên cứu về bệnh tiêu chảy ở lợn như Lê Văn Tạo (1993) thì dù nguyên nhân nào gây tiêu chảy cho lợn thì cuối cùng cũng là quá trình nhiễm khuẩn, vi khuẩn kế phát làm viêm ruột, tiêu chảy nặng thêm, có thể dẫn đến chết hoặc tiêu chảy viêm ruột mạn tính

bú sữa mẹ, khả năng nguyên nhân gây bệnh là TGEV và các tác nhân gây bệnh đường tiêu hóa khác cũng đã được loại trừ Khi đó, tên EVD loại 2 được đưa ra

để phân biệt với EDV loại 1 là bệnh bùng phát năm 1971 với sự khác nhau đó là lợn con đang bú mẹ chỉ mắc EDV loại 2 mà không mắc EDV loại 1

Năm 1978, Coronavirus đã được chứng minh là nguyên nhân gây ra các đợt bùng phát EVD loại 2 Kết quả gây bệnh thực nghiệm cho lợn bằng một chủng virus phân lập được (CV777) cho thấy bệnh tích đường tiêu hoá biểu hiện điển hình trên cả lợn con và lợn vỗ béo Rõ ràng là Coronavirus này liên quan tới

sự bùng phát EVD loại 1 và loại 2, từ đó tên bệnh đã được đổi thành “tiêu chảy thành dịch trên lợn” viết tắt theo tên tiếng anh là PED (Porcine Epidemic Diarrhea)

Các virut này thuộc chi Coronavirus, một virut rất quan trọng trong thú y, gây nhiều dịch bệnh nghiêm trọng trên nhiều loài động vật (Murphy và ctv, 1999) PED do porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) gây ra, được phát hiện đầu tiên ở Anh quốc vào năm 1971, lúc đầu chỉ xảy ra trên heo cai sữa (phân loại

là PED-type I) Năm 1976, PED được quan sát trên heo mọi lứa tuổi đặc biệt ảnh hưởng nặng nề trên heo con theo mẹ (phân loại là PED-type II) PED khó phân

biệt với TGE qua triệu chứng lâm sàng và bệnh học Khi bệnh này bùng phát, những nhà chuyên môn mô tả bệnh giống như viêm dạ dày ruột truyền nhiễm (TGE-like) Tuy nhiên, căn bệnh PEDV được xác định là một Coronavirus khác với virut TGE PED-type I và PED-type II cũng được chứng minh đều do cùng một virut gây ra vào năm 1982

Hiện nay, bệnh đã được xác nhận có mặt ở một số nước châu Âu, Trung Quốc, Hàn Quốc và Nhật Bản (Debouck P và cộng sự, 1981) Tuy nhiên, ở châu

Á, dịch lại xảy ra nghiêm trọng với tỷ lệ tử vong cao trên lợn ở tất cả các lứa tuổi,

và không thể phân biệt chúng về mặt lâm sàng với bệnh TGE thể cấp tính

1.2.2 Tình hình nghiên cứu bệnh tiêu chảy thành dịch do virus PED gây ra ở trong nước

Ở Việt Nam, hiện tại có rất ít nghiên cứu tiến hành về bệnh PED Bệnh được phát hiện từ năm 2009 (Đỗ Tiến Duy, Nguyễn Tất Toàn, 2011) Sau đó, bệnh ngày càng lan rộng và bùng phát ở nhiều khu vực Bệnh gây thiệt hại nặng

nề cho các trang trại bởi tỉ lệ mắc toàn đàn rất cao (gần 100%), các triệu chứng lâm sàng chủ yếu gồm: chán ăn, nôn, tiêu chảy, tỷ lệ chết cao ở lợn con theo mẹ Theo thống kê không chính thức của phòng xét nghiệm nhanh công ty C.P Việt Nam trong năm tháng đầu năm 2010 cả nước có 31 trại bị nhiễm PED Các trại bị nhiễm bệnh này chủ yếu tập trung ở các tỉnh nam bộ như Đồng Nai, Lâm Đồng, Bình Phước, Bà Rịa – Vũng Tàu

Bệnh tiêu chảy do virus PED gây ra có tính lây lan nhanh tuy nhiên chưa

có loại vacxin nào phòng bệnh thì nguy cơ tái phát, nguy cơ biến chủng của virus cũng là vấn đề rất đáng lo ngại Trước tình hình đó, việc hiểu biết về đặc điểm căn bệnh và chẩn đoán nhanh là hết sức cấp thiết trong phòng chống dịch bệnh, bảo vệ sức khỏe vật nuôi và kinh tế cho người chăn nuôi

1.3 Căn bệnh

1.3.1 Phân loại và hình thái của virus gây bệnh PED

Dựa trên đặc điểm kháng nguyên và di truyền, virus PED (PEDV) được xếp vào chi Coronavirus, họ Coronaviridae, cùng với TGEV, coronavirus ở mèo, chó và coronavirus 229E ở người Hạt PEDV mang những điểm đặc trưng của họ

Coronaviridae Theo phân loại về huyết thanh học, người ta xác định vius PED hiện mới chỉ có 1 serotype Các chủng PEDV phân lập từ châu Âu, Hàn Quốc và Trung Quốc đều tương đồng về mặt huyết thanh với với chủng CV777 phân lập

từ thực địa ở Bỉ năm 1978

Hình thái của PEDV trong tế bào biểu mô đường tiêu hoá tương tự như các coronavirus khác (Ducatelle R và cộng sự, 1982) Virus có một nhân đậm đặc điện tử với quầng sáng ở giữa và những phần toả ra từ nhân dạng chuỳ dài xấp xỉ 20nm Hạt virus xác định từ mẫu phân có hình thái đa dạng và đường kính biến đổi từ 90 đến 190 nm (hình 1, 2) (Pensaert MB và cộng sự, 1981) Virus nhân lên thông qua việc nẩy chồi từ các màng bên trong bào tương tế bào vật chủ

Hình 1.1 Những không bào trong bào

tương của một tế bào hấp thu ở ruột

non lợn, chứa các hạt virus PED có

Nguồn: cdn.com/content/image/1- s2.0-S0264410X99000596-gr1.jpg

http://ars.els-1.3.2 Cấu trúc phân tử của virus gây bệnh

Về đặc điểm cấu tạo phân tử, PEDV là virus có vỏ bao bọc, bộ gen là sợi RNA đơn dương, kích thước khoảng 28kb với mũ 5’ và đuôi polyA 3’ Bộ gen của virus gồm một vùng không dịch mã đầu (UTR) 5’, một UTR đầu 3’, ít nhất 7 khung đọc

mở (ORF) mã hoá cho 4 protein cấu trúc gồm gai (S), vỏ (E), màng (M), và

nucleocapsid (N) và 3 protein không cấu trúc (enzym tái bản replicases 1a, 1b và ORF3) Những khung đọc mở này được sắp xếp theo trình tự: 5’-replicase (1a, 1b) – S – ORF3 – E – M – N – 3’ (hình 3) (F.A Murphy và cộng sự, 1999)

Gen polymerase gồm 2 khung đọc mở (Open Reading Frame – ORF) 1a

và 1b, chiếm 2/3 bộ gen tính từ đầu 5’ và mã hoá cho các polyprotein tái bản không cấu trúc (replicase 1a và 1b) Các gen mã hoá cho protein cấu trúc chính như S (150-220 kDa), E (7kDa), M (20-30kDa) và N (58kDa) nằm ở vị trí tiếp nối gen polymerase Gen ORF3 là một gen phụ trợ, nằm giữa các gen cấu trúc

Nó mã hoá cho một protein bổ trợ, số lượng và trình tự của các gen thay đổi ở các coronavirrus khác nhau (K Narayanan và cộng sự, 2008)

Hình 1.3 Mô hình cấu trúc bộ gen virus PED

Protetin cấu trúc của PEDV tương tự như các coronavirus khác Virus có một protein gai (S) với trọng lượng phân tử khoảng 180-200 kDa, một protein màng (M) 27-32 kDa, một protein nucleocapsid gắn với RNA nặng 57-58 kDa (Duarte M và cộng sự, 1994)

Protein S của PEDV là glycoprotein loại 1 gồm 1383 amino acid (aa) Nó chứa một chuỗi peptid tín hiệu (1-18aa), các epitop trung hoà (499-638, 748-

755), 764-771, và 1368-1374), một vùng xuyên màng (1334 – 1356), và một vùng ngắn nằm trong bào tương Protein S cũng có thể được chia thành vùng S1 (1-789 aa) và vùng S2 (790-1383 aa) dựa trên tính tương đồng của nó ở coronavirus khác nhau Giống như các protein S của coronavirus khác, protein S của PEDV là một loại gai glycoprotein (kháng nguyên bề mặt) trên bề mặt virus, chúng đóng vai trò quan trọng trong việc điều hoà tương tác với các glycoprotein thụ thể đặc hiệu trên tế bào vật chủ trong quá trình xâm nhập, kích thích tạo kháng thể trung hoà ở vật chủ tự nhiên Ngoài ra, glycoprotein S cũng liên quan tới sự thích nghi sinh trưởng trong điều kiện phòng thí nghiệm và sự giảm độc lực khi gây bệnh trên động vật (Park và cộng sự, 2007) Để đạt kết quả tốt hơn, cần tiến hành các nghiên cứu sâu hơn về cấu trúc virus PEDV để làm rõ mối quan hệ di truyền, sự đa dạng về chủng, tình trạng dịch tễ học của PEDV trên thực địa và mối quan hệ giữa các dạng đột biến với chức năng của virus

Protein M là thành phần vỏ lớn nhất của virus PED, glycoprotein cấu trúc màng với một đầu tận cùng gắn amin ngắn phía ngoài virus và một đầu tận cùng gắn carboxy ở bên trong Protein M không chỉ đóng vai trò quan trọng trong chu trình lắp ráp virus mà còn trong việc tạo ra kháng thể trung hoà virus với sự có mặt của bổ thể Protein M có thể đóng một vai trò trong quá trình tạo ra α-interferon (α-IFN Việc đồng thời biểu hiện protein M và N cho phép tạo thành các hạt giả virus có khả năng biểu lộ hoạt tính sinh interferon tương tự như hạt virus hoàn chỉnh Việc tiến hành thêm các nghiên cứu về glycoprotein M sẽ làm tăng thêm hiểu biết của chúng ta về mối quan hệ di truyền, sự đa dạng giữa các chủng PEDV và tình trạng dịch tễ của PEDV trên thực địa

Protein N là một phosphoprotein cơ bản gắn với RNA virus, cung cấp nền tảng cấu trúc cho các nucleocapsid xoắn kép Các epitop protein N được chứng minh là đóng vai trò quan trọng trong việc gây ra miễn dịch trung gian tế bào protein N có thể được sử dụng như một mục tiêu cho chẩn đoán sớm và chính xác PEDV

1.3.3 Sức đề kháng của virus gây bệnh PED

Về đặc tính lý hoá, virus mẫn cảm với ether, chroroform và không gây ngưng kết hồng cầu của nhiều loài Tỷ trọng của nó trong đường sucose là 1,18 mg/ml

PEDV bền ở khoảng pH 5,0 – 9,0 ở 4˚C và pH từ 6,5 – 7,5 ở 37˚C (Callebaut P, DeBouck P, 1981) Virus PED đã thích ứng với môi trường nuôi cấy bị mất khả năng lây nhiễm khi đun chúng tới 60˚C trong 30 phút, nhưng chúng khá bền ở 50˚C

1.4 Truyền nhiễm học

1.4.1 Loài vật mắc bệnh

Bệnh xảy ra ở loài lợn Lợn có thể mắc ở mọi lứa tuổi Trong nhiều ổ dịch

tỷ lệ lợn ốm lên đến 100%, tỷ lệ chết trung bình ở lợn con là 50% nhưng cũng có thể rất cao đến 100%

- Nếu lợn con mắc bệnh ở độ tuổi 0 - 5 ngày tuổi: tỷ lệ chết 100%

- Nếu lợn con mắc bệnh ở độ tuổi 6 - 7 ngày tuổi: tỷ lệ chết khoảng 50%

- Nếu lợn con mắc bệnh ở độ tuổi > 7 ngày tuổi: tỷ lệ chết khoảng 30%

1.4.2 Phương thức truyền lây của virus PED

Về phương thức truyền lây, đường phân có thể là phương thức chủ yếu để virus truyền sang vật chủ khác PED thể cấp tính thường xảy ra ở thời điểm 4-5 ngày sau khi lợn được bán hoặc mua về Virus có thể xâm nhập vào trại thông qua lợn nhiễm virus được chuyển về hoặc các dụng cụ có mang virus như xe tải, ủng PEDV không khác nhiều với TGEV về đường truyền lây, nhưng virus này

có vẻ tồn tại lâu hơn trong các trang trại sau khi dịch PED cấp tính đã qua đi Khi dịch xảy ra ở trại lợn sinh sản, virus có thể được bài thải từ đàn mắc bệnh hoặc trở thành dịch địa phương Một chu kỳ dịch địa phương có thể được hình thành nếu số lứa lợn được sinh ra và cai sữa trong trại đủ lớn để duy trì sự lưu hành của virus thông qua việc lây nhiễm giữa các lứa kế tiếp nhau khi lợn con mất khả năng miễn dịch lúc cai sữa PEDV có thể gây ra tiêu chảy dai dẳng trên lợn con sau cai sữa ở những trại như vậy (Nguyễn Văn Điệp và Nguyễn Thị Lan, 2012)

1.4.3 Cơ chế gây bệnh

Cơ chế sinh bệnh của PED được nghiên cứu trên lợn con không được uống sữa đầu Cho lợn con 3 ngày tuổi uống virus PED chủng CV777 (Debouck

P và cộng sự, 1981) sau khoảng 22 đến 36 giờ lợn bắt đầu nôn và tiêu chảy Vị trí

và sự nhân lên của virus được xác định thông qua kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang và kính hiển vi điện tử PEDV nhân lên trong bào tương của các tế bào lông nhung, phá huỷ các tế bào biểu mô và làm ngắn lông nhung niêm mạc ruột,

tỷ lệ chiều cao giữa lông nhung và tuyến ruột có thể giảm từ 7:1 xuống còn 3:1 (Pospischil A và cộng sự, 1981) Các tế bào biểu mô hấp thu ở lông nhung rất mẫn cảm với PEDV, những tế bào biểu mô nhiễm virus có thể được quan sát sau 12-18 giờ gây nhiễm, rõ nhất sau khoảng 24 đến 36 giờ, tuy nhiên không quan sát thấy có sự phá hủy tế bào biểu mô ở kết tràng Đặc điểm sinh bệnh của PEDV ở ruột non của lợn con rất giống với TGEV So với TGEV, sự nhân lên và lây lan trong ruột non của virus PED diễn ra chậm hơn và thời gian nung bệnh lâu hơn

Virus

Nhiễm vào đường miệng

Nhân lên biểu mô ruột non, dạ dày

Phá hủy hệ thống lông

nhung ruột

Mất và cùn vi nhung

mao

Giảm hoạt động của Enzyme

bề mặt biểu mô ruột

Hội chứng giảm hấp thu

(mất nước nặng, chết)

Cơ chế sinh bệnh của PEDV ở lợn giai đoạn lớn hơn vẫn chưa được nghiên cứu chi tiết, nhưng bằng kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang có thể quan sát thấy virus có mặt trong tế bào biểu mô kết tràng của lợn mắc bệnh tự nhiên hoặc được gây nhiễm Ý nghĩa của việc virus xâm nhiễm ở kết tràng có làm cho bệnh nặng hơn hay không vẫn chưa được rõ Hiện vẫn chưa có cơ chế thích hợp nào được đưa ra để lý giải hiện tượng lợn chết đột ngột kèm theo việc hoại tử cơ lưng cấp tính quan sát thấy ở lợn vỗ béo và lợn trưởng thành (Nguyễn Văn Điệp và Nguyễn Thị Lan, 2012)

có biểu hiện tiêu chảy và lợn mới nhập về thường phát bệnh

Một báo cáo khác cho thấy, tại một trại nuôi lợn thịt mới nhập lợn về từ nhiều nguồn khác nhau hoặc trong giai đoạn nuôi vỗ béo, nếu PED bùng phát ở thể cấp tính, trong vòng một tuần, tất cả lợn sẽ có biểu hiện tiêu chảy Lợn có biểu hiện chán ăn, mệt mỏi, phân rất loãng, chứa nhiều nước Biểu hiện về mặt lâm sàng ở lợn mắc PED đang trong giai đoạn nuôi vỗ béo có thể nặng hơn so với mắc TGE Lợn thường có biểu hiện đau vùng bụng nhiều hơn Sau khoảng 7-

10 ngày, lợn sẽ hồi phục Tỷ lệ tử vong ở lợn trong giai đoạn vỗ béo thường từ 3%, lợn chết nhanh, thường ở giai đoạn mới bắt đầu tiêu chảy hoặc trước khi có biểu hiện tiêu chảy Bệnh tích đại thể thông thường ở những lợn này là hoại tử cấp tính ở cơ lưng Tỷ lệ chết cao nhất được thấy ở những trại có lợn giống mẫn cảm và chịu nhiều stress (Nguyễn Văn Điệp và Nguyễn Thị Lan, 2012)

1.5.2 Bệnh tích

Bệnh tích đại thể và vi thể của lợn mắc PED tương tự như ở bệnh TGE

Dạ dày trống rỗng do lợn nôn, và ống dưỡng chấp không chứa nhiều dịch dưỡng

do sự kém hấp thu ở ruột Các đoạn ruột non chứa đầy dịch, căng phồng, thành ruột mỏng tới mức có thể nhìn thấy do sự teo lại của tầng niêm mạc Chất chứa trong ruột non lợn cợn Ngoài các bệnh tích tương tự như TGE, sự hoại tử cấp ở

cơ lưng cũng được báo cáo

Lợn con đang theo mẹ chết do PED, xác gầy, khô do tiêu chảy nặng, phần mông dính nhiều phân vàng Ruột căng phồng, đầy dịch, màu vàng, chứa những cục sữa chưa tiêu Ngoài ra còn thấy thành ruột mỏng và trong suốt có thể do lông nhung bị bào mòn, xuất huyết, chứa nhiều chất lỏng thối, hạch ruột sưng thủy thũng, đặc biệt là ở không tràng và hồi tràng, dẫn theo Đào trọng Đạt và cs (1995) Hạch lâm ba màng treo ruột xuất huyết nhẹ Lát cắt ngang ruột non của lợn bị nhiễm virus PED Lông nhung ruột non của lợn bị ngắn lại

Về mặt vi thể, sự hình thành không bào to, rõ trong bào tương tế bào biểu

mô và sự bong tróc của các tế bào này làm cho lông nhung ngắn và dồn lại, hoà lẫn vào nhau rõ rệt, tuy rằng các biểu hiện này không trầm trọng bằng TGE Ở kết tràng, chưa có bệnh tích vi thể nào được báo cáo Điều thú vị là các nghiên cứu siêu vi thể đã cho thấy có sự hiện diện rõ rệt của các hạt virus bên trong bào tương tế bào và sự thay đổi tế bào ở các tế bào biểu mô ruột non và kết tràng (Ducatelle R và cộng sự, 1982) Những sự thay đổi cấu trúc siêu vi thể được khởi đầu đặc trưng bằng sự mất đi của các bào quan, vi nhung, lưới tận và phần nhô ra của bào tương tế bào hấp thu vào trong xoang ruột Sau đó, các tế bào trở nên dẹt hơn, liên kết vòng bịt giữa các tế bào biểu mô mất đi và tế bào được giải phóng vào bên trong lòng ống ruột

1.6 Chẩn đoán

Chẩn đoán bệnh PED không đơn thuần chỉ dựa vào các triệu chứng lâm sàng và biến đổi bệnh lí của mô bệnh học Do biểu hiện của các tác nhân gây bệnh tiêu chảy trên lợn là giống nhau, đặc biệt không thể phân biệt được bệnh PED cấp tính và bệnh TGE dù lợn mắc ở lứa tuổi nào, vì vậy việc chẩn đoán

trong phòng thí nghiệm là rất cần thiết để xác định PEDV Nhiều kĩ thuật trong phòng thí nghiệm đã được sử dụng để xác định sự có mặt của PEDV bao gồm:

Chẩn đoán huyết thanh học

Phản ứng miễn dịch gắn với enzyme (ELISA)

Phương pháp kháng thể huỳnh quang trực tiếp phát hiện virus (IF)

Hóa mô miễn dịch

Tuy nhiên những kỹ thuật này khá tốn thời gian và có độ nhạy cũng như

độ đặc hiệu không cao RT-PCR xác định sự có mặt của PEDV thường xuyên hơn các phương pháp khác Tuy nhiên, dù chỉ áp dụng được trên các mô cố định bằng Formalin, hóa mô miễn dịch và lai tại chỗ có thể là một công cụ hiệu quả để xác định kháng nguyên PEDV và axit nucleic của virus

1.7 Kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction)

1.7.1 Nguyên lý của phản ứng PCR

Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) được Kary mullis và cộng sự phát minh ra vào năm 1985 Kỹ thuật này tiếp tục được hoàn thiện, phát triển thông qua sự phân lập và sản xuất thành công enzym tổng hợp DNA chịu nhiệt từ

vi khuẩn Thermus aquaticus và sự thiết kế thành công các máy chu kỳ nhiệt cho

phép thay đổi nhanh chóng và chính xác nhiệt độ cho từng giai đoạn phản ứng Trong PCR thông thường sau 20 – 30 vòng có tới hàng triệu phân tử được copy

từ một phân tử DNA (1 đoạn gen)

Kỹ thuật RT-PCR (Reverse Transcriptase -Polymerase Chain Reaction) trước khi tiến hành PCR thông thường RNA cần được chuyển thành cDNA nhờ enzyme Reverse Transcriptase (enzym sao mã ngược) Phương pháp PCR như vậy được gọi là RT-PCR Phương pháp này được áp dụng rộng rãi trong chẩn đoán nhanh và định type virus có nhân di truyền là RNA

dGTP, dCTP, dTTP), cần có enzym DNA polymerase và một số điều kiện cần

thiết cho sự tổng hợp như Mg2+

Tuy nhiên khác với sự tổng hợp trong cơ thể, việc mở xoắn kép vốn được

thực hiện nhờ enzym helicase nay được thay thế bằng xử lý nhiệt độ cao kết hợp với sử dụng enzym DNA polymerase chịu nhiệt và hệ thống điều nhiệt thích hợp

cho từng giai đoạn phản ứng với những đoạn mồi được thiết kế hoàn toàn chủ động, dẫn đến sự tạo thành số lượng sản phẩm (đoạn DNA được nhân) rất lớn trong khoảng thời gian ngắn và phục vụ hiệu quả mục đích của con người

1.7.2 Các bước tiến hành phản ứng PCR

Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ được lặp đi lặp lại mỗi chu kỳ gồm 3 bước:

Bước 1: Phân tử DNA được biến tính ở 94 - 95 0C trong khoảng thời gian từ

30 giây đến 1 phút, trong quá trình biến tính DNA sợi kép được dãn xoắn thành 2 đoạn DNA mạch đơn

Bước 2: Là giai đoạn mồi bắt cặp bổ sung với DNA sợi khuôn hay còn gọi là

giai đoạn lai Nhiệt độ để mồi bắt cặp bổ sung với DNA sợi khuôn thường từ

400C – 70 0C, giai đoạn này kéo dài từ 30 giây đến 1 phút tuỳ thuộc vào mồi và DNA sợi khuôn tương ứng

Bước 3: Giai đoạn tổng hợp nên đoạn DNA mới ở giai đoạn này nhiệt độ

được nâng lên 72 oC đây là nhiệt độ thích hợp nhất cho DNA polymerase hoạt động để tổng hợp nên sợi ADN mới trên cơ sở mồi đã được bắt cặp bổ xung với DNA sợi khuôn Thời gian cho bước này có thể kéo dài từ 30 giây cho tới nhiều phút tuỳ thuộc vào độ dài của trình tự DNA cần khuếch đại

Bước 4: Hoàn thiện sản phẩm DNA dưới dạng sợi đôi

1.8 Kỹ thuật giải trình tự gen

Giải trình tự gen (DNA sequencing) là phương pháp xác định vị trí sắp xếp các nucleotide trong phân tử DNA Giải trình tự bộ gen người, động vật và vi sinh vật giúp chẩn đoán bệnh tật và nhiều ứng dụng trong thực tiễn sản xuất, phục vụ lợi ích con người Có 3 nhóm phương pháp giải trình tự gen chủ yếu: phương pháp Maxam và Gilbert, phương pháp dideoxy (còn gọi là phương pháp Sanger) và phương pháp giải trình tự gen bằng máy tự động

1.8.1 Giải trình tự DNA theo phương pháp Maxam và Gilbert

Nguyên lý:

Năm 1977 Alan Maxam và Walter Gilbert phát minh phương pháp giải trình

tự theo phương pháp hóa học Tạo mạch khuôn DNA trên cơ sở đánh dấu đồng vị phóng xạ P32 đầu 5’và biến tính phân tử DNA thành các mạch đơn không tự xoắn lại với nhau Các mạch đơn đã đánh dấu phóng xạ được phân vào các ống nghiệm khác nhau, thực hiện kỹ thuật xử lý hóa học đặc hiệu để phân cắt các

mạch đơn thành các đoạn ngắn hơn kém nhau một nucleotide, Cuối cùng, điện di sản phẩm phân giải DNA thu được trong gel polyacrylamide Di động của các đoạn DNA trong điện trường phụ thuộc vào độ dài của chúng, nhờ đó xác định được trình tự nucleotide Phương pháp này hầu như không còn được sử dụng ngày nay do độ chuẩn xác kém, cần phải thực hiện nhiều lần và loại bỏ các sai sót

để chọn một kết quả gần đúng nhất nhưng nó là tiền đề cho các phương pháp giải trình tự khác

Các bước thực hiện

Bước 1: Đánh dấu đồng vị phóng xạ P32 đầu 5’của mạch khuôn, biến tính và điện

di tách lấy 1 mạch DNA làm mạch khuôn để xử lý hóa học

Bước 2: Thực hiện các phản ứng hóa học đặc hiệu

Có thể sử dụng 4-5 ống nghiệm để thực hiện các phản ứng hóa học đặc hiệu khác nhau

1 Dimethyl sunfat Cắt tại G

4 Hydrazin + NaCl Cắt tại C

Trong mỗi ống nghiệm có hàm lượng nhất định các mạch đơn DNA khuôn

đã đánh dấu phóng xạ và được xử lý hóa học đặc hiệu khác nhau tạo ra các đoạn DNA bị cắt dài ngắn khác nhau

Bước 3: Lấy sản phẩm xử lý trong mỗi ống nghiệm đem chạy điện di, hiện hình phóng xạ và xác định kết quả

Bước 4: Tập hợp kết quả thu được ở tất cả các ống nghiệm, thu được các đoạn polynucleotide dài ngắn hơn kém nhau 1 nucleotide từ đó xác định được trình tự của mạch DNA khuôn

1.8.2 Giải trình tự DNA theo phương pháp dideoxy

Nguyên lý

Xác định trình tự gen theo phương pháp dideoxy do Frederick Sanger, Smith và Coulson phát hiện năm 1977 (còn gọi là phương pháp giải trình tự gen

bằng enzyme hay phương pháp Sanger) dựa trên cơ chế tổng hợp DNA trong cơ thể sinh vật F sanger đã giải trình tự hoàn chỉnh bộ gen của thực khuẩn thể X174 kí sinh vi khuẩn E.coli (1977), là bộ gen đầu tiên được xác định trình tự Trong phương pháp này tác giả sử dụng các nhân tố kết thúc đặc hiệu quá trình kéo dài DNA khi tổng hợp Nhân tố này là 2,3 dideoxynucleosid triphosphat (ddNTP) Các phân tử này (ddNTP) có thể kết hợp vào chuỗi DNA đang tổng hợp một cách bình thường qua nhóm 5 triphotphas nhưng lại không tiếp tục kết hợp được với phân tử deoxynucleosid triphosphat (dNTP) tiếp theo Như vậy khi trộn lẫn lượng nhỏ ddNTP với 4 loại dNTP rồi tiến hành tổng hợp DNA nhờ enzyme polymeraze Kết quả sẽ cho một loạt các đoạn DNA được kết thúc một cách đặc hiệu bởi gốc dideoxy nucleotid và sẽ thu được các đoạn DNA có kích thước hơn kém nhau 1 nucleotide Chạy điện di các đoạn ta có thể xác định được trình tự đoạn DNA nghiên cứu

Các bước thực hiện

Bước 1: Biến tính DNA khuôn, điện di trên gel polyacrylamid (có bổ sung ure)

thu các mạch đơn DNA

Bước 2: Chuẩn bị phản ứng tổng hợp DNA

Lấy 4 ống eppendorf cho các thành phần cần thiết vào mỗi ống ( DNA khuôn, mồi có đánh dấu phóng xạ, enzyme DNA polymeraze và các dNTP (dATP, dTTP, dGTP, dCTP) và dung dịch đệm thích hợp) Bổ sung vào mỗi ống tương ứng một lượng nhỏ (1%) một loại ddNTP nhất định (ddATP, ddTTP, ddGTP, ddCTP)

Bước 3: Thực hiện phản ứng tổng hợp DNA với các thiết bị tuần hoàn nhiệt Bước 4: Điện di kết quả, so sánh các kết quả các chuỗi mạch đơn DNA được

tổng hợp để xác định trình tự của mạch khuôn

Phương pháp giải trình tự gen do F Sanger và cộng sự phát minh có độ chính xác tương đối cao, là cơ sở của các máy giải trình tự gen tự động

Máy thực hiện tổng hợp các mạch đơn DNA mới trên cả 2 mạch khuôn DNA, đồng thời sử dụng các phần mềm tính toán trên máy tính để sử lý kết quả giúp kiểm soát được các sai sót, đảm bảo độ chính xác cao

Các bước thực hiện

Bước 1: Chuẩn bị DNA khuôn

Bước 2: Chuẩn bị các điều kiện cần thiết cho phản ứng tổng hợp DNA và thực

hiện nhân DNA bằng thiết bị PCR

Bước 3: Nạp sản phẩm PCR vào máy giải trình tự gen và chạy máy Trong quá

trình hoạt động của máy các nucleotide được kiểm soát nhờ detecter báo về bộ phận xử lý của máy, phần mềm xử lý kết quả và vẽ đồ thị của các loại nucleotide

đi qua detecter

Bước 4: Phân tích kết quả từ các dự liệu do máy tính cung cấp, so sánh kết quả

xác định trình tự ở cả 2 mạch đơn mới, đồng thời căn cứ vào đồ thị để sửa các sai sót và chọn kết quả đúng nhất

Chương 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu nghiên cứu

Lợn nuôi tại một số trang trại chăn nuôi tại Hà Nội và một số tỉnh phía bắc Việt Nam: Hải Dương, Hưng Yên, Bắc Ninh, Thái Bình, Hải Phòng, Hà Nội, Vĩnh Phúc, Sơn La

2.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

Địa điểm nghiên cứu

Phòng thí nghiệm bộ môn Bệnh lý – Khoa Thú y – Học viện Nông nghiệp Việt Nam

Phòng thí nghiệm Trọng điểm CNSH Thú y – Khoa Thú y – Học viện Nông nghiệp Việt Nam

Thời gian nghiên cứu: Nghiên cứu được tiến hành từ năm 2014 đến tháng 10 năm 2015

2.3 Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu chẩn đoán PED bằng kỹ thuật RT-PCR

- Nghiên cứu một số biểu hiện về triệu chứng lâm sàng của lợn mắc PEDV

- Nghiên cứu một số biến đổi bệnh lí đại thể, của một số cơ quan trên lợn mắc PEDV

- Nghiên cứu một số đặc điểm bệnh lý vi thể của lợn bị mắc PED

- Thực hiện giải trình tự gen M của các chủng virus PED nghiên cứu và tiến hành so sánh trình tự nucleotide và thứ tự axit amin được mã hóa của gen M của các chủng virus PED nghiên cứu và một số chủng tham chiếu

- Xây dựng cây phả hệ phân loại các nhóm virus PED đang lưu hành

2.4 Phương pháp nghiên cứu

Để tiến hành nghiên cứu và thực hiện được các nội dung đã đề ra của đề tài, chúng tôi đã sử dụng kết hợp những phương pháp nghiên cứu thường quy và hiện đại trong lĩnh vực thú y:

2.4.1 Phương pháp thống kê sinh học

Để xác định được các triệu chứng lâm sàng chủ yếu của lợn mắc PED, chúng tôi tiến hành quan sát, ghi chép, thống kê các biểu hiện của lợn khi xuất

hiện những dấu hiệu bệnh lý đầu tiên Đồng thời dựa vào các đặc điểm dịch tễ

học và những thông tin liên quan Tiến hành phân tích, thống kê để đưa ra những kết quả chính xác Xác định chính xác những triệu chứng lâm sàng chủ yếu và có

ý nghĩa vô cùng quan trọng cho các bước thí nghiệm tiếp theo

2.4.2 Phương pháp mổ khám

Mổ khám nhằm xác định được các biến đổi đại thể của các cơ quan, tổ chức của lợn mắc PED, cần tiến hành mổ khám những lợn có biểu hiện triệu chứng lâm sàng của bệnh Lợn bệnh được cố định cẩn thận, tiến hành lấy máu từ vịnh tĩnh mạch cổ Lột da và bộc lộ xoang ngực, xoang bụng, tách các cơ quan nội tạng khỏi cơ thể để quan sát và chụp ảnh Tiến hành thu mẫu các cơ quan như: phổi, tim, gan, lách, thận, ruột, hạch theo các mục đích nghiên cứu khác nhau Một số mẫu tươi được lấy cho vào ống eppendorf bảo quản lạnh để chạy

RT – PCR Một số mẫu bảo quản ngâm trong formol 10% (thời gian ngâm ít nhất một tuần) để nhuộm hóa miễn dịch và làm tiêu bản vi thể

2.4.3 Phương pháp làm tiêu bản vi thể theo quy trình tẩm đúc bằng Parafin, nhuộm Haematoxylin – Eosin (HE)

Từ những mẫu bệnh phẩm có các biến đổi đại thể cần tiến hành làm tiêu bản để xác định bệnh tích vi thể chủ yếu của bệnh Phương pháp làm tiêu bản vi thể theo quy trình tẩm đúc bằng parafin, nhuộm Haematoxilin – Eosin (HE) Các bước của quá trình làm tiêu bản vi thể như sau:

Chuẩn bị

Dụng cụ và hóa chất: Lọ chứa focmon 10%, dao, kéo, pank kẹp, cốc đựng hóa chất, phiến kính, máy đúc Block, khuôn đúc Block, tủ ấm 370C, tủ ấm 560C, máy cắt mảnh microtome, nước ấm 480C, xylem, paraffin, thuốc nhuộm Heamatoxilin, Eosin…

Lấy bệnh phẩm: Bệnh phẩm là dạ dày, ruột, hạch lâm ba, phổi, thận, gan, lách

Cố định bệnh phẩm: (mục đích là để giết chết những thành phần của tổ chức)

Ngâm miếng tổ chức vào dung dịch formol 10%, để sau 7 – 10 ngày là có thể sử dụng được

Vùi bệnh phẩm: (tạo ra chất nền cho tổ chức dễ cắt)

Tiến hành lần lượt các bước sau:

- Khử focmon: Lấy tổ chức ra khỏi bình focmon 10%, cắt thành các miếng

có chiều dài 4 – 5mm rồi cho vào khuôn đúc bằng nhựa Đem rửa dưới vòi nước chảy nhẹ trong 24h để rửa sạch focmon

- Đưa mẫu vào hệ thống máy chuyển đúc mẫu tự động trong 18 tiếng Lấy mẫu ra và tiến hành đúc block

Hệ thống máy chuyển đúc mẫu tự động gồm 12 bình

Bảng 2.1 Quy trình chạy mẫu bằng máy chuyển đúc mẫu tự động

Tiến hành: Đặt miếng bệnh phẩm nằm theo ý muốn vào chính giữa khuôn block, đổ nhanh parafin lỏng vào block Đặt khuôn đã đúc sang bàn lạnh của máy làm nguội block Để nguội từ từ đến khi đông cứng, đặc chắc là được

Cắt dán mảnh và cố định tiêu bản

Chuẩn bị: máy cắt, dao cắt, nước ấm 480C, phiến kính, pank kẹp

Cắt mảnh: Cắt bằng máy microtom với độ mảnh cắt khoảng 3 - 4µm, sao cho mảnh cắt không rách, nát phần tổ chức

Tãi mảnh: Sau khi cắt được, dùng pank kẹp mảnh cắt đặt vào nước lạnh, sau đó dùng phiến kính trong, sáng, không xước, sạch sẽ để hớt mảnh cắt cho sang nước ấm 480C rồi lấy kính vớt mảnh cắt sao cho vị trí mảnh cắt ở 1/3 phiến kính Sau đó để tủ ấm 370C đến khi bệnh phẩm khô là có thể đem nhuộm được

Nhuộm tiêu bản

Các bước tiến hành

+ Khử parafin: Cho tiêu bản qua hệ thống xylen gồm 3 lọ:

Xylen I: 3 – 5 phút Xylen II: 3 – 5 phút Xylen III: 3 – 5 phút + Khử xylen: Cho tiêu bản qua hệ thống cồn ethylic gồm 3 lọ:

Cồn I (cồn 900): 5 phút Cồn II (cồn 1000): 5 phút Cồn III (cồn 1000): 5 phút + Nhuộm Haematoxylin (nhuộm nhân): Sau khi đã rửa tiêu bản qua nước chảy trong 10 phút, lau khô nước xung quanh tiêu bản, nhỏ haematoxilin ngập tiêu bản trong 5 phút Sau đó đổ thuốc nhuộm đi rồi rửa nước chảy trong 10 phút cho hết Haematoxilin thừa Đem lau sạch nước xung quanh tiêu bản và vảy khô Kiểm tra màu sắc, nếu thấy tiêu bản có màu xanh tím là được

Nếu nhạt màu thì nhúng tiêu bản qua NaHCO3 1% (30 giây)

Nếu đậm quá thì nhúng tiêu bản vào lọ cồn axit (Cồn 960 + HCl tỷ lệ HCl là 1%) trong 30 giây

+ Nhuộm Eosin (nhuộm bào tương)

+ Tẩy cồn, làm trong tiêu bản: Lấy tiêu bản ra khỏi cồn 1000II, lau sạch cồn

ở xung quanh bệnh phẩm, rồi cho tiêu bản đi qua xylen

2.4.4 Phương pháp tách chiết RNA tổng số bằng hóa chất

Hóa chất cần chuẩn bị: Trizol, Chlorofom, Isopropyl ancohol propanol), Ethanol 75%, Rnase – free water

(2-Các bước tiến hành:

• Bước 1: Lấy 100 µl mẫu vào ống eppendorf 1.5 ml

• Bước 2: Bổ sung 1ml Trizol ống trên và lắc đều, giữ 5 phút ở nhiệt độ phòng

• Bước 3: Bổ sung thêm 0,2 ml Chlorofom vào ống và lắc đều giữ 3 phút ở nhiệt độ phòng

• Bước 4: Ly tâm dung dịch ở 12.000 vòng trong 15 phút ở 40C

• Bước 5: Chuyển 350 µl dịch nổi phía trên sang ống mới và bổ sung 500 µl isopropyl ancohol, giữ ở nhiệt độ phòng trong 10 phút

• Bước 6: Ly tâm dung dịch ở 12.000 vòng trong 10 phút ở 40C

• Bước 7: Loại bỏ dịch nổi và giữ lại cặn, bổ sung 1ml ethanol 75% lắc đều, ly tâm dung dịch ở 7.500 vòng trong 5 phút ở 40C

• Bước 8: Loại bỏ dịch nổi và giữ lại cặn để khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng

• Bước 9: Bổ sung 50µl Rnase –free water, lắc đều và bảo quản RNA

Tiến hành khuếch đại sản phẩm trong máy PCR theo chu kỳ nhiệt sau:

Bảng 2.3 Nhiệt độ và thời gian trong từng giai đoạn của chu kỳ nhiệt Giai đoạn Bước tổng hợp Nhiệt độ ( 0 C) Thời gian Chu kỳ

2.4.6 Phương pháp điện di kiểm tra sản phẩm PCR

• Bước 1: Chuẩn bị dung dịch đệm và bản gel

Dung dịch đệm thường được sử dụng trong điện di agarose và polyacrylamid là TBE hoặc TAE, trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng TBE và agarose để tạo bản gel

Bản gel được chuẩn bị bằng dung dịch đệm TBE 1X hòa tan với 1,2 gram agarose đặt trong lò vi sóng ở 1000C trong vòng 5 phút, đổ vào khuôn các lược được cài sẵn để tạo bản gel với các giếng tra mẫu cần điện di Khi bản gel đã đông cứng đặt bản gel vào bể điện di và bổ sung dung dịch đệm TBE ngập bản gel khoảng 3 – 5 mm

• Bước 2: Tra mẫu điện di

Thêm 2 µl loading dye vào 8 µl sản phẩm RT- PCR, trộn đều hỗn dịch bằng pipet

và chuyển vào các giếng trong bản thạch Điện di đồng thời cả thang chuẩn DNA (marker), thường sử dụng 4-6 µl DNA Marker

• Bước 3: Chạy điện di

Nguồn điện trong điện di thường sử dụng ở hiệu điện thế 100V cường độ 100mA, thời gian chạy điện di trong 30 phút

• Bước 4: Nhuộm bản gel và đọc kết quả

Kết thúc điện di, bản gel được lấy ra nhuộm Ethidium bromide hoặc SYBR green trong khoảng 5-7 phút Sau khi nhuộm bản gel được chuyển vào máy phát tia UV để quan sát kết quả điện di Vị trí các đoạn DNA được phát hiện bằng những vệt sáng tương ứng của thuốc nhuộm, chụp ảnh và lưu kết quả

2.4.7 Phương pháp giải trình tự

Kỹ thuật giải trình tự: Giải trình tự DNA (DNA sequencing) là quá trình xác lập và thu nhận thành phần nucleotide của một phân đoạn DNA cần nghiên cứu Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng máy giải trình tự gen tự động Beckman Coulter CEQ 8000 (Mỹ) thí nghiệm được tiến hành tại Phòng thí nghiệm trung tâm Khoa Thú y Nguyên tắc chung của máy giải trình tự gen tự động là dựa theo cơ sở của phương pháp Sanger

Quá trình thực hiện giải trình tự bao gồm các bước sau:

Tinh sạch sản phẩm của phản ứng RT-PCR:

Bước 1: Cho vào ống Eppendorf sản phẩm RT-PCR và dung dịch PB theo

tỷ lệ 1:5 sau đó trộn đều

Bước 2: Cho hỗn hợp đã trộn vào cột QIA đem ly tâm 13.000 vòng/phút

trong vòng 1 phút Bỏ dung dịch ở đáy ống

Bước 3: Cho 750µl PE vào cột QIA đem ly tâm 13.000 vòng/phút trong

vòng 1 phút Bỏ dung dịch ở đáy ống Tiếp tục ly tâm 13.000 vòng/phút trong vòng 1 phút

Bước 4: Chuyển cột sang ống Eppendorf mới Cho thêm 50 µl EB vào giữa

màng để 1 phút ở nhiệt độ phòng Sau đó đem ly tâm 13.000 vòng/phút trong

vòng 1 phút (có thể lặp lại 1 lần nữa để đảm bảo lấy hết ADN)

Bước 5: Bỏ cột, lấy dung dịch ở ống eppendorf (DNA tinh khiết)

Thực hiện phản ứng PCR sequencing: Chuẩn bị phản ứng trong ống PCR 0,2ml theo bảng sau:

Với chương trình chạy PCR giải trình tự sau

Bước tổng hợp Nhiệt độ ( 0 C) Thời gian Số chu kỳ

Biến tính chuỗi DNA 960C 20 giây

30 chu kỳ

Giữ sản phẩm ở 40C Tinh sạch sản phẩm PCR giải trình tự

Sản phẩm của phản ứng PCR sequence sẽ được tinh sạch bằng Ethanol kèm theo hóa chất và hướng dẫn sử dụng của nhà sản xuất (Beckman Coulter-Mỹ) Các bước tinh sạch sản phẩm như sau: