Nghiên cứu đặc tính sinh học phân tử của virus gây tiêu chảy thành dịch (porcine epidemic diarrhea) trên lợn và một số đặc điểm bệnh lý của bệnh

MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC VIẾT TẮT vi DANH MỤC BẢNG vii DANH MỤC HÌNH viii MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết đề tài Mục đích đề tài Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Những nghiên cứu hội chứng tiêu chảy 1.1.1 Đặc điểm tiêu hóa lợn 1.1.2 Một số nguyên nhân gây tiêu chảy lợn 1.2 Lịch sử tình hình nghiên cứu bệnh tiêu chảy thành dịch lợn (Porcine Epidemic Diarrhea – PED) 10 1.2.1 Tình hình nghiên cứu bệnh tiêu chảy thành dịch virus PED gây giới 10 1.2.2 Tình hình nghiên cứu bệnh tiêu chảy thành dịch virus PED gây 1.3 nước 11 Căn bệnh 11 1.3.1 Phân loại hình thái virus gây bệnh PED 11 1.3.2 Cấu trúc phân tử virus gây bệnh 12 1.3.3 Sức đề kháng virus gây bệnh PED 15 1.4 Truyền nhiễm học 15 1.4.1 Loài vật mắc bệnh 15 1.4.2 Phương thức truyền lây virus PED 15 1.4.3 Cơ chế gây bệnh 16 1.5 17 Triệu chứng bệnh tích 1.5.1 Triệu chứng lâm sàng 17 iii 1.5.2 Bệnh tích 18 1.6 Chẩn đoán 18 1.7 Kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction) 19 1.7.1 Nguyên lý phản ứng PCR 19 1.7.2 Các bước tiến hành phản ứng PCR 21 1.8 21 Kỹ thuật giải trình tự gen 1.8.1 Giải trình tự DNA theo phương pháp Maxam Gilbert 21 1.8.2 Giải trình tự DNA theo phương pháp dideoxy 22 1.8.3 Giải trình tự DNA máy tự động 24 Chương NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.1 Vật liệu nghiên cứu 25 2.2 Địa điểm thời gian nghiên cứu 25 2.3 Nội dung nghiên cứu 25 2.4 Phương pháp nghiên cứu 25 2.4.1 Phương pháp thống kê sinh học 25 2.4.2 Phương pháp mổ khám 26 2.4.3 Phương pháp làm tiêu vi thể theo quy trình tẩm đúc Parafin, nhuộm Haematoxylin – Eosin (HE) 26 2.4.4 Phương pháp tách chiết RNA tổng số hóa chất 29 2.4.5 Phương pháp tiến hành phản ứng RT-PCR 30 2.4.6 Phương pháp điện di kiểm tra sản phẩm PCR 31 2.4.7 Phương pháp giải trình tự 31 2.4.8 Phương pháp xử lý số liệu 33 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34 3.1 Kết phản ứng RT-PCR chẩn đoán lợn mắc PED 34 3.2 Triệu chứng lâm sàng chủ yếu lợn mắc PED 37 3.3 Kết nghiên cứu bệnh tích đại thể lợn mắc PED 42 3.4 Kết nghiên cứu bệnh tích vi thể lợn mắc PED 46 iv 3.5 Kết giải trình tự gen, so sánh thành phần tương đồng nucleotide, axit amin chủng virus PED nghiên cứu số chủng virus PED tham chiếu 49 3.5.1 Kết so sánh tương đồng nucleotide chủng virus PED nghiên cứu 49 3.5.2 Kết so sánh tương đồng nucleotide chủng virus PED nghiên cứu với số chủng virus PED giới 52 3.5.3 Kết so sánh tương đồng axit amin chủng virus PED nghiên cứu 58 3.5.4 Kết so sánh tương đồng thứ tự axit amin chủng virus 3.6 PED nghiên cứu với số chủng tham chiếu giới 59 Kết xây dựng phả hệ 62 KẾT LUẬN 65 ĐỀ NGHỊ 67 TÀI LIỆU THAM KHẢO 68 PHỤ LỤC ẢNH 71 MỘT SỐ HÌNH ẢNH BỆNH TÍCH ĐẠI THỂ CỦA LỢN MẮC PED 71 MỘT SỐ HÌNH ẢNH BỆNH TÍCH VI THỂ 72 v DANH MỤC VIẾT TẮT Cs : Cộng FMDV : The foot-and-mouth disease virus M : Membrain protein N : Nuclecapxit protein NXB : Nhà xuất ORF3 : Open reading flame PED : Porcine epidemic diearrhea PEDV : Porcine epidemic diearrhea virus Pp : Page paper PRRSV : Porcine reproductive and respiratory syndrome virus RT-PCR : Reverse transcription polymerase chain reaction S : Spike protein TGEV : Transmissible gastroenteritis virus Tr : Trang vi DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Kết phản ứng RT-PCR lợn tỉnh 34 Bảng 3.2 Kết phản ứng RT-PCR 35 Bảng 3.3 Kết theo dõi số biểu triệu chứng lâm sàng lợn mắc PED 38 Bảng 3.4 Bệnh tích đại thể số quan lợn mắc PED 42 Bảng 3.5 Bệnh tích vi thể lợn mắc PED 46 Bảng 3.6 Sai khác vị trí nucleotide chủng virus PED nghiên cứu 51 Bảng 3.7 Sự tương đồng nucleotide chủng virus PED nghiên cứu (%) 51 Bảng 3.8 Một số thông tin chủng virus PED tham chiếu 53 Bảng 3.9 Sự tương đồng nucleotide chủng virus PED nghiên cứu với số chủng virus PED giới (%) 57 Bảng 3.10 Sai khác thứ tự axit amin mã hóa gen M chủng virus PED nghiên cứu 59 Bảng 3.11 Sự tương đồng thứ tự axit amin mã hóa gen M chủng virus PED nghiên cứu (%) 59 Bảng 3.12 Sự tương đồng thứ tự axit amin gen M chủng virus PED nghiên cứu với số chủng virus PED giới (%) vii 61 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Những khơng bào bào tương tế bào hấp thu ruột non lợn, chứa hạt virus PED có đường kính từ 90190 nm (x20.000) 12 Hình 1.2 Virus PED chủng KPEDV-9 phân lập Hàn Quốc nhuộm với urany acetat 2% Chiều dài nằm ngang tương đương 100nm 12 Hình 1.3 Mơ hình cấu trúc gen virus PED 13 Hình 1.4 Mơ hình ngun lý phản ứng RT-PCR 20 Hình 3.1 Kết phản ứng RT-PCR 36 Hình 3.2 Lợn sút cân, gầy cịm 41 Hình 3.3 Lợn nơn mửa 41 Hình 3.4 Lợn nằm dồn đống 41 Hình 3.5 Phân dính hậu mơn, chân 41 Hình 3.6 Phân lỏng màu vàng 41 Hình 3.7 Phân màu xi măng 41 Hình 3.8 Dạ dày, ruột căng, thành mỏng 45 Hình 3.9 Hạch màng treo ruột sưng to 45 Hình 3.10 Thành ruột mỏng, xuất huyết 45 Hình 3.11 Ống dưỡng chất sung huyết 45 Hình 3.12 Biểu mơ dày đứt nát (HE 10X) 48 Hình 3.13 Ruột non sung huyết, xuất huyết (HE 10X) 48 Hình 3.14 Tĩnh mạch chứa nhiều hồng cầu (HE 10X) 48 Hình 3.15 Lớp đệm nhiều bạch cầu, lơng nhung đứt nát (HE 10X) 48 Hình 3.16 Lơng nhung ruột đứt nát (HE 10X) 48 Hình 3.17 Thâm nhiễm tế bào viêm ruột (HE 40X) 48 Hình 3.18 So sánh thành phần nucleotit chuỗi gen giải trình tự 50 viii Hình 3.19 So sánh thành phần nucleotide chủng virus PED nghiên cứu với số chủng virus PED giới 56 Hình 3.20 So sánh thành phần axit amin mã hóa chuỗi gen giải trình tự 58 Hình 3.21 So sánh thành phần axit amin chủng virus PED nghiên cứu với số chủng virus PED giới 60 Hình 3.22 Cây phả hệ chủng virus PED nghiên cứu dựa trình tự nucleotide (hiển thị dạng theo boot trap) 62 Hình 3.23 Cây phả hệ chủng virus PED nghiên cứu dựa trình tự nucleotide (hiển thị dạng theo gốc) ix 63 MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Xét bình diện giới, với nước châu Á, chăn nuôi ngành kinh tế nông nghiệp quan trọng Hệ thống nông nghiệp Việt Nam đạt thành tích đáng ghi nhận khơng lĩnh vực lương thực cơng nghiệp mà cịn lĩnh vực chăn nuôi gia súc thủy sản Cùng với phát triển q trình cơng nghiệp hóa – đại hóa đất nước, cơng nghệ đại ngày áp dụng sâu rộng giúp cho suất chăn nuôi ngày tăng cao, thời gian ni rút ngắn, lợi nhuận thu từ chăn ni có xu hướng tăng Bên cạnh đó, mức sống người ngày nâng cao kéo theo thay đổi cấu tiêu dùng thức ăn, xu hướng tiêu dùng sản phẩm trồng trọt giảm đi, nhanh chóng nhường chỗ cho sản phẩm chăn nuôi Nhu cầu thịt thị trường ngày tăng lên, đặc biệt nhu cầu sản phẩm thịt lợn Tình hình động lực để thúc đẩy ngành chăn nuôi lợn ngày phát triển mạnh mẽ Chăn nuôi lợn ngành chăn nuôi không điều kiện Việt Nam nay, lại ngành chăn ni có triển vọng Tuy nhiên, ngành chăn ni nói chung chăn ni lợn nói riêng gặp khơng khó khăn, đặc biệt vấn đề dịch bệnh mang lại thiệt hại không nhỏ cho người chăn nuôi Bệnh tiêu chảy thành dịch lợn virus PED (Porcine Epidemic Diarrhea) - virus thuộc họ Coronavirus vấn đề quan tâm bệnh gây thiệt hại nghiêm trọng đàn lợn Bệnh PED xảy quanh năm, thường phổ biến vào mùa đông 90% ca bệnh xảy lợn 10 ngày tuổi Bệnh xuất lần nước Anh vào năm 1972, sau lây lan nhiều quốc gia châu Âu châu Á Trung Quốc, vũng lãnh thổ Đài Loan, Nhật, Hàn Quốc Thái Lan Năm 2008, virut PED phát số đàn lợn bị tiêu chảy Việt Nam Cho tới nay, Việt Nam, chưa có nhiều cơng trình nghiên cứu bệnh tiêu chảy thành dịch lợn virus PED nghiên cứu đặc điểm bệnh lý, sinh học phân tử virus PED, đặc biệt khu vực phía Bắc Việt Nam Bên cạnh đó, có thực tế đặt là: biểu triệu chứng lâm sàng lợn ốm nhiễm virus PED giống dễ nhầm lẫn với biểu triệu chứng lâm sàng lợn bị nhiễm virus gây viêm dày ruột truyền nhiễm (TGEV) Xuất phát từ tình hình thực tiễn trên, tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu đặc tính sinh học phân tử virus gây tiêu chảy thành dịch (Porcine epidemic diarrhea) lợn số đặc điểm bệnh lý bệnh” Mục đích đề tài - Xác định đặc điểm bệnh lý chủ yếu (bao gồm triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đại thể, vi thể) lợn mắc bệnh tiêu chảy thành dịch virus PED gây - Xác định mối quan hệ di truyền chủng virus PED nghiên cứu Việt Nam so với chủng tham chiếu giới dựa trình tự gen M virus gây bệnh Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Những nghiên cứu hội chứng tiêu chảy Tiêu chảy biểu lâm sàng q trình bệnh lý đặc thù đường tiêu hóa Biểu lâm sàng tùy theo đặc điểm, tính chất, diễn biến, độ tuổi mắc bệnh Tùy theo yếu tố xem ngun nhân mà gọi với nhiều tên khác nhau: Bệnh lợn ỉa phân trắng, bệnh tiêu chảy sau cai sữa, chứng khó tiêu, chứng rối loạn tiêu hóa hay Colibacillosis, Salmonellosis,… tiêu chảy triệu chứng thường gặp nhiều bệnh ký sinh trùng, bệnh virus, bệnh vi khuẩn Tiêu chảy thường gặp gia súc, gây thiệt hại lớn cho ngành chăn nuôi Trong lịch sử nghiên cứu hội chứng tiêu chảy, nhiều tác giả nghiên cứu, tìm hiểu nguyên nhân gây hội chứng tiêu chảy Tuy nhiên, tiêu chảy tượng bệnh lý, có liên quan đến nhiều yếu tố, có yếu tố nguyên nhân nguyên phát, có yếu tố nguyên nhân thứ phát Việc phân biệt rạch rịi ngun nhân gây tiêu chảy khơng đơn giản Ngày nay, người ta thống rằng, phân loại nguyên nhân gây tiêu chảy có ý nghĩa tương đối, nêu lên yếu tố chính, xuất đầu tiên, yếu tố phụ xuất sau, từ vạch phác đồ phịng điều trị bệnh có hiệu Nhưng cho dù nguyên nhân dẫn đến tiêu chảy hậu gây viêm nhiễm, tổn thương thực thể đường tiêu hóa cuối nhiễm trùng Theo Fairbrother J.M (1992) tiêu chảy bệnh gây thiệt hại đáng kể cho ngành chăn nuôi lợn Theo Trịnh Văn Thịnh (1995), Lê Minh Chí (1995) lợn bị tiêu chảy thường nước, chất điện giải kiệt sức Những lợn khỏi thường bị còi cọc, thiếu máu, chậm lớn tượng viêm nhiễm, tổn thương thực thể đường tiêu hóa cuối trình nhiễm trùng dẫn đến lợn chết với tỷ lệ cao, gây thiệt hại lớn kinh tế Đó nguyên nhân làm cho hiệu chăn nuôi không cao ... cứu đề tài: ? ?Nghiên cứu đặc tính sinh học phân tử virus gây tiêu chảy thành dịch (Porcine epidemic diarrhea) lợn số đặc điểm bệnh lý bệnh? ?? Mục đích đề tài - Xác định đặc điểm bệnh lý chủ yếu (bao... phát số đàn lợn bị tiêu chảy Việt Nam Cho tới nay, Việt Nam, chưa có nhiều cơng trình nghiên cứu bệnh tiêu chảy thành dịch lợn virus PED nghiên cứu đặc điểm bệnh lý, sinh học phân tử virus PED, đặc. .. ruột, tiêu chảy nặng thêm, dẫn đến chết tiêu chảy viêm ruột mạn tính 1.2 Lịch sử tình hình nghiên cứu bệnh tiêu chảy thành dịch lợn (Porcine Epidemic Diarrhea – PED) 1.2.1 Tình hình nghiên cứu bệnh