NGHIÊN cứu đặc điểm SINH học, PHÂN tử của CUCUMBER MOSAIC VIRUS TRÊN cây KHOAI

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC, PHÂN TỬ CỦA CUCUMBER MOSAIC VIRUS TRÊN CÂY KHOAI TỪ “ Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy giáo TS.. Nguyễn Đức Huy, chúng tôi thực hiện nghiên cứu

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

KHOA NÔNG HỌC -  -

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

LỜI CẢM ƠN

Sau 6 tháng thực hiện đề tài tại Bộ môn bệnh cây, Khoa Nông học và Trung tâm nghiên cứu Bệnh cây nhiệt đới - Học viện Nông nghiệp Việt Nam, dưới sự giúp đỡ, chỉ bảo và dìu dắt tận tình của thầy giáo và các cán bộ nghiên cứu tại Trung tâm, cùng với sự cố gắng và nỗ lực của bản thân, em đã hoàn

thành khóa luận tốt nghiệp NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC, PHÂN TỬ CỦA

CUCUMBER MOSAIC VIRUS TRÊN CÂY KHOAI TỪ “

Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy giáo TS Nguyễn Đức Huy, giảng viên bộ môn Bệnh cây, khoa Nông học đã tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện tốt cho em thực hiện đề tài nghiên cứu và hoàn chỉnh đề tài này

Qua đây em cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy, cô trong Bộ môn bệnh cây cũng như các thầy cô trong khoa Nông học đã tận tình giảng dạy, dìu dắt em trong suốt thời gian em học tập và rèn luyện tại trường

Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới tất cả người thân, bạn bè, những người luôn bên cạnh động viên giúp đỡ em trong quá trình học tập và thực hiện đề tài này

Hà Nội, ngày tháng năm 2016

Sinh viên

Phan Thị Thùy Dương

MỤC LỤC

2.1 Giới thiệu về cây khoai từ 50

2.1.1 Đặc điểm của cây khoai từ 50

2.1.2 Giá trị dược liệu của cây khoai từ 52

2.1.3 Sự phân bố số lượng giống khoai từ 53

2.3 Giới thiệu về Cucumber mosaic virus 54

2.3.1 Lịch sử nghiên cứu Cucumber mosaic virus 54

2.3.1.1 Nguồn gốc của Cucumber mosaic virus 54

2.3.1.2 Phân loại Cucumber mosaic virus 54

2.3.1.3 Ký chủ của Cucumber mosaic virus 55

2.3.1.4 Cấu trúc của Cucumber mosaic virus 56

2.3.1.5 Tính chất lý hóa của Cucumber mosaic virus 58

2.3.1.6 Sự truyền bệnh của Cucumber mosaic virus 58

2.3.1.7 Triệu chứng bệnh do Cucumber mosaic virus gây ra 60

2.3.1.8 Biện pháp kiểm soát 60

2.4 Một số nghiên cứu trong và ngoài nước về Cucumber mosaic virus trong thời gian gần đây 61

2.4.1 Cucumber mosaic virus 61

2.4.1.1 Tình hình nhiên cứu ngoài nước 61

Bahadra Murthy Vemulapati và cs năm 2009 đã nghiên cứu trình tự gen protein vỏ chứng minh rằng CMV lây nhiễm ớt cựa gà (Capsicum annuum L.) ở Ấn Độ thuộc nhóm IB 61

Kouakou Théodore Kouadio và cs năm 2014 đã viết một bản báo cáo đầu tiên về sự xuất hiện của satRNA kết hợp với CMV phân lập từ chuối (Musa sp.) tại Bờ Biển Ngà 62

2.4.1.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 62

3.1 Đối tượng, vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu 64

3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 64

3.1.2 Vật liệu và dụng cụ nghiên cứu 64

3.1.2.1 Vật liệu: 64

3.1.3 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 66

3.3 Phương pháp nghiên cứu 66

3.3.1 Phương pháp điều tra thành phần, diễn biến bệnh khảm lá khoai từ ngoài đồng ruộng 66

3.3.2 Thí nghiệm trong phòng 67

3.3.2.2 Chẩn đoán virus bằng kỹ thuật ELISA 72

3.3.3 Thí nghiệm trong nhà lưới 74

4.1 Thành phần bệnh hại khoai từ tại một số tỉnh 75

4.2 Kết quả điều tra mức độ phổ biến, thu mẫu và đánh giá tình hình bệnh virus có triệu chứng khảm lá trên đồng ruộng 77

4.2.1 Kết quả điều tra mức độ nhiễm bệnh khảm lá trên khoai từ tại một số tỉnh phía Bắc 77

4.2 Kết quả điều tra mức độ phổ biến, thu mẫu và đánh giá tình hình bệnh virus có triệu chứng khảm lá trên đồng ruộng 78

4.2.1 Kết quả điều tra mức độ nhiễm bệnh khảm lá trên khoai từ tại một số tỉnh phía Bắc 78

4.2.2 Điều tra diễn biến bệnh khảm lá khoai từ 78

4.2.2.1 Kết quả điều tra diễn biến bệnh khảm lá tại Can Lộc – Hà Tĩnh 79

4.4 Đánh giá khả năng lây nhiễm CMV và bằng kỹ thuật lây nhân tạo 82

4.4.1 Kết quả lây nhiễm nhân tạo CMV 83

4.4.1.1 Kết quả lây nhiễm CMV lên cây rau muối 83

4.3.2 Kết quả lây nhiễm nhân tạo CMV trên cây khoai từ 86

4.3.3 Kết quả đánh giá sự lây nhiễm virus truyền qua củ giống 88

5.1 Kết luận 90

5.2 Đề nghị 91

DANH MỤC BẢNG

DANH MỤC HÌNH

7 DAS-ELISA Double Antibody Sandwich – ELISA

8 ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay

9 PTR-ELISA Plate-trapped antigen – ELISA

10 PVMV Pepper Veinal Mottle Virus

12 RT-PCR Reverse transcription - Polymerase

Phần 1

MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Khoai từ (Dioscorea esculenta) thuộc họ củ nâu (Dioscoreaceae) là một

họ thực vật một la mầm bao gồm 8-9 chi với khoảng 750-785 loài Chi củ nâu

(Dioscorea) được đặt theo tên nhà vật lý học và thực vật học Hy lạp cổ đại

Dioscorides Chi này có trên 600 loài thực vật bản địa ở các vùng nhiệt đới và vùng có khí hậu ẩm Một số loài trong chi củ nâu cho củ là nguồn lương thực quan trọng ở một số nước nhiệt đới Nhiều loài củ trong chi này chứa độc tố trong củ tươi nhưng độc tố này bị phân hủy trong quá trình chế biến nhiệt.Các loài quan trọng trong chi củ nâu là: củ mài, củ mài trắng, khoai mỡ, nắng nghệ

và đặc biệt là cây khoai từ.Khoai từ (Diosorea esculenta) gồm các dạng khoai từ

(củ từ), củ từ lông (có loài nhiều hoặc ít lông) Ở Việt Nam, loại có gai (var,

spinosa) phân bố ở Phú Quốc, loại không gai (var, fasiculata) phân bố rộng rãi,

ngoài ra còn có củ từ nước (Dioscorea pierrel) mọc ở các tỉnh miền Đông Nam

Bộ.Khoai từ được dùng làm lương thực, thực phẩm và nó còn là vị thuốc với nhiều công dụng Ở Việt Nam, trong số các loại khoai còn được ít nhắc đến khoai từ nhưng nó được phân bố rải rác ở khắp mọi nơi và được tập trung nhiều nhất ở vùng trung du và bán sơn địa Cây khoai từ là cây dễ trồng, chịu nhiệt tốt

và rất ít sâu bệnh tuy nhiên chúng ta vẫn thường bắt gặp trên chi này bệnh thán thư, loét và đặc biệt là triệu chứng bệnh khảm lá Bệnh có khả năng truyền bệnh qua hạt giống với tỷ lệ 1-10%, đây là nguồn bệnh sơ cấp trên đồng ruộng Ngoài

ra, bệnh có thể lây lan thứ cấp trên đồng ruộng từ cây này sang cây khác qua vector rệp muội Cũng giống như tất cả những virus thực vật khác,bệnh khảm hoàn toàn không gây hại đến sức khoẻ con người và động vật nếu ăn phải cây bị bệnh, tuy nhiên, chúng lại gây ảnh hưởng khá nhiều đến hình thức, chất lượng của cây trồng Tuy nhiên virus gây ra triệu chứng này chưa được xác định và

công bố.Xuất phát từ vấn đề nêu trên, được sự phân công của bộ môn Bệnh cây, khoa Nông học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam, dưới sự hướng dẫn của TS

Nguyễn Đức Huy, chúng tôi thực hiện nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu đặc

điểm sinh học phân tử của Cucumber mosaic virus trên cây khoai từ”

- Xác định virus bằng kỹ thuật DAS-ELISA và RT-PCR

- Đánh giá tính gây bệnh của virus bằng phương pháp lây bệnh nhân tạo

- Kiểm tra/ xác định CMV bằng kỹ thuật RT – PCR sử dụng mồi đặc hiệụ

Phần 2 TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU

2.1 Giới thiệu về cây khoai từ

2.1.1 Đặc điểm của cây khoai từ

Cây khoai từ (Dioscorea esculenta) là loại cây leo, có củ sống lâu năm

Thân tròn mảnh, có gai nhỏ ở gốc, to và cong về phia trên Khoai từ là cây có củ mọc thành hình cầu, dạng trứng hay có thùy, nhẵn hay có gai (ở một số giống mọc hoang), có rễ cứng và biến thành gai Củ khoai từ có vỏ mỏng, trong có chất bột dính, màu ngà, củ khoai từ hình bầu dục dài khoảng 15-20 cm, đường kính 6 – 8cm, trọng lượng trung bình lên tới 0,25 – 1 kg Lá đơn, mọc so le, nhọn hay có mũi, dài và rộng khoảng 8cm, gân 9 – 13cm, phiến lá mềm có lông

mi hoặc có khi nhẵn có mép nguyên.Củ là phần được sử dụng của khoai từ Thành phần chính của củ tươi là nước chiếm khoảng 2/3 khối lượng củ tươi Tỷ

lệ chất khô trong củ chiếm khoảng 20 – 30% tùy thuộc vào giống và thời gian thu hoạch Hydratcacbon là thành phần chất khô chính của củ, chiếm ¼ khối lượng củ Phần lớn hydratcacbon là các hạt tinh bột amylopectin mạch nhánh, tồn tại trong các tế bào dưới dạng các hạt tinh bột hình elip Như vậy chúng ta

có thể thấy giá trị dinh dưỡng của củ từ tương đương với củ khoai tây.Ngoài công dụng làm lương thực, thực phẩm thì khoai từ còn được xuất khẩu Hiệu quả kinh tế khoai từ mang lại cao gấp 2 lần so với trồng lúa trên cùng diện tích, nếu thâm canh tốt thì có thể cho hiệu quả gấp 4 – 7 lần.Thông thường người nông dân trồng khoai từ vào khoảng tháng 2-4 dương lịch khi bắt đầu có mưa,

và thu hoạch vào khoảng tháng 9 – 11 Nó phát triển tốt nhất tại những nơi có nhiệt độ ban ngày khoảng 28 - 32 ° C, nhưng có thể chịu đựng được 17 – 45 ° C, dưới 9° C cây sẽ chết Lượng mưa trung bình thích hợp khoảng 800 – 2000 mm nhưng có thể chịu được trong khoảng 600 – 8000 mm Để đạt năng suất cao nhất thì thoát nước tốt là yếu tố đáng chú ý nhất Khoai Từ là một trong số 10 loài

quan trọng nhất có giá trị kinh tế thuộc chi Dioscorea, đặc biệt là nguồn thực

phẩm quan trọng đối với các quốc gia có thu nhập thấp và đang phát triển Khoai

Từ và các loài thuộc chi Dioscorea có ý nghĩa đặc biệt quan trọng đối với người

dân Nigieria và các nước Tây Phi, cung cấp hơn 200 calo/ngày/người cho hơn

150 triệu người ở Tây Phi, nguồn thu nhập quan trọng cho người nghèo ở các nước Tây và Trung phi Đồng thời, chúng là cây giàu tinh bột, chế biến được nhiều món ăn và được trồng quanh năm mang lại nguồn lương thực quan trọng

và an ninh lương thực cho người dân châu Phi vùng cận sa mạc Sahara Củ Khoai Từ là nguồn nguyên liệu quan trọng trong công nghiệp dược phẩm và y học, chất Diosgenin có trong củ Khoai Từ được sử dụng để tổng hợp Cortisone, Pregnenolone, Progesterone và các sản phẩm steroid khác có hoạt tính estrogen

có tác dụng làm giảm cholesterol trong máu.Chất Diosgenin trong của được sử dụng để điều trị bệnh phong thấp và đau viêm khớp.Củ Khoai Từ được sử dụng như một loại thuốc trong y học truyền thống Trung Quốc, Hàn Quốc, Nhật Bản Trong Khoai Từ có chứa hợp chất allantoine là một hợp chất hóa học azote có công thức C4H6N4O3 nguồn gốc hữu cơ hay thực vật Chất này có nhiều tác dụng sinh học như chống ung thư, chống tăng sinh, kháng khuẩn, làm lành vết thương

và các hoạt động kháng khuẩn bao gồm cả hoạt động chống oxy hóa và được dùng trong kỹ nghệ mỹ phẩm Trong tự nhiên, Khoai Từ tái sinh thông qua hạt hay đoạn thân tươi hay củ Nhưng năng suất củ giảm do nhiễm virus và các loài tuyến trùng, củ bị nhiễm được truyền cho thế hệ sau làm giảm chất lượng củ Nhân giống Khoai Từ bằng phương pháp truyền thống đã trở nên phổ biến đối với hầu hết người nông dân, song kỹ thuật nhân giống trên cho hiệu quả thấp Nuôi cấy mô tế bào thực vật là một phương pháp nhân giống đem lại hiệu quả cao mà người nông dân nên áp dụng để tăng năng suất cây trồng

Bảng 2.1 : Thành phần hóa học của một số giống khoai từ ( theo khối lượng

2.1.2 Giá trị dược liệu của cây khoai từ

Khoai từ còn gọi là sơn dược, củ mài, củ từ, khoai mài, hoài sơn…, chẳng những là một loại thực phẩm quý, còn là loại thực phẩm tư bổ Phân tích khoa học cho thấy, khoai từ giàu tinh bột, protein, arginin, lipid, muối vô cơ và nhiều loại vitamin (như B1, B2, acid nicotinic, acid ascorbic, caroten)…, ngoài ra còn chứa nhiều chất xơ và thành phần chất niêm dịch

Khoai từ có thể cung cấp lượng lớn protein niêm dịch cho cơ thể người Đây là hợp chất giữa protein và polysacc-harid, có tác dụng bảo vệ sức khỏe cho

cơ thể, có thể phòng tránh lắng đọng lipid ở hệ thống tim mạch, duy trì tính đàn hồi của

Lipid dưới da, tránh xuất hiện tình trạng béo phì

Hai là, có thể phòng tránh teo rút mô liên kết trong thận và gan, phòng tránh phát sinh bệnh chất tạo keo duy trì độ hoạt nhuận ở đường tiêu hóa, đường

hô hấp và hốc khớp

Ba là, chất polysac-harid niêm dịch trong khoai từ sau khi kết hợp với muối vô cơ có thể hình thành chất xương, giúp xương sụn có độ đàn hồi nhất định

Bốn là, enzym tiêu hóa trong khoai từ có thể thúc đẩy phân giải protein và tinh bột

Vì vậy, nó là thực phẩm bổ dưỡng cho người suy yếu do nhiều bệnh như

cơ thể hư nhược, tinh thần mệt mỏi, ăn không ngon miệng, tiêu hóa kém, hư lao

ho nhiều, di tinh đổ mồ hôi trộm, phụ nữ bạch đới, bệnh tiểu đường

2.1.3 Sự phân bố số lượng giống khoai từ

Các giống khoai từ, vạc được phân bố rộng rãi trên các vùng miền Bảng

1 cho thấy 102 mẫu giống trong tập đoàn được thu thập từ 7 vùng sinh thái trong

cả nước Vùng Đông Bắc là vùng thu được số lượng mẫu giống cao nhất (44 mẫu giống chiếm tỷ lệ 43.14%) Khu vực Nam Trung Bộ và Tây Nguyên có số lượng mẫu giống thu thập ít nhất (01 mẫu giống chiếm tỷ lệ 0.98 %)

Bảng 2.2: Sự Phân bố của các loại giống khoai từ, khoai vạc.

2.3 Giới thiệu về Cucumber mosaic virus

2.3.1 Lịch sử nghiên cứu Cucumber mosaic virus

2.3.1.1 Nguồn gốc của Cucumber mosaic virus

Bệnh khảm do Cucumber mosaic virus (CMV) gây ra là bệnh khá phổ

biến trên nhiều đối tượng cây trồng Bệnh được công bố đầu tiên vào năm 1916 (Doolittle, 1916) và là một trong những bệnh hại thực vật gây ra bởi virus được phát hiện sớm nhất

Trong thời gian đầu, những công cụ để xác định sự tồn tại của virus

chuyên biệt này còn rất hạn chế Sau đó, bệnh cũng được biết là do Cucumber

mosaic virus gây ra (Kaper và Waterworth, 1981) Cho tới thời điểm hiện tại đã

có rất nhiều dòng CMV được mô tả Dữ liệu di truyền hiện nay chứa trình tự của khoảng 60 protein khác nhau cùng với 15 trình tự genome virus hoàn chỉnh Chủng CMV gồm 2 nhóm là I và II với khoảng 25% trình tự nucleotit khác nhau nên virus có khả năng thích ứng cao và tiến hóa lạ thường Nhóm I được phân thành IA và IB dựa trên sự khác biệt triệu chứng trên cây đậu đũa do CMV gây

ra, chủng nhóm IA gây triệu chứng khảm hệ thống trên lá còn chủng nhóm IB gây triệu chứng hoại tử cục bộ trên lá (Thomas A Zitter và John F Murphy, 2009) Các nghiên cứu cho thấy rằng virus CMV trên cây khoai từ được lây nhiễm từ cây khoai lang

CMV phân bố ở khắp nơi trên thế giới, chủ yếu ở vùng có khí hậu ôn hòa

Úc, Canada, Pháp, Ấn Độ, Nhật Bản, Triều Tiên, Ma – rốc, New Zealand, Phần lan, Tây Ba Nha, Mỹ

2.3.1.2 Phân loại Cucumber mosaic virus

Virus có các tên khác nhau như: banana infectious chlorosis virus, coleus

mosaic virus ( creager, 1945; Holcomb và Valverde, 1991), Cowpea banding mosaic virus, Cowpea ringspot virus, cucumber virus 1, Lily ringspot virus (

Brierley và Travis, 1958), Pea top necrosis, Peanut yellow mosaic virus,

Southern celery mosaic virus(DooLittle, 1916; Price, 1935; Wellman, 1934),

Soybean stunt virus (Hanada và Tochihara, 1982), Spinach blight virus, Tomato fern left virus, Pea western ringspot virus và ICTV đã chấp nhận với tên là Cucumber mosaic virus (CMV)

Cucumber mosaic virus thuộc họ Bromoviridae Họ này bao gồm 5 chi: Cucumovirus, Alfamovirus, Bromovirus, Ilarvirus và Oleavirus Trong đó, CMV

là loài điển hình của chi Cucumovirus.

Theo Devergne (1975), các dòng của virus này được biết đến như: CMV, E-CMV, L-CMV, N-CMV, P-CMV, Z-CMV và WAI/WAII Dòng này

A-có 2 nhóm kháng nguyên là ToRS và DLT RNA3 của tất cả các loài virus trong chi có thể được trao đổi với nhau trong khi đó RNA1 và RNA2 chỉ có thể trao đổi trong loài Những trình tự tương đồng cho thấy virus có quan hệ Brome Mosaic Virus và trình tự của RNA1 và RNA2 cho thấy có quan hệ với Alfalfa Mosaic Virus và Tobaco Mosaic Viruses (Lâm Ngọc Hạnh, 2005)

2.3.1.3 Ký chủ của Cucumber mosaic virus

Cucumber mosaic virus có phổ ký chủ rộng, gây hại 1200 loài thực vật

thuộc hàng trăm họ thực vật khác nhau của cây 1 và 2 lá mầm, bao gồm nhiều loại rau, cây cảnh, cây thân thảo, thân gỗ và bán gỗ (Thomas A Zitter và John F Murphy, 2009)

Một trong số những cây rau cải quan trọng bị ảnh hưởng bởi CMV là ớt

(Capsicum annuum L.), họ bầu bí, cà chua (Lycopersicon esculentum Mill.) Ở Hawaii, CMV còn xuất hiện trên một loài cỏ dại có tên Comellina spp Những

cây ký chủ khác như: dưa chuột, dưa thơm, bí, rau bina, cần tây, cải xoong nước,

củ cải, khoai lang, su su, dưa hấu, bí ngô, bầu, đậu lima, đậu phộng, hành tây, cà tím, khoai tây, đại hoàng, cà rốt, rau thìa là, rau mùi tây (Chupp and Sherf, 1960), mướp (Huang và cs., 1987), atiso (Chabbouh Cherif, 1990), cây khoai từ

Ký chủ là cây cảnh bao gồm: Thúy cúc Trung Quốc, hoa cúc, cây phi yến, hoa sô đỏ, cây phong lữ, lily, lay ơn, cây vòi voi, lục bình, phi yến, hoa huệ, cúc vạn thọ, rau muống, cây sen cạn, cây dừa cạn, dã yên thảo, loại hoa có nhiều

màu sắc, hoa mõm chó, tulip và cây cúc zinnia ( Chupp and Sherf,1960; Agrios, 1978).

2.3.1.4 Cấu trúc của Cucumber mosaic virus

Dưới kính hiển vi điện tử CMV có dạng hình cầu, đường kính 28-30 nm Virion của CMV không có vỏ Có nhiều loại virion nhưng kích thước tương đối giống nhau Trọng lượng phân tử là 5,0-6,7.106 Da

Hình 2.1 Cấu trúc CMV

(Thomas J Smith và CTV, 2000)

Thành phần cấu tạo

 Acid nucleic

Sợi đơn RNA thông2 tin (mRNA), chiếm khoảng 18% trọng lượng phân

tử Tỉ lệ G: A: C: U khoảng 24: 23: 23: 30.Theo Thomas A Zitter và John F Murphy (2009), CMV là một virus đa thành phần với 3 phân tử RNA lần lượt là RNA 1, RNA 2, RNA 3.Ngoài ra CMV có một phân tử RNA subgenomic (hình thành trong quá trình tái sinh virus) không cần cho quá trình gây bệnh gọi là RNA 4 RNA 1 chứa khoảng 3350 nucleotide, mã hóa cho protein 1a (khoảng 111kDa) RNA 2 chứa khoảng 3050 nucleotide, mã hóa trực tiếp protein 2a (97kDa), RNA 4A chứa 691 nucleotide, có nguồn gốc từ RNA 2 mã hóa cho protein 2b (15kDa) RNA 3 chứa 2200 nucleotide, mã hóa trực tiếp protein di chuyển (30kDa) và RNA 4 chứa 1034 nucleotide mẫ hóa protein vỏ (24.5kDa) Protein 1a, 2a kết hợp với những protein của ký churtaoj thành enzyme

“replicase” của CMV Protein 2b liên quan đến sự ức chế đáp ứng kháng nhiễm của ký chủ Proten 3a là protein di chuyển của virus, protein 3b là protein vỏ và

nó chứa những yếu tố quyết sự lan truyền bởi rệp Cả hai loại protein 3a và protin vỏ đều cần thiết cho sự di chuyển ở khoảng cách dài

Virus cũng chứa các RNA khác có kích thước nhỏ hơn ở mức độ thấp, đó

là RNA 4A, RNA 5 và RNA 6 RNA 4A thu được ở dòng Q, có kích thước 682 nucleotide, có nguồn gốc từ RNA 2, mã hóa cho gen 2b RNA 5 thu được ở dòng Q, có kích thước 309 nucleotide, có nguồn gốc từ đầu 3’ không mã hóa của RNA 2 và RNA 3 RNA 6 có kích thước 79-80 nucleotide có nguồn gốc từ tRNA của cây và những đoạn RNA của CMV Mỗi RNA 5 và RNA 6 chiếm 1-2% RNA tổng số của virus (Huỳnh Vĩnh Khang, 2006)

Tất cả 3 phân tử RNA của CMV đều có đầu 5’ chứa mũ 7-methyl guanosine được gọi là protein liên kết với genome (VPg), trình tự mũ này là m7G5'ppp5 (trên cả 4 RNA) Đầu 3’ của genome không có đuôi poly A, đầu 3’ của tất cả các RNA của CMV đều có cấu trúc giống tRNA

Hình 2.2 Hệ gen 3 RNA mã hóa cho 5 khung đọc mở hay mã hóa cho 5 protein (Courtesy J F Murphy) (trích dẫn từ Thomas A Zitter và John F

Murphy, 2009)

Virion chứa 82% protein Phần vỏ chứa 180 tiểu đơn vị protein tương đồng, có khối lượng khoảng 24.500 có thể thu protein vỏ bằng cách phá vỡ hạt virus và kết tủa RNA với LiCl

2.3.1.5 Tính chất lý hóa của Cucumber mosaic virus

Virion có tỷ trọng nổi trong CsCl là 1,367 g cm-3 (sau khi cố định với formaldehyde) Hệ số lắng là 99 S20w Điểm đẳng điện ở pH là 5,5 (chủng Q) Tỷ

lệ A260/A280 là 1.7, TIP là 55-70°C, LIV là 1-10 ngày Sự lây nhiễm vẫn duy trì hoặc giảm đi khi phân giải với protease, nhưng vẫn duy trì khi xử lý với phenol hoặc chất tẩy rửa (ICTVdB - The Universal Virus Database, 2006)

2.3.1.6 Sự truyền bệnh của Cucumber mosaic virus

Virus truyền từ cây bệnh sang cây khỏe bằng tiếp xúc cơ học thông qua vết thương cơ giới Theo Thomas A.Zitter và John F Murphy (2009), để nâng cao hiệu quả lây nhiễm hơn người ta cho vào đệm phosphate với Ph 7.0 bằng một chất khử Natri sulphite 10mM, chất khử này có tác dụng làm ổn định virus trong quá trình nghiền dịch và làm tăng hiệu quả hoạt động của virus hơn so với dụng dịch đệm phosphate thường

Virus được lây truyền bởi hơn 80 loài rệp muội theo kiểu lan truyền không bền vững Hai loại rệp muội quan trọng cho quá trình truyền bệnh pải kể

đến rệp đào (Myzus persicae) và rệp bông (Aphisgossypii) Theo kiểu truyền

không bền vững này côtn rung có thời gian chích nạp ngắn, thường ít hơn 1 phút, sau đó khả năng truyền bệnh giảm xuống sau khoảng 1 phút và mất khoảng sau vài giờ

Theo Frank Henry (2011), DEPI khảo sát khu vực trồng trọt Wimmera qua một số năm, các vecto rệp muội truyền CMV đã tìm thấy như

Acyrthosiphon kondoi, Aphis craccivora, Aulacorthum solani, Myzus ornatus, Myzus persicae, Brevicoryne brassicae, Hypermyzus lactucae, Uroleocon sonchi Theo Thomas A Zitter và John F Murphy (2009), trên đậu que thì các

vecto quan trọng nhất là rệp vừng đậu nành ( Aphis glycines) gần đây đã được giới thiệu ở Hoa Kỳ, rệp cỏ ba lá màu vàng (Thrioaphis trifolii) và ít quan trọng hơn là rệp đậu Hà Lan ( Acryrthosiphon pisum) Mức độ bệnh phụ thuộc vào số

lượng rệp có sẵn để truyền virus vào mùa xuân hoặc mùa thu của vùng trồng Nếu vào mùa xuân hoặc mùa thu mát mẻ và ẩm ướt số lượng rệp giảm và virus lây lan ít ngược lại vào mùa thu ấm áp mưa ít các quần thể rệp tăng nhanh chóng trên các cây trồng đã bị lây nhiễm CMV lâu năm lây lan nhanh sang cây trồng nhỏ Trong trường hợp này, tỷ lệ lây nhiễm có thể lên tới 100 % và các cây trồng có thể bị bỏ hoang Tính trung bình, mức độ thiệt hại năng suất phổ biến từ 10% - 20% và trong một số trường hợp các cây trồng vẫn có thể thu hoạch nhưng sản phẩm nông nghiệp có chất lượng kém hơn

Phạm vi kí chủ CMV rất rộng nên nguồn bệnh tồn tại ở hoa, cây trồng khác và cỏ dại lâu năm Các loại cỏ dại chứa CMV trong rễ, củ qua suốt mùa đông và mùa xuân rệp muội sẽ truyền bệnh cho cây khỏe Các loại cỏ dại có thể

kể đến như Asclepias syriaca, Barbarea vulgaris, Rorippa islandica, Linaria

vulgaris, chúng được chứng minh là nơi chứa nguồn bệnh quan trọng gây ra

nhiễm CMV trên rau diếp ở ngoại ô New York Cây tràng sao cũng được chứng minh rằng mang nguồn bệnh CMV quan trọng gây hại trên rau diếp ở Anh (Thomas A.Zitter và John F Murphy (2009),) điều đặc biệt là cỏ dại nhiễm CMV không xuất hiện triệu chứng, virus được truyền qua ít nhất 10 loại dây tơ hồng và virus có thể tái bản trong dây tơ hồng

Virus truyền qua hạt giống, phổ biến trong 19 loài thực vật, các họ thực

vật thường bị nhiễm CMV qua hạt là Amaranthaceae (syn Chenopodiaceae) ( cải bó xôi), Brassicaceae, Fabaceae (syn Leguminosae) ( đậu, đậu xanh Ấn

Độ, đậu đũa, đậu lăng, đậu lapi) Theo Frank Henry (2011), tại bang Victoria, các DEPI khảo sát sự truyền bệnh CMV qua hạt giống cho thấy rằng trong 7% mẫu hạt đậu lăng và 9% mẫu hạt đậu tằm thì có đến 0,2% đậu lăng và 0,1 % đậu tằm bị nhiễm CMV Ở Tây Úc, thí nghiệm truyền qua hạt giống cho thấy tỷ lệ

lây truyền của CMV lên đến 1% trong đậu lăng, 2% trong đậu xanh và 0,8% trong đậu narbon, và lần đầu tiên cho thấy CMV là truyền qua hạt giống đậu

2.3.1.7 Triệu chứng bệnh do Cucumber mosaic virus gây ra

Vết bệnh đầu tiên là những vết khảm đốm màu vàng nhạt xen kẽ các vết xanh đậm, thùy lá ngừng phát triển, lá nhỏ hẹp, xoăn cong Cây bệnh kém phát triển, thân mảnh Quả bị bệnh thường nhỏ, biến dạng, trên vỏ quả có các vết đậm, nhạt loang lổ Trên cây bí xanh, bầu, mướp CMV cũng gây ra triệu chứng tương tự

Triệu chứng bệnh trên cây khoai từ: Triệu chứng chỉ xuất hiện trên lá gây

ra khảm loang lổ xanh đậm xen kẽ xanh nhạt, nếu bệnh bị nặng sẽ gây ra lá biến dạng và cây không phát triển bình thường

2.3.1.8 Biện pháp kiểm soát

- Sử dụng giống kháng bệnh, giống sạch bệnh từ nguồn nuôi cấy mô và

xử lý nhiệt độ trong quá trình nuôi cấy mô có thể hạn chế được virus gây bệnh

- Luân canh với cây trồng không là ký chủ của bệnh

- Nhổ bỏ cây bệnh

- Làm sạch cỏ dại xung quanh ruộng

- Phòng trừ rệp bằng thuốc hóa học và bằng con đường sinh học

- Do khả năng sinh sản của rệp rất lớn nên rất dễ xuất hiện rệp kháng thuốc Vì thế, sau 3 ngày phun thuốc phải kiểm tra lại, nếu thấy số lượng rệp không giảm thì phải thay thuốc khác

- Khử trùng dụng cụ, phương tiện thu hái, hạn chế vết thương xây sát trong quá trình chăm sóc

- Bón phân cân đối, chăm sóc để cây sinh trưởng tốt, bảo vệ cây, tránh nhiễm vào giai đoạn cây con

2.4 Một số nghiên cứu trong và ngoài nước về Cucumber mosaic virus trong

thời gian gần đây

2.4.1 Cucumber mosaic virus

2.4.1.1 Tình hình nhiên cứu ngoài nước

Ki Hyun Ryu và cs vào năm 1998 đã chứng minh rằng protein vỏ của CMV quy định dãy ký chủ của CMV khi nhiễm vào ngô

Năm 2006, Neeraj Verma và cs đã chứng minh trình tự protein vỏ cho

thấy phân lập CMV từ hoa phong lữ (Pelargonium spp.) thuộc nhóm II.

Khalid Pervaiz Akhtar và cs năm 2008 đã lây truyền CMV qua rệp đào

(Myzus persicae) trên cà chua tại vùng Faisalabad của Pakistan và kiểm tra lại

bằng kỹ thuật RT-PCR đã phát hiện ra rằng CMV thuộc nhóm IA

Bahadra Murthy Vemulapati và cs năm 2009 đã nghiên cứu trình tự gen

protein vỏ chứng minh rằng CMV lây nhiễm ớt cựa gà (Capsicum annuum L.) ở

Ấn Độ thuộc nhóm IB

Vào năm 2010, Dheepa và cs đã dùng kỹ thuật DAC-ELISA để kiểm tra việc truyền CMV vào chuối bởi rệp và cơ học

Heiko Ziebell và cs năm 2011 đã chứng minh protein 2b có thể ảnh hưởng

gián tiếp tới sự truyền của CMV thông qua rệp muội.

Mùa hè năm 2012, Mehdi Safaeizadeh và cs đã dùng kỹ thuật

DAS-ELISA để thử các virus khác nhau trên 4 mẫu lá cây Ibicella lutea ở miền

Varamin thuộc vùng Tehran của Iran và tất cả các mẫu này đều biểu hiện dương tính với CMV và âm tính với các virus khác Sau đó, sự xuất hiện CMV còn được kiểm chứng bằng các thí nghiệm lây trên các cây thân thảo khác và bằng

cả kỹ thuật RT-PCR Kết quả cho thấy sự kiểm chứng này là đúng và còn phát hiện ra CMV thuộc nhóm IA Đây là báo cáo đầu tiên về sự xuất hiện CMV trên

cây Ibicella lutea tại Iran.

Tháng 7, năm 2012, triệu chứng khảm sọc và đốm bất thường được Rong Wang và cs tìm thấy trên lá ngô ở Bắc Kinh – Trung Quốc Tác nhân gây bệnh được xác định là CMV dựa trên kỹ thuật RT-PCR, Elisa, phương pháp Western Blot và thực hiện theo quy tắc Koch Chủng virus này có tên là ZMBJ – CMV Trình tự đầy đủ của RNA3 của ZMBJ – CMV đã được xác định và đồng nhất với chủng K – CMV (95.3%) và SD – CMV (94.96%) Qua phân tích sự phát sinh chủng loài cho thấy ZMBJ – CMV được nhóm vào K – CMV vầ SD – CMV trong nhóm phụ IB Đây là báo cáo đầu tiên về sự lây nhiễm và phân tích

sự phát sinh củng loài của CMV trên ngô tại Trung Quốc

Kouakou Théodore Kouadio và cs năm 2014 đã viết một bản báo cáo đầu tiên về sự xuất hiện của satRNA kết hợp với CMV phân lập từ chuối

(Musa sp.) tại Bờ Biển Ngà.

2.4.1.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Nói chung, các nghiên cứu về bệnh virus Cucumber mosaic virus tại Việt

Nam còn khá mới, chỉ có một số các nghiên cứu sau đây:

Nguyễn Ngọc Bích, trường Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh năm

2003 đã bước đầu nghiên cứu một số bệnh virus chính trên vùng thuốc lá tỉnh Tây Ninh Dùng DAS-ELISA để chẩn đoán một số virus trên thuốc lá như TSWV, CMV, TMV đồng thời điều tra tình hình bệnh virus trên địa bàn tỉnh Tây Ninh Kết quả cho thấy các virus này đang phát triển khá mạnh ở vùng thuốc lá tỉnh Tây Ninh

Lâm Ngọc Hạnh, trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh vào năm

2005 đã tiến hành đánh giá tình hình nhiễm bệnh virus TMV, CMV, TSWV trên

cà chua ở tỉnh Lâm Đồng, sử dụng kỹ thuật DAS-ELISA và xây dựng quy trình chẩn đoán TMV bằng kỹ thuật RT-PCR

Huỳnh Vĩnh Khang, trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh vào năm 2006 đã tiến hành nghiên cứu một số virus (TMV, CMV) gây bệnh trên cây

Ớt tại huyện Củ Chi, TP Hồ Chí Minh bằng kỹ thuật ELISA và xây dựng quy trình phát hiện CMV bằng kỹ thuật RT-PCR.

Nhóm các nhà khoa học thuộc Viện Công nghệ sinh học (Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam) năm 2007-2008, đã ứng dụng thành công kỹ thuật

di truyền RNAi trong nghiên cứu tạo cây trồng chuyển gen kháng bệnh virus Tạo cây thuốc lá mang cấu trúc RNAi của gen mã hóa protein vỏ virus đó

là đề tài đã thiết kế thành công 6 cấu trúc RNAi, vượt mức dự kiến 3 cấu trúc Bao gồm 3 cấu trúc RNAi đăng ký (CMV-CPi, PVY-CPi và PRSV-CPi) và 3 cấu trúc vượt mức (TbLCV-CPi, TMV-CPi và TMV-CMV-CPi) Trong đó, cấu trúc đa đoạn RNAi TMV-CMV-CPi là sự kết hợp hai đoạn gen CPi của virus TMV và CMV với mục đích có khả năng tạo cây kháng được cả hai virus này cùng lúc; tạo được vài trăm dòng thuốc lá chuyển gen K326 ở thế hệ T0 mang cấu trúc RNAi đã thiết kế ở trên, những dòng T0 đã được chuyển ra nhà kính để kiểm tra Kiểm tra tính kháng virus bằng gây bệnh nhân tạo ở thế hệ T0 thu được có tỷ lệ kháng (số dòng kháng hoàn toàn/số dòng kiểm tra) virus CMV là 70,9% (100/141), PVY là 84,1% (58/69), TMV là 74,5% (70/94) và đồng thời hai loại virus TMV và CMV là 70,8% (34/48)

Phạm Thị Vân và cộng sự tại Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, năm 2009 đã xác định virus gây bệnh khảm dưa chuột

(Cucumber mosaic virus) trên cây thuốc lá tại Cao Bằng và Hà Tây thông qua

tách dòng và giải trình tự gien mã hóa protein MP và CP Kết quả cho thấy, đã tách dòng và xác định thành công trình tự đoạn gen mã hóa cho protein MP và

CP của hai thể phân lập CMV Hai đoạn gen này có độ dài và mã số đăng ký trong Ngân hàng gien quốc tế là 1913 nucleotit, AM048831 (Hà Tây) và 1908 nucleotit, AM048830 (Cao Bằng) Đoạn gien mã hóa cho protein MP và CP của hai thể phân lập có kích thước tương ứng là 840 và 657 nucleotit Phân tích cây phân loại cho biết hai thể phân lập CMV Cao Bằng và Hà Tây thuộc nhóm IB

Phần 3 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Đối tượng, vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu

3.1.1 Đối tượng nghiên cứu

+ Bệnh khảm lá khoai từ ở một số tỉnh phía (Hà Nội, Hưng Yên, Bắc Giang, Thái Bình, Hà Tĩnh )

+ Nghiên cứu Cucumber mosaic virus trên cây khoai từ

3.1.2 Vật liệu và dụng cụ nghiên cứu

3.1.2.1 Vật liệu:

- Một số giống khoai từ đang được trồng ngoài sản xuất

- Một số cây chỉ thị: Cây họ rau muối (Chenopodiaceae) như

Chenopodium amaranticolor, Chenopodium quinoa, họ cà (Solanaceae) như Nicotiana banthamiana, Nicotiana tabacum var Xanthi.

- Bình thủy tinh loại 50 – 1000ml

- Pipet tự động một đầu côn: 10-20 μl, 100 μl, 200 μl …

- Bản Elisa: bằng nhựa (polystyrene), 96 giếng, liên kết không đặc hiệu các loại protein

- Máy đọc Elisa: 1 loại thiết bị so màu vị phiến nhằm lượng hóa màu phản ứng

- Chất nền: nhiều loại, tùy thuộc emzyme

- Kháng thể các loại

- Enzyme: nhiều loại, cần có chất tương ứng, phổ biến nhất là alkaline phosphatase (cơ chất tương ứng là NPP).

- Các loại dung dịch đệm: Đệm nghiền mẫu (PBS – T – 2% PVP), đệm pha kháng thể (đệm carbonate), đệm rửa (PBS - Tween), đệm pha chất nền (cơ chất) (đệm Substrate)

3.1.2.3 Hóa chất

Bột cacboradum, nước cất, silicagen

Các hóa chất pha dung dịch đệm lây: đệm Phosphate pH 7.0 (0.01 M)

Cách chuẩn PPB buffer: Cân 0.87 g K2HPO4 pha với 500 ml nước cất và 0.69 g KH2PO4 với 500 ml Rồi sau đó trộn đều để được 1000 ml dung dịch đệm Phosphate pH 7.0 Đem hấp 15 phút tại 1.5 atm rồi để nguội đem giữ trong tủ lạnh 4oC

 Lây nhiễm nhân tạo: bột Carborundum 600 mesh, hoá chất pha đệm (K2HPO4, KH2PO4, Na2SO3, nước cất)

 Kỹ thuật RT-PCR:

Chiết RNA tổng số từ mô cây: đệm CATB (Cetyl trimethyl amoni bromua), LiCl2 10M, Chloroform, Isoamylalcohol, β-Mercaptoethanol (BME), Ethanol 70% (cồn 70%)

Phản ứng RT-PCR: nước cất, GoTaq Mix (2x) (đệm PCR có sắn taq, dNTPs), cặp mồi chung cho vùng gene CI (mồi xuôi dòng, mồi ngược dòng), M-MuLV (enzyme phiên mã ngược xúc tác phản ứng tổng hợp sợi cDNA đầu tiên

từ RNA và tổng hợp chuỗi DNA đầu tiên)

Điện di agarose: agarose, nước cất, đệm TAE (Tris, acetic acid, EDTA)

Tinh sạch DNA virus: sử dụng bộ kit chiết thương mại của hãng gồm: đệm Binding (Binding Buffer), đệm rửa (Wash Buffer), đệm Elution

 Bảo quản mẫu: silica gel

3.1.3 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

- Nghiên cứu tại phòng thí nghiệm của Bộ môn Bệnh cây – Khoa Nông học – Học viện Nông Nghiệp Việt Nam

- Trung tâm bệnh cây nhiệt đới – Học viện Nông Nghiệp Việt Nam

- Khu thí nghiệm nhà lưới Khoa Nông học – Học viện Nông Nghiệp Việt Nam

- Địa điểm điều tra: một số tỉnh (Hà Nội, Hưng Yên, Thái Bình, Bắc Giang, Hà Tĩnh )

- Thời gian nghiên cứu từ 01/2016 đến 07/2016

3.2 Nội dung nghiên cứu

- Điều tra thành phần bệnh hại trên cây khoai từ tại các tỉnh Hà Nội, Bắc Giang, Cao Bằng, Thái Bình, Hà Tĩnh

- Điều tra diễn biến bệnh khảm lá trên cây khoai từ tại các tỉnh Hà Nội, Bắc Giang, Cao Bằng, Thái Bình, Hà Tĩnh

- Xác định virus gây bệnh bằng kỹ thuật ELISA và PCR

- Đánh giá tính gây bệnh thông qua lây nhiễm nhân tạo (tiếp xúc cơ học) trên cây chỉ thị, cây ký chủ phụ và một số giống cây trồng khác

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Phương pháp điều tra thành phần, diễn biến bệnh khảm lá khoai từ ngoài đồng ruộng

 Áp dụng phương pháp điều tra sâu bệnh hại cây trồng cả Cục Bảo Vệ Thực vật năm 1985:

Trên ruộng lớn : điều tra theo 5 điểm chéo góc, mỗi điểm 30 cây, điều tra toàn bộ số cây trong điểm

 Điều tra diễn biến bệnh khảm lá trên cây khoai từ tại một số tỉnh Hà Tĩnh, Hà Nội, Thái Bình, Bắc Giang, Học viện nông nghiệp Việt Nam Điều tra

ở các thời điểm 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, ngày sau trồng

 Áp dụng quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về phương pháp điều tra phát hiện dịch hại cây trồng (QCVN 01-38: 2010/BNNPTNT):

Tỷ lệ bệnh:

Số cây bị bệnhTLB (%) = - x 100%

Tổng số cây điều tra

3.3.2 Thí nghiệm trong phòng

3.3.2.1 Kỹ thuật RT-PCR

Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction: phản ứng trùng hợp chuỗi) là một trong những kỹ thuật phổ biến trong sinh học phân tử nhằm khuếch đại một đoạn DNA, giúp phát hiện các bệnh di truyền, nhận dạng, chẩn đoán những bệnh nhiễm trùng, tách dòng gene, xác định huyết thống Kỹ thuật này được Kary Mullis phát minh dựa trên ý kiến phát triển một quy trình mà DNA có thể nhân lên nhiều lần một cách nhân tạo qua nhiều chu kỳ sao chép nhờ enzyme DNA polymerase và đã đoạt giải Nobel Hoá học vào tháng 10 năm 1993 (https://vi.wikipedia.org)

Kỹ thuật RT-PCR (Reverse transcription-PCR: PCR phiên mã ngược) là

kỹ thuật áp dụng cho những đối tượng có genome là RNA nhằm khuếch đại một đoạn RNA phục vụ cho mục đích nghiên cứu Kỹ thuật này dựa trên nguyên lý phiên mã ngược: dưới sự xúc tác của enzyme phiên mã ngược (Reverse transcriptase-Rtase) tổng hợp nên sợi DNA bổ trợ (complementary DNA-cDNA) đầu tiên từ RNA thông tin (messenger RNA-mRNA), sau đó thể lai mRNA-cDNA bị biến tính và cắt tuần tự bằng nhiệt và ezyme RNase H, chuỗi cDNA đầu tiên sẽ được dùng làm khuôn mẫu thay thế cho chuỗi mRNA để tổng hợp sợi cDNA thứ hai dưới xúc tác của enzyme DNA polymerase Cuối cùng, dưới xúc tác của enzyme DNA polymerase, qua nhiều chu kỳ sao chép, DNA tái tổ

hợp được khuếch đại nhiều lần và sử dụng để phục vụ những nghiên cứu tiếp theo (Quyền Đình Thi, 2005; Quyền Đình Thi và Nông Văn Hải, 2008).

Kỹ thuật RT-PCR gồm 3 bước thực hiện: (1) chiết RNA tổng số từ mô cây, (2) thực hiện phản ứng RT-PCR để khuếch đại gene của virus, (3) kiểm tra kết quả bằng điện di agarose

3.3.2.1.1 Chiết RNA tổng số từ mô cây

 Lấy 600µl dịch nghiền vào ống 1,5ml, ủ trong bể nhiệt ở nhiệt độ

65oC trong 15 phút, sau đó để ở nhiệt độ phòng trong 10 phút Ly tâm nhanh

(5-10 phút) để loại bọt

 Thu dịch trên tủa (700µl) cho vào ống mới, cho Chloroform: