Bệnh viêm dạ dày - ruột truyền nhiễm (TGE) là một bệnh cấp tính, rất dễ lây lan ở lợn và gây ra tổn thất lớn về kinh tế. Trong nghiên cứu này, 5 mẫu bệnh phẩm là phân và ruột của lợn bị tiêu chảy thu thập được tại 2 tỉnh Bắc Ninh và Thái Bình trong năm 2015 đã được sử dụng để chẩn đoán virus gây bệnh TGE. Kết quả chẩn đoán cho thấy 5/5 mẫu bệnh phẩm dương tính với virus TGE.
KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXV SỐ - 2018 NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC PHÂN TỬ CỦA VIRUS GÂY VIÊM DẠ DÀY - RUỘT TRUYỀN NHIỄM (TGE) Ở LN TẠI BẮC NINH VÀ THÁI BÌNH NĂM 2015 Lê Văn Phan, Đồng Văn Hiếu, Lại Thị Lan Hương, Nguyễn Thị Lan Khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam TÓM TẮT Bệnh viêm dày - ruột truyền nhiễm (TGE) bệnh cấp tính, dễ lây lan lợn gây tổn thất lớn kinh tế Trong nghiên cứu này, mẫu bệnh phẩm phân ruột lợn bị tiêu chảy thu thập tỉnh Bắc Ninh Thái Bình năm 2015 sử dụng để chẩn đoán virus gây bệnh TGE Kết chẩn đoán cho thấy 5/5 mẫu bệnh phẩm dương tính với virus TGE Kết phân tích trình tự nucleotide (nt) amino acid (aa) sở giải mã trình tự gen S cho thấy chủng virus TGE có mức độ tương đồng với cao, tỷ lệ tương đồng từ 99,5 – 100 % trình tự nt 98,9 – 100 % trình tự aa Khi so sánh với chủng virus vacxin từ Trung Quốc (attenuated H, mã số truy cập GenBank: EU074218), chủng virus TGE nghiên cứu có tỷ lệ tương đồng từ 99,1 – 99,3 % trình tự nt 97,9 – 98,2 % trình tự aa Từ khóa: RT-PCR, TGE, gen S Molecular characterization of transmissible gastroenteritis virus (TGEV) from pigs in Bac Ninh and Thai Binh in 2015 Le Van Phan, Dong Van Hieu, Lai Thi Lan Huong, Nguyen Thi Lan SUMMARY Transmissible gastroenteritis (TGE) is a highly contagious, acute disease, causing economic loss in the pig production Five intestine and fecal samples were collected from the diarrheal pigs in the farms in Thai Binh and Bac Ninh provinces in 2015 was used for identifying TGEV by rapid kit and RT-PCR technique The studied results showed that 5/5 samples were positive with TGEV The result of S gene sequence analysis indicated that five Vietnamese TGEV isolates shared a high similarity level of nucleotide sequence (99.5 – 100%) and amino acid sequence (98.9 – 100%) The similarity level of nucleotide and amino acid sequences of these isolates compared to those of the Chinese vaccine TGEV strain (Genbank accession number: EU074218) was 99.1 – 99.3% and 97.9 – 98.2%, respectively Keywords: RT-PCR, TGE, S gene I ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh viêm dày-ruột truyền nhiễm (TGE) bệnh truyền nhiễm nguy hiểm lợn virus thuộc họ Coronavirus gây Bệnh gây tổn thất lớn kinh tế ngành chăn nuôi lợn thông qua tác động làm cho lợn bị tiêu chảy, bỏ ăn, nôn mửa, thể nước giảm tăng trọng (Moon cs., 1973; Simkins cs., 1989; Cubero cs., 1992; Shoup cs., 1996) tỷ lệ tử vong cao, lên tới 100% lợn sơ sinh (Saif Wesley, 1992) TGEV có cấu trúc hạt virus hình cầu bao bọc chứa sợi dương RNA với genome khoảng 28,5 kb Bộ gen chứa chín khung đọc mở (ORFs) mã hoá tổng hợp bốn loại protein cấu trúc gồm gai (S), vỏ (E), màng (M), nucleoprotein (N) năm protein không cấu trúc (Meng Ren, 2010; Wang cs., 2010) Glycoprotein gai 17 KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXV SỐ - 2018 (Spike - S) giúp TGEV gắn vào thụ thể tế bào thông qua liên kết aminopeptidase N, protein S ảnh hưởng lớn đến độc lực chủng virus TGE trình tự đầu 5’ gen S tốt để phân biệt loại virus từ nhóm Coronavirus (Valle cs., 2005) PHƯƠNG PHÁP Ở Việt Nam, nghiên cứu nguyên nhân gây tiêu chảy lợn chủ yếu tập trung vào PEDV, nghiên cứu vai trò gây bệnh virus gây bệnh TGE Nghiên cứu nhằm xác định vai trò TGEV lợn tiêu chảy lưu hành số trang trại địa bàn nghiên cứu Bước đầu nghiên cứu đặc điểm sinh học phân tử số chủng TGEV làm sở cho nghiên cứu sâu nghiên cứu chế tạo kit chẩn đoán phát triển vacxin phòng bệnh - Nghiên cứu số đặc điểm sinh học phân tử số chủng virus TGE gây tiêu chảy lợn địa nghiên cứu 2.1 Nội dung nghiên cứu - Chẩn đoán virus TGE lợn mắc tiêu chảy Bắc Ninh Thái Bình năm 2015 phương pháp RT-PCR 2.2 Vật liệu - Mẫu bệnh phẩm: Năm mẫu bệnh phẩm gồm phân ruột thu thập từ lợn từ đến 12 ngày tuổi mắc tiêu chảy nuôi trang trại Bắc Ninh Thái Bình năm 2015 Mẫu sau nghiền nhỏ, đồng dung dịch 1xPBS bảo quản -80oC tới sử dụng (bảng 1) II NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ Bảng Thông tin mẫu bệnh phẩm sử dụng nghiêm cứu TT Ký hiệu mẫu Ngày tuổi lợn lấy mẫu Địa phương thu thập Loại mẫu T1/BacNinh/VN/2015 11 Bắc Ninh Phân T3/BacNinh/VN/2015 Bắc Ninh Phân T7/ThaiBinh/VN/2015 11 Thái Bình Ruột T9/ThaiBinh/VN/2015 10 Thái Bình Ruột T10/ThaiBinh/VN/2015 12 Thái Bình Ruột 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Phương pháp phát nhanh virus Rapid Kit Mẫu sau đồng thử với Kit chẩn đoán nhanh để chẩn đoán với loại kháng nguyên gồm TGEV, PEDV Rotavirus, Antigen Rapid TGE Ag test, Antigen Rapid PED Ag test Rotavirus Kit (Bionote, Hàn Quốc) Phương pháp tiến hành theo hướng dẫn nhà sản xuất 2.3.2 Phương pháp tách chiết RNA TGEV Trizol (Invitrogen) dùng để tách chiết RNA virus TGE, bước tiến hành theo hướng dẫn nhà sản xuất 250 µl huyễn 18 dịch dung giải 750 µl dung dịch Trizol, trộn bổ sung 200 µl dung dịch Chloroform Huyễn dịch trộn cách vortex mạnh 15 giây ủ nhiệt độ phòng 10 phút, ly tâm 12.000 vòng/phút 10 phút 4oC Sau ly tâm, 500 µl dịch có chứa RNA chuyển vào ống Eppendorf RNA kết tủa 500 µl dung dịch Isopropanol Sau ly tâm loại bỏ dịch nổi, RNA rửa hai lần ml dung dịch Ethanol 70%, ly tâm 12.000 vòng/phút 10 phút 4oC RNA hong khơ hòa tan 30 µl nước vô trùng loại Rnase bảo quản -20oC tới sử dụng 2.3.3 Phương pháp tổng hợp cDNA KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXV SỐ - 2018 2.3.4 Phương pháp tiến hành phản ứng PCR giải trình tự gen SuperScriptTM Kit sử dụng để tổng hợp cDNA với mồi Oligo dT ’ - C T G T G A AT G C T G C G A C TA C GATTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’ 20 μl hỗn hợp gồm μl RNA, μl nước loại RNase, μl dNTPs, μl oligo dT, μl SuperscriptTM II RNase H-reverse transcriptase, μl RNase inhibitor 4μl 5x first strand buffer đặt máy PCR Phản ứng tổng hợp cDNA thực 37°C 60 phút sau 70°C 10 phút AccuPower PCR PreMix (BIONEER) Kit sử dụng cho phản ứng PCR Kit chứa DNA taq-polymerase thành phần cần thiết cho trình khuếch đại DNA Cặp mồi TGE-F TGE-R sử dụng công bố trước (Kim cs., 2001; Meng Ren, 2010) (bảng 2) Bảng Trình tự cặp mồi sử dụng cho phản ứng PCR giải trình tự gen Tên mồi Trình tự cặp mồi (F: mồi xi; R: mồi ngược) Vị trí gen Spike (S) TGE-F 5’-GTGGTTTTGGTYRTAAATGC-3’ 16-35 TGE-R 5’-CACTAACCAACGTGGARCTA-3’ 855–874 Sản phẩm PCR (bp) Nguồn 850 Kim cs., 2001; Meng Ren, 2010 Phản ứng PCR thực theo chương trình 94°C phút, 35 chu kỳ (94°C 30 giây, 52°C 45 giây, 72°C phút) 10 phút 72°C Sản phẩm PCR kiểm tra thạch agarose 1% Sản phẩm PCR sau gửi tới cơng ty 1st BASE (Singapore) để giải trình tự gen DNAstar để so sánh chủng TGEV lưu hành địa bàn nghiên cứu với chủng giới 2.3.5 Phương pháp xử lý số liệu Các mẫu bệnh phẩm thu thập xác định nhanh tác nhân gây bệnh số Kit chẩn đốn nhanh kết trình bày bảng Các trình tự thu được, BLAST ngân hàng gen địa http://blast.ncbi.nlm nih.gov phân tích phần mềm BioEdit III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết chẩn đoán nhanh mẫu bệnh phẩm với PEDV, TGEV RTV Bảng Kết xác định PEDV, TGEV RTV Kit chẩn đoán nhanh STT Mẫu chẩn đoán PDEV TGEV RTV T1/BacNinh/VN/2015 Âm tính Dương tính Âm tính T3/BacNinh/VN/2015 Âm tính Dương tính Âm tính T7/ThaiBinh/VN/2015 Âm tính Dương tính Âm tính T9/ThaiBinh/VN/2015 Âm tính Dương tính Âm tính T10/ThaiBinh/VN/2015 Âm tính Dương tính Âm tính (PDEV: Porcine Epidemic Diarrhea Virus; TGEV: Transmissible Gastroenteritis Virus; RTV: Rotavirus) Kết thu bảng cho thấy 5/5 mẫu bệnh phẩm có kết chẩn đốn dương tính với TGEV âm tính với hai loại virus lại gồm PEDV RTV Kết phản ứng RT-PCR cho thấy sản phẩm PCR thu có kích thước khoảng 850 bp (dương tính), với kích thước sản phẩm PCR cơng bố trước (Kim cs., 2001; Meng Ren, 2010) 19 KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXV SỐ - 2018 850 bp Hình Kết điện di sản phẩm PCR chẩn đoán TGEV (Giếng 1: đối chứng âm; giếng 2: mẫu T1/BacNinh/2015; giếng 3: mẫu T1/BacNinh/2015; giếng 4: mẫu T7/ThaiBinh/2015; giếng 5: T7/ThaiBinh/2015; giếng 6: T7/ThaiBinh/2015; Giếng M: Marker 1kb) 3.2 Kết phân tích trình tự gen S xây dựng phả hệ (99,6%) với chủng NEB72-RT (M94099 -Spain 1990) Tây Ban Nha Kết giải trình tự gen phân tích trình tự gen S virus TGE cho thấy mức độ tương đồng cao trình tự nucleotide (nt) so sánh chủng virus TGE nghiên cứu với nhau, tỷ lệ tương đồng nằm khoảng từ 99,5 – 100% Khi so sánh với chủng virus TGE tham chiếu khác, mức đô tương đồng dao động từ 81 – 99,6% (bảng 4) Cụ thể chủng virus TGE Việt Nam có tỷ lệ tương đồng cao với chủng virus TGE phân lập Tây Ban Nha, tỷ lệ tương đồng dao động từ 99,5 - 99,6% Phân tích điểm đột biến trình tự nt cho thấy, chủng TGE thực địa Việt Nam có điểm sai khác với với chủng tham chiếu nghiên cứu khác Cụ thể, đột biến gen vị trí 12 (T-C); 81 (T-G) 622 (G-T) chủng T1 T3, 760 (G-T) chủng T7 T10, 776 (C-A) chủng T9 quan sát thấy chủng thực địa thu thập đầu năm 2015 so với chủng TGE Virulent Purdue Mỹ (DQ811789) (Số liệu hiện) Khi so sánh với chủng virus TGE Virulent purdue (DQ811789), kết cho thấy mức độ tương đồng nucleotide cao, khoảng 99,3 – 99,5% Trình tự nt chủng TGE Việt Nam có độ tương đồng cao với số chủng TGEV vacxin Trung Quốc (chủng H165 H16) (bảng 4) Đặc biệt đó, chủng TGE thực địa Việt Nam có độ tương đồng cao 20 Mức độ tương đồng trình tự aa mã hóa gen S chủng TGEV thu thập 90 – 100% 81-99,3% chủng tham chiếu khác Một số điểm đột biến ghi nhận vị trí aa 27 (H – Q), 218 (A – S) 254 (V – N) Ngoài ra, mẫu T9 có đột biến vị trí aa 259 (N-T) (bảng 5) Phân tích phát sinh lồi hình cho thấy chủng TGEV xếp nhánh riêng nhóm với chủng TGEV NEB72 phân lập 99.3 99.4 99.3 99.4 99.3 97.7 99.3 T9/ThaiBinh/VN/2015 T10/ThaiBinh/VN/2015 JQ693050(DAE Korea 2013) JQ693049(133 Korea 2013) DQ001167(TSX China 2005) M94101(PUR46-MAD Spain 2001) DQ811788(Purdue P115 USA 2009) M94101(PUR46-MAD Spain 2001) DQ811789(virulent Purdue USA 2011) M94099(NEB72-RT Spain 1990) AY335548(TS China 2003) AF494337(TH-08 China 2003) AY587882(HN2002 China 2004) EU074218(Vaccine H China 2010) EU074218(H165 Vaccine China 2010) FJ755618(Vaccine H16 China 2010) KC609371(ZH China 2013) DQ811786(Miller M60 USA 2011) DQ811785(Miller M6 USA 2009) >AJ884686(VB-3I Cuba 2005) 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 98 81.9 81.9 97.7 97.7 97.9 98 97.7 97.7 97.9 99.3 97.7 97.9 99.3 97.9 98.1 99.3 99.6 99.3 99.4 95.3 99.3 99.4 99.6 99.5 98.1 99.6 99.4 95.3 99.3 99.4 99.6 99.5 100 99.6 99.6 T7/ThaiBinh/VN/2015 100 T3/BacNinh/VN/2015 2 100 T1/BacNinh/VN/2015 Mẫu Stt 82.1 98.1 97.9 97.9 98 99.1 97.9 98 99.1 98.2 99.5 99.4 99.3 99.1 99.3 95.4 99.1 99.3 100 99.6 100 82 98 97.7 97.7 97.9 99.3 97.7 97.9 99.3 98.1 99.6 99.5 99.4 99.3 99.4 95.4 99.3 99.4 99.6 100 82.1 98.1 97.9 97.9 98 99.1 97.9 98 99.1 98.2 99.5 99.4 99.3 99.1 99.3 95.4 99.1 99.3 100 81.6 97.6 97.4 97.4 97.5 99.4 97.4 97.5 99.4 97.7 99.7 99.1 99.5 99.4 99.5 94.9 99.4 100 81.8 97.7 97.5 97.5 97.6 100 97.5 97.6 99.5 97.9 99.6 99.3 99.6 99.5 99.6 95.1 100 83.8 96.3 96.1 96.1 96.2 95.1 96.1 96.2 95.3 96.5 95.2 95.8 95.4 95.3 95.4 100 82 97.9 97.6 97.6 97.7 99.6 97.6 97.7 99.8 98 99.7 99.6 100 99.8 100 81.9 97.7 97.5 97.5 97.6 99.5 97.5 97.6 99.7 97.9 99.6 99.5 99.8 100 10 82 97.9 97.6 97.6 97.7 99.6 97.6 97.7 99.8 98 99.7 99.6 100 11 82.4 98.2 98 98 98.1 99.3 98 98.1 99.5 98.3 99.4 100 12 81.8 97.9 97.6 97.6 97.7 99.6 97.6 97.7 99.6 98 100 13 83 99.8 99.6 99.6 99.5 97.9 99.6 99.7 97.9 100 14 82 97.7 97.5 97.5 97.6 99.5 97.5 97.6 100 15 82.7 99.7 99.6 99.6 99.5 97.6 99.6 100 16 82.6 99.6 99.7 99.5 99.8 97.5 100 17 81.8 97.7 97.5 97.5 97.6 100 18 82.7 99.5 99.6 99.4 100 19 Bảng Tỷ lệ tương đồng (%) trình tự nucleotide chủng TGEV thực địa với với chủng virus TGE tham chiếu khác 82.7 99.6 99.5 100 20 82.6 99.6 100 21 82.8 100 22 100 23 KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXV SỐ - 2018 21 22 99.4 98.6 T3/BacNinh/VN/2015 T7/ThaiBinh/VN/2015 T9/ThaiBinh/VN/2015 T10/ThaiBinh/VN/2015 JQ693050 (DAE Korea 2013) JQ693049 (133 Korea 2013) DQ001167 (TSX China 2005) DQ811788 (Purdue P115 USA 2009) M94101 (PUR46-MAD Spain 2001) DQ811789 (virulent Purdue USA 2011) M94099 (NEB72-RT Spain 1990) AY335548 (TS China 2003) AF494337 (TH-08 China 2003) AY587882 (HN2002 China 2004) EU074218 (H165 Vaccine China 2010) KC609371 (ZH China 2013) DQ811786 (Miller M60 USA 2011) DQ811785 (Miller M6 USA 2009) AJ884686 (VB-3I Cuba 2005) 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 81.1 97.2 96.5 96.5 98.2 96.8 98.6 97.5 99.3 98.2 94.7 98.2 98.9 98.9 98.9 98.9 100 100 T1/BacNinh/VN/2015 1 Mẫu Stt 81.1 97.2 96.5 96.5 98.2 96.8 98.6 97.5 99.3 98.6 99.4 98.2 94.7 98.2 98.9 98.9 98.9 98.9 100 81.1 97.5 96.8 96.8 97.9 97.2 98.2 97.9 98.9 98.2 99.3 97.9 95.1 97.9 98.6 100 99.3 100 81.1 97.5 96.8 96.8 97.9 97.2 98.2 97.9 98.9 98.2 99.4 97.9 95.4 97.9 98.6 99.3 100 81.1 97.5 96.8 96.8 97.9 97.2 98.2 97.9 98.9 98.2 99.3 97.9 95.1 97.9 98.6 100 80.8 97.2 96.5 96.5 98.6 96.8 98.9 97.2 99.6 98.9 99.5 98.6 94.4 98.6 100 81.1 96.8 96.1 96.1 100 96.5 99.9 97.2 98.9 98.9 99.6 98.6 94.0 100 83.6 95.1 94.4 94.4 94.0 94.7 95.1 95.4 94.7 95.8 95.4 94.7 100 81.5 96.8 96.1 96.1 98.6 96.5 99.6 97.2 89.9 95.1 99.8 100 81.8 97.2 96.5 96.5 98.9 96.8 100 97.5 99.3 99.6 100 10 82.5 97.9 97.2 97.2 98.2 97.5 99.3 98.2 98.6 100 11 81.8 97.2 96.5 96.5 98.9 96.8 99.3 97.5 100 12 82.2 99.6 98.9 98.9 97.2 99.3 97.5 100 13 81.8 97.2 96.5 96.5 98.9 96.8 100 14 81.5 99.3 98.9 98.9 96.5 100 15 81.1 96.8 96.1 96.1 100 16 Bảng Tỷ lệ tương đồng (%) trình tự amino acid chủng virus TGE thực địa với với chủng virus TGE tham chiếu khác 81.5 98.9 98.6 100 17 81.1 98.9 100 18 81.1 100 19 100 20 KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXV SỐ - 2018 KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXV SỐ - 2018 DQ811788(Purdue P115 USA 2009) 63 AF494337(TH-08 China 2003) M94101(PUR46-MAD Spain 2001) M94101(PUR46-MAD Spain 2001) 52 JQ693049(133 Korea 2013) 93 EU074218(H165 Vaccine China 2010) JQ693050(DAE Korea 2013) 66 58 M94099(NEB72-RT Spain 1990) T9/ThaiBinh/VN/2015 99 86 T1/BacNinh/VN/2015 T3/BacNinh/VN/2015 T7/ThaiBinh/VN/2015 T10/ThaiBinh/VN/2015 100 DQ811789(virulent Purdue USA 2011) AY335548(TS China 2003) DQ811785(virulent Miller M6 USA 2009) 96 AY587882(HN2002 China 2004) 54 KC609371(ZH China 2013) DQ811786(Miller M60 USA 2011) 55 57 52 EU074218(Vaccine H China 2010) FJ755618(Vaccine H16 China 2010) DQ001167(TSX China 2005) >AJ884686(VB-3I Cuba 2005) 0.01 Hình Cây phả hệ mẫu virus TGE thực địa ( ) với chủng virus TGE tham chiếu Tây Ban Nha năm 1990 (M94099), chủng 133 Hàn Quốc chủng H165 vaccine nhược độc Trung Quốc, chủng virus độc P115 Mỹ công bố năm 2009, chủng virus có quan hệ di truyền gần (Hình 4) Hai nhánh có liên quan chặt chẽ với chủng tham chiếu TGEV virulent Purdue (DQ811789), nhánh khác gồm số chủng TGEV phân lập từ Mỹ Trung Quốc Từ cho thấy chủng TGEV Việt Nam có quan hệ gần gũi với số chủng TGEV giới Mỹ, Tây Ban Nha Trung Quốc Gen S có vai trò quan trọng định độc lực TGEV (Krempl cs., 1998; Krempl cs., 2000) liên kết với sialoglycoprotein bề mặt tế bào (Schwegmann cs., 2001) Các chủng TGEV Việt Nam có độ tương đồng cao 99,6% với chủng NEB72-RT (M94099 -Spain 1990) Tây Ban Nha, chủng công bố chủng độc tính có vị trí kháng nguyên C B tham gia vào vị trí gắn thụ thể (RBS) có tính với tế bào ruột khơng có điểm đột biến đặc trưng coronavirus gây bệnh hô hấp lợn (PRCVs) bắt nguồn từ TGEV Tuy nhiên, chủng thực địa Việt Nam có acid amin thay đổi tìm thấy vị trí 27, 218, 254 259 so với chủng TGE virulent Purdue Mỹ (DQ811789) Những thay ảnh hưởng đến khả gây bệnh chủng TGEV (Sanchez cs., 1999) Các nghiên cứu tập trung phân tích vai trò điểm đột biến gen S chủng TGEV gây bệnh thực địa dựa phân tích đặc điểm dịch tễ bệnh cảnh lợn mắc bệnh 23 KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXV SỐ - 2018 Hình So sánh trình tự amino acid đoạn gen S chủng virus TGE thu thập từ thực địa với với chủng virus TGE tham chiếu khác 24 KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXV SỐ - 2018 IV KẾT LUẬN Nghiên cứu bước đầu xác định nguyên nhân gây tiêu chảy lợn trang trại lợn Bắc Ninh Thái Bình virus TGE Kết phân tích trình tự gen S cho thấy, chủng virus TGE nghiên cứu có tương đồng với cao trình tự nucleotide (99,5 – 100 %) amino acid (98,9 – 100 %) Các chủng virus TGE Việt Nam có tỷ lệ tương đồng từ 99,1 – 99,3 % trình tự nt từ 97,9 – 98,2 % trình tự aa so sánh với chủng virus vacxin Trung Quốc TÀI LIỆU THAM KHẢO Cubero MJ., Bernard S., Leon L., Berthon P., Contreras A (1992) Pathogenicity and antigen detection of the Nouzilly strain of transmissible gastroenteritis coronavirus, in 1-week-old piglets J Comp Pathol, 106: 61-72 Kim S Y., Song D S., Park B K (2001) Differential detection of transmissible gastroenteritis virus and porcine epidemic diarrhea virus by duplex RT-PCR J Vet Diagn Invest, 13: 516–520 Krempl C., Ballesteros ML., Enjuanes L., Herrler G (1998) Isolation of hemagglutination-defective mutants for the analysis of the sialic acid binding activity of transmissible gastroenteritis virus Adv Exp Med Biol, 440: 563-8 Moon HW., Norman JO., Lambert G (1973) Age dependent resistance to transmissible gastroenteritis of swine (TGE) I Clinical signs and some mucosal dimensions in small intestine Can J Comp Med, 37: 157-66 Saif LJ and Wesley R (1992) Transmissible gastroenteritis In: Diseases of swine (ed Leman AD SB, Glock RD, et al.), pp 362386 Iowa State University Press, Ames, IA Schwegmann C., Zimmer G., Yoshino T., Enss M., Herrler G (2001) Comparison of the sialic acid binding activity of transmissible gastroenteritis coronavirus and E coli K99 Virus Res, 75: 69-73 Simkins RA., Saif LJ., Weilnau PA (1989) Epitope mapping and the detection of transmissible gastroenteritis viral proteins in cell culture using biotinylated monoclonal antibodies in a fixed-cell ELISA Arch Virol, 107: 179-90 10 Valle MB., Landa HD., Beiras AMA., Portal SC., Batista ER., Redondo AV., Varela RU., Lepoureau MTF (2005) Transmissible gastroenteritis in Cuba: experimental reproduction of the disease and molecular characterization of the virus Span J Agric Res, 3: 267-274 Krempl C., Ballesteros M L., Zimmer G., Enjuanes L., Klenk H D., Herrler G (2000) Characterization of the sialic acid binding activity of transmissible gastroenteritis coronavirus by analysis of haemagglutination-deficient mutants J Gen Virol, 81: 489-96 11 Wang C., Chen J., Shi H., Qiu H., Xue F., Liu C., Zhu Y., Liu S., Almazan F., Enjuanes L., Feng L (2010) Molecular characterization of a Chinese vaccine strain of transmissible gastroenteritis virus: mutations that may contribute to attenuation Virus Genes, 40: 403-9 Meng F and Ren X (2010) Characterization and utility of monoclonal antibodies against spike protein of transmissible gastroenteritis virus Lett Appl Microbiol, 52: 201-7 Ngày nhận 21-9-2017 Ngày phản biện 5-10-2017 Ngày đăng 1-1-2018 25 ... bệnh - Nghiên cứu số đặc điểm sinh học phân tử số chủng virus TGE gây tiêu chảy lợn địa nghiên cứu 2.1 Nội dung nghiên cứu - Chẩn đoán virus TGE lợn mắc tiêu chảy Bắc Ninh Thái Bình năm 2015 phương... TGE Nghiên cứu nhằm xác định vai trò TGEV lợn tiêu chảy lưu hành số trang trại địa bàn nghiên cứu Bước đầu nghiên cứu đặc điểm sinh học phân tử số chủng TGEV làm sở cho nghiên cứu sâu nghiên cứu. .. Phân T7/ThaiBinh/VN /2015 11 Thái Bình Ruột T9/ThaiBinh/VN /2015 10 Thái Bình Ruột T10/ThaiBinh/VN /2015 12 Thái Bình Ruột 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Phương pháp phát nhanh virus Rapid Kit Mẫu