Nghiên cứu đặc điểm sinh học phân tử của klebsiella pneumoniae kháng carbapenem qua cơ chế KPC

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TRẦN NHẬT PHƯƠNG NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC PHÂN TỬ CỦA KLEBSIELLA PNEUMONIAE ĐỀ KHÁNG CARBAPENEM QUA CƠ CHẾ KPC LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC TP HỒ CHÍ MINH, NĂM 2016 Công trình hoàn thành tại: Người hướng dẫn khoa học: GS.TS TRẦN LINH THƯỚC TS.BS PHẠM HÙNG VÂN Phản biện 1: TS Ngô Thị Hoa Phản biện 2: TS Nguyễn Đỗ Phúc Phản biện 3: TS Nguyễn Thị Bạch Huệ Phản biện độc lập 1: TS Ngô Thị Hoa Phản biện độc lập 2: TS Nguyễn Đỗ Phúc Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án họp vào lúc ngày tháng năm Có thể tìm hiểu luận án thư viện: - Thư viện Khoa học Tổng hợp Tp.HCM - Thư viện Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên Klebsiella pneumoniae trực khuẩn gram âm, kị khí tùy ý, không di động, có nang polysacharide đặc trưng giúp vi khuẩn tránh tác nhân gây hại cho tế bào Vi khuẩn gây bệnh viêm phổi, áp xe phổi, viêm màng phổi nhiễm khuẩn khác viêm ruột, viêm màng não, nhiễm khuẩn huyết, nhiễm khuẩn đường tiết niệu K pneumoniae với khả sinh enzyme -lactamase phổ rộng (ESBL) thường kháng đa kháng sinh, gen mã hóa cho đề kháng thường diện plasmid K pneumoniae đề kháng carbapenem vấn đề thách thức đơn vị điều trị lâm sàng Cơ chế đề kháng phổ biến vi khuẩn sinh enzyme carbapenemase gọi Klebsiella pneumoniae Carbapenemase (KPC) Gen mã hóa KPC, gen có khả lan truyền rộng rãi tính kháng thuốc cho vi khuẩn gây bệnh hay khác loài, diện nhân tố di truyền di động transposon Tn4401, cấu trúc có khả chuyển vị với tần suất cao (4,4 x 10-6) trình tự gen mã hóa enzym Transposon Tn4401 chứng minh có khả chèn vào nhiều trình tự khác nhau, plasmid có kích thước khác nhóm incompatible khác nên tính kháng mạnh, gen phát nhiều quốc gia giới gây nên nhiều vụ dịch bệnh với tỷ lệ tử vong cao liệu pháp điều trị hạn chế Nói khác đi, K pneumoniae kháng carbapenem, chúng trở thành vi khuẩn “bất trị” Tại Việt Nam, nhiều công trình nghiên cứu cho thấy có gia tăng đề kháng carbapenem K pneumoniae thông qua đánh giá mức độ kháng thuốc dựa kết xác định MIC hay theo phương pháp kháng sinh đồ mà chưa nêu bật đặc điểm sinh học phân tử đề kháng lan truyền tính kháng vi khuẩn Đề tài “Nghiên cứu đặc điểm sinh học phân tử Klebsiella pneumoniae kháng carbapenem qua chế KPC” tiến hành chủng K pneumoniae đề kháng carbapenem với mục tiêu cụ thể sau: Sàng lọc thu nhận chủng vi khuẩn K pneumoniae đề kháng carbapenem Xác định kiểu gen quy định kiểu hình kháng carbapenem ESBL Khảo sát đặt tính sinh học phân tử gen mã hóa KPC Tạo kháng thể xác nhận diện protein KPC NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN Phát vi khuẩn K pneumoniae đề kháng carbapenem thông qua gen mã hóa KPC-2 Việt Nam Chứng minh lan truyền gen mã hóa enzyme đề kháng carbapenem sang E coli điều kiện phòng thí nghiệm Phân lập tạo dòng gen mã hóa KPC-2 K pneumoniae đề kháng carbapenem chứng minh hoạt tính kháng carbapenem gen BỐ CỤC CỦA LUẬN ÁN Luận án gồm 117 trang Mở đầu trang, Kết luận - Đề nghị trang, Những đóng góp luận án, trang Luận án có chương: Tổng quan 37 trang, Vật liệu - Phương pháp 20 trang, Kết 23 trang, Bàn luận 11 trang Luận án có 25 bảng, 37 hình, phụ lục 133 tài liệu tham khảo với 22 tài liệu tiếng Việt, 109 tài liệu tiếng Anh tài liệu website TỔNG QUAN 1.1 Vi khuẩn Klebsiella pneumoniae K pneumoniae, thuộc họ vi khuẩn đường ruột – Enterobacteriaceae, tác nhân gây nhiễm khuẩn bệnh viện cộng đồng Yếu tố nguy lây nhiễm chủng bệnh nhân thời gian nằm viện kéo dài, hệ miễn dịch suy yếu, nằm chung giường với người nhiễm bệnh hay thực thủ thuật xâm lấn đặt ống thông tiểu, đặt nội khí quản… Nhiễm khuẩn bệnh viện Klebsiella tăng cao chủ yếu gia tăng việc sử dụng kháng sinh làm gia tăng chủng kháng thuốc 1.1.1 Đặc điểm phân loại Đặc điểm phân loại K pneumoniae (theo NCBI): Giới: Bacteria; Ngành: Proteobacteria; Lớp: Gammaproteobacteria; Bộ: Enterobacteriales; Họ: Enterobacteriaceae; Chi: Klebsiella; Loài: Klebsiella pneumoniae 1.1.2 Đặc điểm hình thái, sinh hóa phân bố K pneumoniae trực khuẩn gram âm, kị khí tùy ý, không di động, có nang polysacharide đặc trưng giúp vi khuẩn tránh tác nhân gây hại cho tế bào Vi khuẩn có mặt khắp nơi tự nhiên Ở người, tìm thấy chúng da, cổ họng, đường ruột, dày, nước tiểu hay vết thương 1.1.3 Các yếu tố độc lực K pneumonia a) Kháng nguyên vỏ (bề mặt): gồm có nhóm kháng nguyên K có chất polysaccharide kháng nguyên O có chất lipopolysaccharide, yếu tố gây bệnh K pneumoniae b) Hệ thống nhung mao (pili): quan giúp Klebsiella bám dính lên bề mặt tế bào chủ, có khả đông tụ hồng cầu nhiều loài động vật c) Các yếu tố kháng huyết thanh: lớp vỏ polysaccharide bao bọc che chở cho lớp lipopolysaccharide nằm bên kháng nguyên O xuyên qua lớp vỏ tạo thành cấu trúc bề mặt không hoạt hóa bổ thể d) Siderophore (chất mang ion – ion carrier): Klebsiella tiết chất kìm nối (chelator) phân tử lượng nhỏ, có lực cao với sắt gọi siderophore (enterochelin aerobactin) giúp vi khuẩn tăng trưởng mô tế bào chủ 1.1.4 Cấu trúc di truyền K pneumoniae Ngoài số cấu trúc di truyền K pneumoniae giải trình tự toàn hay phần trước K pneumoniae sub sp pneumoniae MGH (một nhiễm sắc thể dạng vòng 5,1 Mbp có tỷ lệ GC 57%), chủng K pneumoniae NTUH-K2044 phân lập Đài Loan, chủng K pneumoniae subsp rhinoscleromatis (ATCC13884), chủng có khả cố định nitơ, K pneumoniae 342, sử dụng nghiên cứu mối quan hệ thực vật vi khuẩn Năm 2015, Kathryn E Holt cộng vào giải trình tự toàn hay phần 288 K pneumoniae nhiều nơi giới so sánh với trình tự công bố nhằm mục đích xác nhận mối liên hệ gen mối liên quan đến khả gây bệnh người 1.1.5 Sự đề kháng kháng sinh carbapenem K pneumoniae Klebsiella đề kháng với hầu hết kháng sinh họ -lactam gen mã hóa -lactamase phổ rộng (ESBL) làm bất hoạt kháng sinh Carbapenem khuyến cáo sử dụng điều trị bệnh nhiễm khuẩn vi khuẩn kháng đa kháng sinh tiết ESBL, nhóm trực khuẩn đường ruột gram âm thuộc họ Enterobacteriaceae K pneumoniae phát triển thu nhận gen mã hóa carbapenemase đề kháng carbapenem cách nhanh chóng lan truyền cho vi khuẩn khác giới Carbapenemase enzym β-lactamase, chia thành ba nhóm lớn: nhóm A, KPC enzym quan trọng lâm sàng dịch tể, enzyme khác SME (Serratia marcescens enzym), NMC-A/IMI (not metalloenzym carbapenemase/imipenem-hydrolysing -lactamase) GES (Guiana extended spectrum) không gây vấn đề lâm sàng lớn; Nhóm B gồm metallo--lactamase (MBLs), IMP (imipenemase), VIM (Verona integron encoded metallo--lactamase) New Delhi Metallo--lactamase (NDM); Nhóm D gồm carbapenemase loại OXA thường phát Acinetobacter spp phát Enterobacteriaceae 1.2 Kháng sinh kháng sinh họ -lactam 1.2.1 Kháng sinh Nhiều loại kháng sinh tự nhiên hay tổng hợp khác có chung chế phổ kháng khuẩn nên phân loại dựa cấu trúc hóa học tác động kìm khuẩn (bacteriostatic) hay diệt khuẩn (bacteriocidal) 1.2.2 Kháng sinh họ -lactam chế đề kháng -lactam Kháng sinh -lactam có cấu trúc chứa vòng -lactam, liên kết với cấu trúc khác hình thành nên phân nhóm khác penicilin, cephalosporin có phổ kháng khuẩn rộng hơn, có hoạt tính ức chế tổng hợp peptidoglycan màng tế bào vi khuẩn, đích đến phản ứng transpetidase liên kết chéo trình tổng hợp peptidoglycan Do vậy, kháng sinh đáp ứng tốt nguyên tắc độc tính chọn lọc liệu pháp điều trị hữu hiệu sử dụng nhiều Sự đề kháng kháng sinh -lactam Enterobacteriaceae chủ yếu tiết enzym  -lactamase thủy phân vòng -lactam làm hoạt tính kháng sinh Các -lactamase phân loại dựa tương đồng axit amin chia thành bốn lớp phân tử A, C D gồm -lactamases có serine vị trí hoạt hóa nhóm B gọi metallo-beta-lactamase (MBL), có kẽm vị trí hoạt hóa 1.3 Carbapenem chế đề kháng carbapenem K pneumoniae Carbapenem có nguồn gốc dẫn xuất thienamycin, hợp chất tự nhiên nấm Streptomyces catlaya tiết ra, có phổ kháng khuẩn rộng so với -lactam khác Carbapenem có cấu trúc gần giống với penicillin có nhiều ưu điểm so với kháng sinh -lactam khác là: (i) phân tử nhỏ nên có khả sử dụng lổ nhỏ màng tế bào vi khuẩn gram âm để tiếp xúc với PBP (penicillin binding protein); (ii) khó bị phân hủy -lactamase nhiều vi khuẩn (iii) có lực với nhiều PBP khác nhiều loại vi khuẩn Các chế đề kháng carbapenem K pneumoniae gồm: - Cơ chế qua trung gian enzym ESBL hay carbapenemase biểu hay nhiều ESBL, sản xuất vượt mức AmpC -lactamase kết hợp với giảm tính thấm màng thay kênh porin làm chặn cổng vào kháng sinh - Cơ chế không enzym: bơm đẩy kháng sinh hay thay đổi lực carbapenem làm cho kháng sinh không tiếp cận với chuỗi peptidoglycan tổng hợp vi khuẩn Cơ chế quan trọng quan tâm nhiều chế kháng thông qua enzym carbapenemase mã hóa gen nằm plamid gọi Klebsiella pneumoniae carbapenemase (KPC) New Dehli Metalo--lactamase (NDM) 1.4 Tình hình nghiên cứu tính đề kháng carbapenem K pneumoniae 1.4.1 Tình hình đề kháng carbapenem K pneumoniae giới Gen mã hóa KPC phát lần năm 2001 plasmid K pneumoniae đề kháng carbapenem, cephalosporin phổ rộng aztreonam Sự phát triển tính kháng KPC phát kháng sinh dùng để điều trị bệnh nhân mang chủng đề kháng với ceftazidime aminoglycoside (Muhamad Ahmad cộng sự) trình kháng carbapenem kết hợp porin diện lactamase qua trung gian plasmid (Martinez) hay giảm điều hòa phosphate transport porin PhoE Gen mã hóa KPC diện tranposon Tn3 Tn4401 có kích thước 10 kb, mang transposase hai trình tự chèn ISkpn6 ISkpn7, có vai trò lan truyền gen thông qua plasmid Nhiều nghiên cứu môi trường chọn lọc để phát vi khuẩn tiết carbapenemase, phương pháp sinh học phân tử nghiên cứu để phát nhanh phát phân biệt biến thể gen mã hóa KPC chứng minh khả lan truyền gen đề kháng cho vi khuẩn hay khác loài gây nên nhiều vụ dịch bệnh giới 1.4.2 Tình hình nghiên cứu đề kháng kháng sinh carbapenem K pneumoniae Việt Nam Ở Việt Nam, carbapenem kháng sinh chưa phổ biến nên đề kháng vi khuẩn với kháng sinh chưa có nghiên cứu đề kháng carbapenem K pneumoniae thông qua chế tiết enzym KPC Các liệu công bố bệnh viện tình hình đề kháng carbapenem K pneumoniae chủ yếu dựa kết xét nghiệm kháng sinh đồ hay nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) mà chưa nêu rõ chế tượng đề kháng Do vậy, việc nghiên cứu đặc điểm sinh học phân tử kiểu hình, kiểu gen biểu gen mã hóa KPC diện plasmid số chủng K pneumoniae đề kháng carbapenem chế gây nên lan truyền tính kháng carbapenem K pneumoniae mang gen mã hóa KPC cần thiết giai đoạn VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP 2.1 Đối tượng nghiên cứu: 27 chủng K pneumoniae kháng carbapenem phân lập từ tháng – 2010 đến tháng năm 2014 2.2 Phương pháp nghiên cứu - Vi khuẩn K pneumoniae phân lập định danh vi khuẩn định danh vi khuẩn IDS 14® GNR (Nam Khoa, Việt Nam, TCCL số 02951/2001/CBTC-TDC) theo hướng dẫn nhà sản xuất - Xác định mức độ đề kháng đa kháng sinh chủng K pneumoniae kỹ thuật kháng sinh đồ với đĩa kháng sinh (Bio-Rad (Mỹ) - Xác định mức độ đề kháng carbapenem phương pháp khuếch tán kháng sinh nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) với kháng sinh carbapenem (imipenem, meropenem ertapenem) theo tiêu chuẩn CLSI - Phát kiểu gen đề kháng carbapenem (gen mã hóa KPC NDM1) kỹ thuật Multiplex Real-time PCR theo khuyến nghị CDC kiểu gen đề kháng đa kháng sinh (ESBL AmpC -lactamase) chủng kỹ thuật Multiplex PCR - Các chủng K pneumoniae đề kháng carbapenem mang gen mã hóa KPC xác định kiểu hình sinh carbapenemase kỹ thuật Modified Hodge Test (MHT); Sản phẩm khuếch đại gen mã hóa KPC giải trình tự so sánh ngân hàng gen để xác định kiểu gen đề kháng - Nghiên cứu khả lan truyền tính kháng carbapenem từ chủng K pneumoniae sang cho vi khuẩn E coli J53 phương pháp tiếp hợp, xác nhận kiểu hình, kiểu gen kỹ thuật multiplex PCR, multiplex real-time PCR kiểm tra xác nhận protein KPC kỹ thuật Western blot - Phân tích biểu hoạt tính KPC dịch đồng sinh khối hai chủng KP02 vả KP03 và; tạo dòng biểu gen mã hóa KPC hai chủng với promoter tự nhiên promoter T7 Protein KPC tinh cột sắc ký lực kiểm tra kỹ thuật sắc ký kết hợp với khối phổ (LC-MS), sau dùng để gây đáp ứng miễn dịch chuột; kháng huyết kháng KPC kiểm tra phương pháp miễn dịch ELISA sử dụng để kiểm chứng diện KPC chủng K pneumoniae đề kháng carbapenem theo chế KPC vi khuẩn khác kỹ thuật Western blot Số gen Gen mã hóa ESBL Số chủng Chủng (%) SHV, CTX-M-9 02 (7,4) KP04 KP27 SHV, TEM, CTX-M-1 04 (14,8) KP07, KP16, KP20, KP26 SHV, TEM, CTX-M-9 02 (7,4) KP02 KP13 Gen mã hóa SHV diện 26/27 số chủng (chiếm 96%); 17/27 số chủng mang gen mã hóa TEM (63%) Có 14 chủng (52%) mang đồng thời gen ESBL; Hầu hết chủng mang gen mã hóa SHV TEM (chiếm 71,5%) Không phát CTX-M2 diện đồng thời gen mã hóa TEM CTX-M Có chủng (22%) mang gen mã hóa ESBL (gen mã hóa SHV, TEM CTX-M1 CTX-M9) 3.2.3 Sự diện gen mã hóa -lactamase AmpC chủng Kết phân tích cho thấy có bốn loại -lactamase AmpC chủng K pneumoniae kháng carbapenem phát ACC, DHA, ACT1 CMY 10 số 27 chủng nghiên cứu, chiếm tỷ lệ 37% 3.3 Đặc điểm kháng carbapenem KPC K pneumoniae đề kháng carbapenem 3.3.1 Kiểu hình sinh carbapenemase chủng K pneumoniae đề kháng carbapenem Mười chủng đề kháng mang kiểu gen mã hóa KPC kiểm chứng có kiểu hình carbapenemase dương tính thử nghiệm Hodge cải biên, (MHT - Modified Hodge Test) theo hướng dẫn CLSI với hai chủng chuẩn K pneumoniae ATTC® BAA-1705 (chủng có carbapenemase dương tính) 1706 (chủng có carbapenemase âm tính) 3.3.2 Giải trình tự xác định gen mã hóa KPC Gen mã hóa KPC chủng có kiểu hình KPC (+) MHT (+) nhân bản, thu nhận phản ứng PCR khuôn DNA 11 chủng Sản phẩm PCR giải trình tự điện di mao quản hệ thống ABI 3130 XL Gentic Analyser Kết phân tích phần mềm Sequencing Analysis kiểm tra độ tương đồng ngân hàng gen NCBI Hình 3.8 Kết giải trình tự chủng K pneumoniae ATCC BAA 1705 Việc giải trình tự gen mã hóa KPC chủng thí nghiệm cho kết tương đồng 99% - 100% so với chủng chuẩn ATCC BAA 1705 tra cứu so sánh chương trình BLAST (NCBI) 11 chủng mang gen mã hóa cho KPC-2 3.3.3 Hoạt tính enzym KPC dịch đồng sinh khối chủng Vi khuẩn E coli ATCC 25922 phát triển đĩa môi trường xung quanh đĩa giấy có tẩm dịch đồng sinh khối chủng K pneumoniae kháng carbapenem không phát triển xung quanh bên vòng vô khuẩn tạo đĩa giấy tẩm kháng sinh carbapenem Chứng tỏ dịch đồng từ sinh khối chủng K pneumoniae thử nghiệm có hoạt tính carbapenemase 3.4.4 Tạo dòng biểu gen mã hóa KPC-2 Gen mã hóa KPC-2 từ hai chủng KP02 KP03 thu nhận tạo dòng vector biểu pET28a có cấu trúc đuôi Histidin với promoter tự nhiên promoter T7 Các plasmid biến nạp vào tế bào E coli BL21 12 nuôi cấy môi trường chứa ertapenem (4 µg/ml) Kết nuôi cấy sau 4h (T=4h) giá trị OD600nm Bảng 3.7 Biểu carbapenemase chủng mang plasmid tái tổ hợp E coli BL21 mang OD600nm / kháng sinh Ertapenem µg/ml plasmid tái tổ hợp Trước bổ sung (T=0 h) Sau bổ sung (T=4 h) pKPCwt-1705 2,08 3,10 pKPCwt-KP02 2,05 2,90 pKPCwt-KP03 2,07 3,06 pKPCcc-1705 2,01 3,49 pKPCcc-KP02 2,02 3,27 pKPCcc-KP03 2,04 3,65 pET28a 2,01 0,66 Kết khảo sát cho phép khẳng định gen mã hóa KPC-2 diện tế bào E coli tái tổ hợp biểu với promoter tự nhiên T7 có hoạt tính carbapenemase thủy phân ertapenem môi trường nuôi cấy 3.3.5 Thu nhận KPC-2 tái tổ hợp dùng làm kháng nguyên gây đáp ứng miễn dịch để thu nhận kháng thể Kết phân tích SDS-PAGE cho thấy, giếng điện di xuất vạch protein đậm khoảng 29 kDa mà không xuất mẫu đối chứng E coli BL21 (DE3) mang plasmid gốc pET28a chủng mang plasmid không cảm ứng IPTG Protein KPC-2 chủng mang plasmid pKPCcc-KP03 đối chứng dương 1705 kiểm tra tính tan tinh sắc ký lực Kết cho thấy protein KPC-2 diện chủ yếu pha tan (S) protein KPC-2 sau tinh chế vạch protein mục tiêu với kích thước khoảng 29 kDa Kết LCMS cho thấy có cấu tử với khối lượng phân tử 29,542 Da (tương ứng với khối lượng protein KPC-2 tự nhiên) thời 13 gian lưu 11,3 – 11,5 Chứng tỏ protein KPC-2 thu tinh có trọng lượng phân tử xác với trọng lượng phân tử KPC tự nhiên (A) (B) Hình 3.13 Kết kiểm tra tính tan tinh protein KPC-2 (A) Tính tan protein KPC-2 biểu tế bào E coli tái tổ hợp (B) Độ tinh protein sau tinh chế protein sắc ký lực M: Thang protein chuẩn, T: protein tổng, P: protein tủa S: protein tan 3.3.6 Gây đáp ứng miễn dịch thu nhận kháng huyết chứa kháng thể kháng KPC-2 Hình 3.15 Kết đánh giá kháng huyết chuột gây đáp ứng miễn dịch với KPC-2 phương pháp ELISA Kết đánh giá kháng huyết phương pháp ELISA với chứng âm mẫu huyết chuột chưa tiêm protein KPC trình 14 bày Hình 3.15 cho thấy đáp ứng tốt với kháng thể kháng KPC-2 có huyết chuột độ pha loãng 1/125,000 nồng độ protein KPC-2 0,1 g Như vậy, kháng huyết thu nhận từ chuột gây đáp ứng miễn dịch có chứa kháng thể chuyên biệt KPC-2 3.3.7 Xác nhận biểu gen mã hóa KPC-2 chủng K pneumoniae đề kháng carbapenem mang gen mã hóa KPC-2 Western blot Dịch đồng từ sinh khối 11 chủng đề kháng carbapenem qua chế KPC-2, chủng chuẩn ATCC 1705, chủng đối chứng âm E coli BL21, B subtilis 1102 E coli J53 điện di gel SDS-PAGE thực phản ứng Western blot Kết trình bày Hình 3.16 (A) (B) Hình 3.16 Kết Western blot khẳng định diện protein KPC-2 chủng K pneumoniae đề kháng carbapenem mang gen mã hóa KPC-2 Kết lai Western blot cho thấy hầu hết chủng xuất vạch tín hiệu lai tương tự chủng chuẩn K pneumoniae ATCC 1705 hay vạch protein KPC-2 tinh (KPC+) với kích thước khoảng 29 kDa Điều cho phép khẳng định gen mã hóa KPC-2 biểu thành protein KPC-2 15 diện dịch đồng sinh khối chủng có khả thủy phân kháng sinh carbapenem 3.4 Nghiên cứu khả lan truyền tính đề kháng theo chiều ngang chủng K pneumoniae kháng carbapenem theo chế KPC 3.4.1 Khả lan truyền tính đề kháng carbapenem chủng K pneumoniae sang E coli in vitro E coli J53 chủng có F- met pro, mang gen kháng sodium azide sử dụng để làm chủng nhận, chủng K pneumoniae kháng carbapenem mang gen mã hóa KPC-2 dùng làm chủng cho 50l dịch nuôi cấy môi trường LB broth với tỉ lệ 1:1 (1ml dịch nuôi cấy K.pneumoniae ml E coli J53 vào 18ml LB), cấy kiểm tra môi trường chọn lọc có bổ sung Az ertapenem (4g/ml) Hai chủng tiếp hợp chủng KP06 KP18 phát triển môi trường chọn lọc, ký hiệu Eco06 Eco18 định danh Escherichia coli Như vậy, tỷ lệ chuyển gen thí nghiệm 18,18% 3.4.2 Kiểm chứng kiểu hình kháng carbapenem chủng tiếp hợp phương pháp kháng sinh đồ Hai chủng tiếp hợp Eco06 Eco18 có kiểu hình đề kháng trung gian với carbapenem, đồng thời đề kháng với -lactam khác Bảng 3.9 Sự đề kháng kháng sinh chủng cho KP06 KP18 với chủng tiếp hợp Eco06 Eco18 Chủng IM ME EN CO DX RF CI AM AC CX CT CZ AK CN KP06 R R R S S R I R R R R R R R Eco06 I I I S S R S R R R R S S S KP18 R R R R S R R R R R R R S R Eco18 I I I S S S S S R I R S S S R: kháng, I: kháng trung gian, S nhạy cảm AM (ampicillin); CN (cefoxitin); CT (cefotaxim); CZ(ceftazidime); AC (amoxillin/clavulanic acid); RF (rifampin); DX (doxicycline); CI (ciprofloxacin); AK (amikacin); IM (imipenem); EN (ertapenem); ME (meropenem); CO (colistin) 16 3.4.3 Kiểm chứng kiểu gen KPC-2 chủng E coli tiếp hợp Hai chủng tiếp hợp Eco06 Eco18 có kết KPC-2 kiểm tra kỹ thuật multiplex real-time PCR Chủng Eco06 không nhận gen ESBL hay AmpC, chủng Eco18 nhận gen ESBL TEM Bảng 3.10 Kết tiếp hợp in vitro chủng kháng carbapenem Chủng KP06 KP18 + LB+Az + En + Định danh E coli Nhận gen KPC + + E coli KPC, TEM Gen diện LB+Az ESBL: KPC AmpC: ACT-1 ESBL: KPC, SHV, TEM AmpC: không 3.4.4 Kiểm tra biểu gen mã hóa KPC-2 chủng tiếp hợp Kết kiểm chứng diện protein KPC chủng tiếp hợp kỹ thuật Western blot cho thấy hai chủng tiếp hợp xuất vạch tín hiệu lai tương tự chủng chuẩn K pneumoniae ATCC 1705 vạch protein KPC-2 tinh (KPC (+) Kết khẳng định có truyền gen mã hóa KPC kháng carbapenem từ chủng K pneumoniae đề kháng carbapenem sang vi khuẩn E coli J53 gen mã hóa KPC-2 biểu đến mức protein chủng tiếp hợp gây nên tượng đề kháng trung gian với carbapenem BÀN LUẬN Nghiên cứu sàng lọc thu nhận 27 chủng K pneumoniae đề kháng với carbapenem số 1,538 chủng sinh ESBL (chiếm tỷ lệ 1,76%) từ tháng 06 năm 2010 đến tháng 06 năm 2014 Tỷ lệ tương đồng với nghiên cứu đa trung tâm nước MIDAS, GARP hay SMART, gần với nghiên cứu 49 nước Châu Á từ năm 2000 đến năm 2012 (0.8 đến 1.4%) Việt Nam ba nước có tỷ lệ đề kháng cao Các chủng K pneumoniae phân lập nghiên cứu kháng từ đến 14 loại kháng sinh thông dụng điều trị nhiễm khuẩn 17 penicillin, cephalosporin hệ tỷ lệ 100%, quinolone 90% Carbapenem kháng sinh sử dụng để điều trị bao vây theo mục tiêu vi khuẩn sinh ESBL đề kháng đa kháng sinh bị kháng từ 96% đến 100% Kết hoàn toàn tương tự với kết luận khác công bố K pneumoniae đề kháng carbapenem đề kháng với βlactam khác penicillin, cephalosporin, and monobactam, có hoạt tính yếu với cefamycin ceftazidime Cơ chế đề kháng carbapenem KPC NDM-1 hai chế quan trọng quan tâm nhiều K pneumoniae điều trị giám sát nhiễm khuẩn Đề kháng carbapenem gen mã hóa carbapenemase KPC NDM-1 Tỷ lệ kiểu gen mã hóa KPC 40,7% NDM-1 55,6% số chủng K pneumoniae đề kháng carbapenem tương đương với nghiên cứu bệnh viện Nguyễn Đình Chiểu, Bến Tre (55,6%) Bệnh viện Chợ Rẫy (52,63%), gần với nghiên cứu nước Mỹ La Tinh Ấn Độ thấp so với nước Anh (64,3%), Italy (89,5%) Canada (80%) Nhiều nghiên cứu giới cho thấy quốc gia phát triển sử dụng carbapenem từ năm 1990 nên tỷ lệ đề kháng chủng K pneumoniae mang gen mã hóa NDM-1 KPC cao Ở quốc gia phát triển Mỹ La Tinh hay Châu Á, điều kiện chăm sóc sức khỏe y tế chưa tiên tiến, carbapenem sử dụng trễ nên tỷ lệ đề kháng thấp Điều áp dụng nghiên cứu nghiên cứu khác Việt Nam carbapenem sử dụng nhiều thường xuyên có khuyến cáo thức Vụ điều trị, Bộ Y tế vào năm 2006 (công văn số 7654/BYT- ĐTr ngày 10/10/2006) mà trước sử dụng hạn chế theo kinh nghiệm điều trị bác sĩ Sự xuất chủng K pneumoniae đề kháng carbapenem mang gen mã hóa NDM-1 KPC nghiên cứu chúng tôi, với 18 luận mối tương quan việc sử dụng carbapenem đề kháng kháng sinh cho thấy việc thay kháng sinh khác carbapenem điều trị dẫn đến tượng đề kháng carbapenem việc gia tăng sử dụng kháng sinh áp lực chọn lọc để vi khuẩn phát triển tính đề kháng Đề kháng carbapenem mang gen mã hóa NDM-1 NDM-1 phát lần vào năm 2008 chủng K pneumoniae phân lập từ bệnh nhân người Thụy Điển có tiền sử điều trị bệnh New Dehli, Ấn Độ Sau phát Pakistan, Trung Quốc, Anh Quốc nhiều nước lân cận Việt Nam Singapore, Đài Loan, Thái Lan… Trong K pneumoniae vi khuẩn chiếm tỷ lệ cao Cũng nghiên cứu khác giới, chủng K pneumoniae kháng carbapenem mang gen NDM-1 nghiên cứu mang gen ESBL phổ rộng TEM, SHV; ESBL phổ mở rộng CTX-M; AmpC -lactamase ACC, CMY, DHA đề kháng với loại kháng sinh thuộc họ -lactam, cephamycine, aminoglycoside, tetracycline, quinolone nhạy cảm với hai kháng sinh diệt khuẩn colistin fosfomycin kháng sinh kìm khuẩn tigecycline Ba chủng K pneumoniae mang gen NDM-1 KP30, KP32 KP35 đề kháng với colistin, chứng tỏ chủng có xu hướng phát triển tính đề kháng với kháng sinh Đây vấn đề cần quan tâm Việt Nam có nghiên cứu cho biết colistin không phù hợp để điều trị chủng K pneumoniae đề kháng carbapenem có mang gen mã hóa NDM-1 Đồng thời, K pneumoniae mang gen mã hóa NDM-1 chứng minh có khả lan truyền ngang sang cho chủng hay khác loài dẫn đến việc vô hiệu hóa thất bại điều trị nhóm kháng sinh quan trọng 19 Đề kháng carbapenem mang gen mã hóa KPC Kể từ phát K pneumoniae, KPC tác nhân gây nên nhiều vụ dịch bệnh đơn vị lâm sàng lây lan nhiều quốc gia khác vi khuẩn đường ruột E coli, P aeruginosa, Citrobacter freundii, Serratia marcescens E cloacae Mười chủng K pneumoniae đề kháng carbapenem nghiên cứu mang gen mã hóa carbapenemase KPC-2 Đây kiểu gen phát giới chủng K pneumoniae phân lập Bắc Carolina, Hoa Kỳ năm 2001 có khả thủy phân hầu hết β-lactam bao gồm penicillin, cephalosporin, and monobactam (aztreonam), có hoạt tính yếu với cefamycin ceftazidime Một báo cáo trước Việt Nam cho thấy có diện chủng Ent hormaechii mang gen KPC-2 liên tục sau phân lập thêm chủng khác E coli, Ent cloaceae hay Ent absuriae Đây vấn đề đáng quan tâm lan truyền tính đề kháng chủng củng hay khác loài Các chủng K pneumoniae đề kháng carbapenem nghiên cứu có kiểu gen mã hóa KPC-2 có mang gen mã hóa CTX-M hay AmpC ACC, có kiểu hình đề kháng từ đến 14 loại kháng sinh thuộc nhóm kháng sinh thông dụng điều trị Như vậy, kiểu hình kiểu gen đề kháng carbapenem, chủng K pneumoniae có chế đề kháng nghiên cứu khác giới K pneumoniae đề kháng carbapenem mang gen mã hóa KPC-2 thường đồng thời mang gen mã hóa SHV, TEM CTX-M hay AmpC -lactamase gây nên tượng đề kháng với nhiều kháng sinh kể aminoglycoside quinolone Cùng kiểu gen mã hóa KPC, SHV TEM với chủng có thêm gen mã hóa AmpC ACC (KP03 KP12) hay CTX-M (chủng KP02, KP04, KP07, KP13) MIC carbapenem tăng lên so với chủng không 20 mang enzym Điều gen đề kháng kháng sinh phổ rộng làm tăng cường mức độ kháng carbapenem chủng Tuy nhiên, có sai biệt mức độ đề kháng (giữa chủng KP02 KP13; KP07 KP20) nhiều yếu tố khác nhau, là: i) Có đồng diện chế đề kháng khác; ii) Các ức chế mặt di truyền dẫn đến gen không biểu hiện; hay iii) Số lượng gen đề kháng plasmid hay số lượng plasmid có mang gen đề kháng Đặc điểm kháng carbapenem KPC chủng K pneumoniae đề kháng carbapenem 100% số chủng K pneumnoniae đề kháng carbapenem mang gen mã hóa KPC-2 nghiên cứu xác nhận mang kiểu hình carbapenemase dương tính phương pháp Modified Hodge Test Đây là phương pháp CDC công bố có độ nhạy độ đặc hiệu 100% chủng Enterobacteriaceae mang gen mã hóa KPC Theo CLSI, thử nghiệm có độ nhạy độ chuyên biệt cao để phát carbapenemase loại KPC, mà chưa rõ metallo-beta-lactamase hay cabapenemase nhóm D chủng tiết enzym ESBL với giảm biểu porin Về biểu protein KPC, dịch đồng sinh khối từ chủng KP02 KP03 có hoạt tính carbapenemase chủng E coli mang plasmid tái tổ hợp chứa gen mã hóa KPC-2 hai chủng với promoter tự nhiên (pKPCwt) biểu thành protein KPC-2, có hay không bổ sung IPTG, chứng tỏ promoter tự nhiên chủng tạo dòng biểu plasmid tái tổ hợp dù mức độ biểu thấp so với promoter T7 Các nghiên cứu khác cho thấy chủng tái tổ hợp mang gen mã hóa KPC, MIC chủng mang plasmid nhân tạo thường cao MIC chủng mang plasmid tự nhiên plasmid mang gen mã hóa KPC có 21 diện gen đề kháng kháng sinh khác làm tăng tính kháng carbapenem chủng Kết biểu carbapenemase KPC-2 chu chất chủng E coli tái tổ hợp phản ánh chất biểu tính kháng vi khuẩn Gram âm enzym -lactamase, KPC-2, sản xuất nội bào bên chu chất màng vách tế bào vi khuẩn Sự lan truyền gen đề kháng carbapenem K pneumoniae in vitro Hai số 11 chủng (18,18%) sau tiếp hợp xác nhận mang gen mã hóa KPC-2 biểu thành protein KPC-2 có hoạt tính carbapenemase Tỷ lệ tương tự nghiên cứu Việt Nam chủng vi khuẩn đường ruột đề kháng carbapenem chuyển gen sang vi khuẩn E coli J53 14,3% nghiên cứu khác giới Sự lan truyền gen mã hóa KPC theo chế Sarah N Richter sử dụng để giải thích chuyển gen KPC-2 từ K pneumoniae sang vi khuẩn E coli bệnh nhân Châu Âu Nhiều nghiên cứu cho thấy lan truyền gen mã hóa KPC chủng sau tiếp hợp chủ yếu thông qua plasmid tranposon, gen phát biến thể Tn4401 plasmid IncFII có kích thước 130 kb nằm transposon Tn4401a hay plasmid IncN (40 kb), IncL/M (50 to 60 kb) transposon Tn4401b có plasmid IncFII lan truyền theo chế tiếp hợp Gen mã hóa KPC diện nhiều trình tự ST khác làm cho gen có khả lan truyền sang cho vi khuẩn khác Mặc dù chưa thực việc xác định tính đa dạng di truyền plasmid mang gen mã hóa KPC-2 để làm sáng tỏ khả lan truyền gen từ K pneumoniae sang E coli J53, kết làm luận để giải thích lý có số 11 chủng lan truyền sang E coli nghiên cứu Bên cạnh 22 đó, chủng tiếp hợp chưa ổn định mặt di truyền nên biểu tính kháng chưa đủ để phát môi trường chọn lọc Đối với chủng tiếp hợp thành công, chủng Eco06 nhận gen mã hóa KPC-2, có kiểu hình kháng với kháng sinh -lactam kháng trung gian với carbapenem không đề kháng với kháng sinh quinolone hay aminoglycoside chủng KP06 cho thấy gen mã hóa KPC-2 chuyển sang cho chủng Eco06 không mang gen gây nên tượng đề kháng hai kháng sinh Các nghiên cứu trước giới có nhận định vi khuẩn mang gen mã hóa KPC-2 đề kháng với kháng sinh -lactam không đề kháng kháng sinh lactam không mang gen đề kháng kháng sinh Tương tự chủng Eco06, chủng Eco18 nhận thêm gen ESBL TEM, đề kháng với cefotaxime, ceftazidime kháng sinh phối hợp amoxiline/ clavulanic aicd lại kháng số lượng kháng sinh chủng Eco06, điều khác biệt biểu gen hai chủng sau tiếp hợp, ức chế mặt di truyền tế bào E coli hay khác biệt số lượng gen diện plasmid có mang gen đề kháng hai chủng Như vậy, chủng K pneumoniae đề kháng carbapenem nghiên cứu chứng minh (i) có mang gen mã hóa cho KPC-2 (ii) biểu thành protein KPC-2 có hoạt tính thủy phân carbapenem (iii) gen có khả lan truyền theo chiều ngang cho vi khuẩn E coli làm cho vi khuẩn biểu tính kháng với carbapenem KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Các kết thực nghiệm luận án tóm tắt sau: - Hai mươi bảy chủng K pneumoniae đề kháng carbapenem đề kháng từ đến 14 loại kháng sinh thông thường sử dụng điều trị nhiễm khuẩn; 100% số chủng kháng với ampicillin cephalosporin hệ; 23 96 đến 100% kháng carbapenem, 90% kháng quinolone; 50% kháng amikacin, 18,5% kháng colistin - 40,8% chủng K pneumoniae có mang gen mã hóa KPC 55,5% số chủng mang gen mã hóa NDM-1 Các chủng đồng thời mang gen mã hóa ESBL AmpC -lactamase - Kiểu gen đề kháng gen mã hóa KPC-2 Protein KPC-2 biểu promoter tự nhiên promoter T7, có hoạt tính carabapenemase, gây nên tượng đề kháng carbapenem chủng - Gen mã hóa KPC-2 lan truyền cho vi khuẩn E coli theo chế tiếp hợp 18,18% Các chủng tiếp hợp nhận gen ESBL và/hoặc AmpC -lactamase biểu hoạt tính thủy phân carbapenem 5.2 Đề nghị Luận án xác nhận diện chủng K pneumoniae đề kháng carbapenem khẳng định đề kháng carbapenem thông qua chế sinh enzym KPC đồng thời chứng minh lan truyền gen mã hóa KPC sang cho vi khuẩn E coli Một số vấn đề cần thực thêm để ứng dụng kết vào thực nghiệm sau: - Sản xuất ứng dụng kháng thể kháng KPC-2 thử nghiệm phát vi khuẩn đề kháng carbapenem mang gen mã hóa KPC - Nghiên cứu sâu đặc tính vùng gen mã hóa KPC hay tính đa dạng di truyền plasmid mang gen mã hóa KPC gen điều hòa, nhân tố lan truyền (transposon, số lượng plasmid, số lượng gen mã hóa KPC plasmid) để hiểu rõ mức độ đề kháng carbapenem chế lan truyền tính kháng thuốc K pneumoniae sang vi khuẩn đường ruột khác - Nghiên cứu ảnh hưởng tác nhân khác lên mức độ đề kháng carbapenem chủng K pneumoniae đề kháng carbapenem 24 CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN Trần Nhật Phương, Phạm Hùng Vân, Trần Linh Thước (2011), Xác định diện gen mã hóa carbapenemase KPC-2 Klebsiella pneumoniae phân lập Việt Nam, Tạp chí Y học thực hành, Bộ Y Tế, số 781-2011, 5862 Trần Nhật Phương, Phạm Hùng Vân (2012), Klebsiella pneumoniae Enterobacter hormaechii sỡ hữu gen blaKPC đề kháng carbapenem Việt Nam, Tạp chí Y Học TP Hồ Chí Minh, Tập 16, phụ số 3, 604 – 607 Trần Nhật Phương, Phạm Hùng Vân, Trần Linh Thước (2015), Sự lan truyền gen đề kháng carbapenem từ Klebsiella pneumoniae sang E coli J53 phòng thí nghiệm Tạp chí Phát triển Khoa học Công nghệ, Đại học Quốc Gia TP Hồ Chí Minh, tập 19, tháng 1-2016, trang 36 - 44 Trần Nhật Phương, Huỳnh T Kim Phương, Phan T Phượng Trang, Phạm Hùng Vân,Trần Linh Thước (2016), Dòng hóa biểu enzym carbapenemase KPC-2 tái tổ hợp tế bào chất E coli Tạp chí Phát triển Khoa học Công nghệ, Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh Tạp chí Phát triển Khoa học Công nghệ, Đại học Quốc Gia TP Hồ Chí Minh, tập 19, tháng 2-2016, trang 27 - 37 Trần Nhật Phương, Nguyễn Minh Trí, Phạm Hùng Vân, Trần Linh Thước , Phan Thị Phượng Trang (2016), Preparation of polyclonal antibody against KPC-2 from carbapenem resistant Klebsiella pneumoniae, Journal of Biotechnology, 14 (1A): 387 - 396 25