Đặc tính sinh học phân tử chủng Klebsiella pneumoniae kháng carbapenem mang gen blaKPC phân lập tại một số bệnh viện trên địa bàn Hà Nội

NGUYỄN HOÀI THU ĐẶC TÍNH SINH HỌC PHÂN TỬ CHỦNG KLEBSIELLA PNEUMONIAE KHÁNG TẠI MỘT SỐ BỆNH VIỆN TRÊN ĐỊA BÀN HÀ NỘI LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC HÀ NỘI - 2018... NGUYỄN HOÀI THU ĐẶC TÍN

NGUYỄN HOÀI THU

ĐẶC TÍNH SINH HỌC PHÂN TỬ CHỦNG

KLEBSIELLA PNEUMONIAE KHÁNG

TẠI MỘT SỐ BỆNH VIỆN TRÊN ĐỊA BÀN HÀ NỘI

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

HÀ NỘI - 2018

NGUYỄN HOÀI THU

ĐẶC TÍNH SINH HỌC PHÂN TỬ CHỦNG

KLEBSIELLA PNEUMONIAE KHÁNG

TẠI MỘT SỐ BỆNH VIỆN TRÊN ĐỊA BÀN HÀ NỘI

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Mã số: 62 42 01 07

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: 1 PGS.TS Nguyễn Bình Minh

Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương

2 PGS.TS Đinh Duy Kháng

Viện Công nghệ sinh học

HÀ NỘI - 2017

tạo điều kiện của các thầy cô giáo, tập thể các nhà khoa học của Viện Vệ sinh Dịch

tễ Trung ương và Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS TS Nguyễn Bình Minh và PGS TS Đinh Duy Kháng, những người thầy đã trực tiếp hướng dẫn và chỉ bảo cho tôi hoàn thành luận án này

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đặc biệt tới TS Trần Huy Hoàng, người luôn theo sát, hướng dẫn, nhắc nhở và động viên tôi trong suốt quá trình nghiên cứu

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới lãnh đạo Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương, lãnh đạo khoa Vi khuẩn, đồng nghiệp tại phòng thí nghiệm Kháng sinh, phòng thí nghiệm Vi khuẩn đường ruột và phòng Quản lý chất lượng Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương đã luôn tạo điều kiện, đồng hành, chia sẻ và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận án

Tôi cũng xin được bày tỏ sự biết ơn chân thành tới lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học, PGS TS Đồng Văn Quyền và các anh chị tại phòng thí nghiệm Vi sinh phân tử, ThS Bùi Thị Hải Hà phòng Quản lý tổng hợp, Viện Công nghệ sinh học đã luôn giúp đỡ tôi trong quá trình học tập

Cuối cùng nhưng đặc biệt quan trọng, tôi xin dành tất cả sự yêu thương và lời cảm ơn tới gia đình, nơi luôn là hậu phương vững chắc và niềm động viên mạnh mẽ giúp tôi hoàn thành luận án

Nguyễn Hoài Thu

Tôi xin cam đoan:

Đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với các cộng sự khác;

Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép của các đồng tác giả;

Phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Hà Nội, ngày 10 tháng 01 năm 2018

Tác giả

Nguyễn Hoài Thu

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Klebsiella pneumoniae gây bệnh trên người 3

1.1.1 Đặc điểm sinh học 3

1.1.2 Vai trò gây bệnh 4

1.2 Kháng sinh carbapenem 6

1.2.1 Giới thiệu chung về kháng sinh 6

1.2.2 Kháng sinh carbapenem 7

1.3 Klebsiella pneumoniae kháng kháng sinh qua cơ chế sinh KPC 9

1.3.1 Đặc tính kháng kháng sinh của vi khuẩn 9

1.3.2 Đặc tính kháng carbapenem 11

1.3.3 Đặc điểm dịch tễ học của Klebsiella pneumoniae sinh KPC 17

1.3.4 Đặc tính phân tử của các chủng Klebsiella pneumoniae sinh KPC 23

1.4 Các con đường lan truyền gen kháng kháng sinh blaKPC 27

1.4.1 Các yếu tố tiếp hợp (plasmid) 27

1.4.2 Các yếu tố tiếp hợp (hòa nhập) 29

1.5 Kiểm soát nhiễm khuẩn do Klebsiella pneumoniae kháng đa kháng sinh 30

1.6 Các kỹ thuật nghiên cứu đặc tính vi khuẩn kháng carbapenem mang gen blaKPC 31

1.6.1 Các thử nghiệm xác định mức độ đề kháng kháng sinh 31

1.6.2 Kỹ thuật sinh học phân tử nghiên cứu gen kháng kháng sinh 33

1.6.3 Kỹ thuật dịch tễ học phân tử 35

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 40

2.1 Địa điểm nghiên cứu 40

2.2.2 Cỡ mẫu nghiên cứu 41

2.3 Phương pháp nghiên cứu 41

2.3.1 Quy trình nghiên cứu 41

2.3.2 Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn 42

2.3.3 Thử nghiệm xác định mức độ đề kháng kháng sinh 42

2.3.4 PCR phát hiện gen blaKPC kháng carbapenem 43

2.3.5 Giải trình tự gen kháng kháng sinh 44

2.3.6 PCR phát hiện gen ESBL 45

2.3.7 Phát hiện plasmid mang gen kháng kháng sinh 46

2.3.8 Thử nghiệm khả năng truyền plasmid mang gen blaKPC 46

2.3.9 Xác định mối liên hệ kiểu gen của các chủng Klebsiella pneumoniae bằng kỹ thuật PFGE 47

2.3.10 Xác định mối liên hệ kiểu gen của các chủng Klebsiella pneumoniae bằng kỹ thuật MLST 48

2.4 Phương pháp phân tích kết quả 49

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 50

3.1 Xác định đặc tính đề kháng carbapenem qua KPC của các chủng Klebsiella pneumoniae 50

3.1.1 Phát hiện Klebsiella pneumoniae kháng carbapenem 50

3.1.2 Phát hiện Klebsiella pneumoniae kháng carbapenem mang gen blaKPC 52

3.1.3 Kết quả giải trình tự gen blaKPC 54

3.1.4 Mức độ đề kháng kháng sinh của Klebsiella pneumoniae kháng carbapnem mang gen blaKPC 55

3.1.4.1 Thử nghiệm khoanh giấy kháng sinh 55

3.1.4.2 Thử nghiệm nồng độ ức chế tối thiểu 57

kháng carbapenem mang gen blaKPC 65

3.2 Xác định khả năng truyền gen kháng kháng sinh giữa các chủng Klebsiella pneumoniae kháng carbapenem mang gen blaKPC 68

3.2.1 Phát hiện plasmid mang gen blaKPC 68

3.2.2 Thử nghiệm khả năng truyền plasmid mang gen blaKPC 70

3.3 Xác định đặc tính dịch tễ học phân tử của các chủng Klebsiella pneumoniae mang gen blaKPC 72

3.3.1 Kết quả PFGE 72

3.3.2 Kết quả MLST 76

CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN KẾT QUẢ 80

4.1 Đặc tính đề kháng carbapenem qua KPC của các chủng Klebsiella pneumoniae phân lập tại ba bệnh viện trên địa bàn Hà Nội 80

4.1.1 Phát hiện Klebsiella pneumoniae kháng carbapenem mang gen blaKPC 80

4.1.2 Kết quả giải trình tự gen blaKPC 83

4.1.3 Mức độ đề kháng kháng sinh của Klebsiella pneumoniae kháng carbapnem mang gen blaKPC 83

4.1.4 Phát hiện vi khuẩn mang gen ESBL trên các chủng Klebsiella pneumoniae kháng carbapenem mang gen blaKPC 87

4.2 Khả năng lan truyền gen kháng kháng sinh của các chủng Klebsiella pneumoniae kháng carbapenem mang gen blaKPC 89

4.2.1 Phát hiện plasmid mang gen blaKPC 89

4.2.2 Thử nghiệm khả năng truyền plasmid mang gen blaKPC 90

4.3 Đặc tính dịch tễ học phân tử của Klebsiella pneumoniae kháng carbapnem mang gen blaKPC 93

4.3.1 Khảo sát mối liên hệ kiểu gen giữa các chủng bằng kỹ thuật PFGE 93

TÓM TẮT LUẬN ÁN BẰNG TIẾNG ANH 103

TÀI LIỆU THAM KHẢO 112

PHẦN PHỤ LỤC 1

PHỤ LỤC 1 DANH SÁCH BỆNH NHÂN TRONG NGHIÊN CỨU 1

PHỤ LỤC 2 QUY TRÌNH CHẠY PFGE VÀ SOUTHERN BLOT 4

PHỤ LỤC 3 HÌNH ẢNH GIẢI TRÌNH TỰ CỦA GEN BLAKPC 11

PHỤ LỤC 4 HÌNH ẢNH GIẢI TRÌNH TỰ CỦA CÁC GEN GIỮ NHÀ 13

PHỤ LỤC 5 KẾT QUẢ PFGE 17

ADN Axit deoxyribonucleic

ADH Arginine Dihydrolase

CIT Citrate utilization

DCA deoxycholate citrate agar

ESBL Extended-spectrum beta lactamase

KPC Klebsiella pneumoniae carbapenemase (Enzym kháng

carbapenem phát hiện trên các chủng Klebsiella pneumoniae)

NCBI National Center for Biotechnology Information (Trung tâm

thông tin công nghệ sinh học quốc gia Mỹ) NDM-1 New Delhi metallo-betalactamase-1

NGS Next generation sequencing

ODC Ornithine Decarboxylase

ONPG Ortho Nitrophenyl-ßD-galactopyranosidase

PCR Polymerase chain reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp)

PFGE Pulse field gel electrophoresis (Điện di trường xung)

pgi phosphoglucose isomerase

SMA Sodium mercapto acetic acid

SME Serratia marcescens enzyme

SS Salmonella Shigella agar

ST Sequence type (Kiểu trình tự)

SXT Trimethoprim sulphamethoxazole

TDA Tryptophane Deaminase

URE Urease

VIM Verona integron-encoded metallo-β-lactamase

Bảng 1.2 Phân loại, các biến thể của carbapenemase 13

Bảng 2.1 Các phản ứng sinh hóa của K pneumoniae trên bộ API-20E 42

Bảng 2.2 Các cặp mồi đặc hiệu phát hiện các gen mã hóa -lactamase 45

Bảng 2.3 Các cặp mồi dùng cho phân tích MLST 48

Bảng 3.1 Phân bố chủng vi khuẩn đường ruột kháng carbapenem 51

Bảng 3.2 Phân bố chủng K pneumoniae kháng carbapenem mang gen blaKPC 54

Bảng 3.3.A Kết quả thử nghiệm khoanh giấy kháng sinh của K pneumoniae kháng carbapenem mang gen blaKPC tại bệnh viện Xanh pôn và Thanh Nhàn 56

Bảng 3.3.B Kết quả thử nghiệm khoanh giấy kháng sinh của K pneumoniae kháng carbapenem mang gen blaKPC tại bệnh viện Việt Đức 57

Bảng 3.4 Kết quả MIC tại bệnh viện Xanh pôn 58

Bảng 3.5 Kết quả MIC50 và MIC90 tại bệnh viện Xanh pôn 59

Bảng 3.6 Kết quả MIC tại bệnh viện Thanh Nhàn 60

Bảng 3.7 Kết quả MIC50 và MIC90 tại bệnh viện Thanh Nhàn 61

Bảng 3.8 Kết quả MIC tại bệnh viện Việt Đức 61

Bảng 3.9 Phân bố các gen ESBL của các chủng vi khuẩn K.pneumoniae 64

Bảng 3.10 Kiểu hình ESBL của các chủng K pneumoniae 64

Bảng 3.11 Phân bố ca bệnh nhiễm khuẩn bệnh viện do vi khuẩn sinh KPC 66

Bảng 3.12 Phân bố ca bệnh nhiễm khuẩn bệnh viện do vi khuẩn sinh KPC 67

Bảng 3.13 Tỷ lệ truyền plasmid mang gen blaKPC từ chủng K pneumoniae 71

Bảng 3.14 Phân bố genotype của các chủng K pneumoniae kháng carbapenem mang gen blaKPC 75

Bảng 3.15.A Kết quả MLST của các chủng K pneumoniae kháng carbapenem

mang gen blaKPC phân lập tại các bệnh viện từ 2010-2012 78

Bảng 3.15.B Kết quả MLST của các chủng K pneumoniae kháng carbapenem

mang gen blaKPC phân lập tại các bệnh viện từ năm 2012-2014 79

Hình 1.2 Dự kiến số lượng bệnh nhân tử vong trên thế giới do một số

nguyên nhân hàng đầu tại thời điểm 2050 9

Hình 1.3 Cơ chế kháng kháng sinh của các vi khuẩn Gram âm 10

Hình 1.4 Vùng hoạt động của carbapenemase nhóm A 15

Hình 1.5 Phân bố các chủng K pneumoniae sinh KPC 18

Hình 1.6 Sự khác nhau của các biến thể blaKPC 24

Hình 1.7 Cây tiến hóa của các biến thể blaKPC 25

Hình 1.8 Các đồng phân của Tn4401 26

Hình 3.1 Phân bố K pneumoniae kháng carbapenem tại các bệnh viện 50

Hình 3.2 Kết quả đại diện phát hiện K pneumoniae mang gen blaKPC 52

Hình 3.3 Số lượng chủng K pneumoniae kháng carbapenem mang gen blaKPC 53

Hình 3.4 So sánh trình tự gen blaKPC của K pneumoniae kháng carbapenem trong nghiên cứu với trình tự chuẩn trong ngân hàng gen 55

Hình 3.5 Kết quả phát hiện gen blaSHV của đại diện một số chủng K pneumoniae 62

Hình 3.6 Kết quả phát hiện gen blaTEM của đại diện một số chủng K pneumoniae 63

Hình 3.7 Kết quả phát hiện gen blaCTX-M của đại diện một số chủng K pneumoniae 63

Hình 3.8 Phân bố ca bệnh nhiễm khuẩn bệnh viện do vi khuẩn sinh KPC 65

Hình 3.9 Phân bố ca bệnh nhiễm khuẩn bệnh viện do vi khuẩn sinh KPC 67

Hình 3.10 Kết quả PFGE sau khi cắt bằng enzyme S1 của một số chủng K pneumoniae kháng carbapenem mang gen blaKPC 68

Hình 3.11 Kết quả Southern blot phát hiện gen blaKPC của một số chủng K pneumoniae kháng carbapenem 69

Hình 3.12 Hình ảnh khuẩn lạc E coli J53 sau tiếp hợp plasmid trên môi trường thạch Mac Conkey có chứa Meropenem và NaN3 70

pneumoniae kháng carbapenem mang gen blaKPC 72

Hình 3.15 Cây phả hệ của 75 chủng K pneumoniae kháng carbapenem mang

gen blaKPC 74

Hình 3.16 Ảnh điện di kết quả PCR các gen giữ nhà của K pneumoniae

kháng carbapenem mang gen blaKPC 77

Sơ đồ 2.1 Tóm tắt quy trình nghiên cứu 41

MỞ ĐẦU

Kể từ khi được phát minh, kháng sinh đã đóng vai trò quan trọng hàng đầu trong nền y học hiện đại góp phần to lớn vào công tác điều trị và khống chế bệnh nhiễm trùng Tuy nhiên do việc sử dụng kháng sinh rộng rãi trong điều trị, nhất là các kháng sinh mới đã nhanh chóng làm gia tăng sự kháng thuốc của vi khuẩn Tình trạng kháng khuốc của vi khuẩn đã được tổ chức Y tế thế giới coi là một vấn

đề quan trọng tác động đến sức khỏe của con người và được xếp vào một trong năm vấn đề quan trọng hàng đầu của các bệnh nhiễm trùng cần được giám sát một cách chặt chẽ (Weinberg J, 1999)

Hiện nay, các nhóm kháng sinh thế hệ mới phổ rộng được sử dụng điều trị các chủng kháng đa kháng sinh có ý nghĩa quan trọng trong công tác điều trị các bệnh nhiễm trùng tại các bệnh viện Tuy nhiên, do sử dụng kháng sinh nhiều và kéo dài đã dẫn đến tình trạng gia tăng các chủng vi khuẩn kháng đa kháng sinh thế

hệ mới phổ rộng ở nhiều nước trên thế giới (Harish, 2007; Girmenia, 2016) Do vậy, nhóm carbapenem đang được sử dụng là thuốc đầu tay, thuộc nhóm “lựa chọn cuối cùng” trong các bệnh viện để điều trị các trường hợp nhiễm trùng nặng với các chủng vi khuẩn kháng các kháng sinh phổ rộng Tuy nhiên, thực trạng sử dụng

và lạm dụng kháng sinh đã gây ra áp lực chọn lọc cho vi khuẩn kháng lại các kháng sinh nhóm carbapenem Đây là một trong những vấn đề hiện nay đang được tổ

chức Y tế Thế giới, các quốc gia và nhiều nhà khoa học quan tâm hàng đầu Các

bệnh nhân bị nhiễm trùng bởi các vi khuẩn kháng carbapenem sẽ làm tăng nguy

cơ thất bại trong điều trị, tăng chi phí, kéo dài thời gian điều trị và nguy cơ tử vong cao cho bệnh nhân Với tình trạng kháng kháng sinh mạnh mẽ của các vi khuẩn như hiện nay sẽ dẫn tới tình trạng không có kháng sinh điều trị hiệu quả các vi khuẩn này trong 10 năm tới Đây là mối lo ngại toàn cầu cần được nghiên cứu nhằm hiểu rõ thực trạng để đưa ra giải pháp hợp lý và hiệu quả hạn chế tình trạng kháng kháng sinh của vi khuẩn

Tại Việt Nam, các nghiên cứu được thực hiện tại các bệnh viện cho thấy tỷ

lệ các chủng K pneumoniae kháng carbapenem từ năm 2010 đến năm 2014 đã

tăng vọt đáng báo động từ dưới 10% lên hơn 60% Thực trạng kháng kháng sinh tại Việt Nam đang ngày càng trở nên phức tạp và vượt ngoài tầm kiểm soát Các nghiên cứu thời gian gần đây cũng cho thấy, vi khuẩn kháng carbapenem tại Việt Nam thông qua nhiều cơ chế khác nhau Sự có mặt của các gen siêu kháng thuốc

NDM-1 cũng đã được ghi nhận (Hoang, 2013) Mặc dù K pneumoniae kháng carbapenem mang gen blaKPC là nguyên nhân hàng đầu trong các bệnh nhiễm trùng tại bệnh viện, cho đến nay chưa có nghiên cứu về dịch tễ học phân tử được thực hiện trên các chủng tại Việt Nam Chính vì vậy, sự cần thiết hiểu được các yếu tố

cơ bản và chuyên sâu bao gồm dịch tễ học, đặc điểm sinh học phân tử và dịch tễ

học phân tử của K pneumoniae kháng carbapenem mang gen blaKPC là hết sức cấp thiết và vô cùng quan trọng trong giai đoạn hiện nay Kết quả nghiên cứu sẽ giúp các cơ quan chức năng đưa ra các chương trình kiểm soát sử dụng kháng sinh nhằm khống chế gia tăng tình trạng vi khuẩn kháng thuốc, làm cơ sở đưa ra các phương pháp điều trị bệnh nhân hợp lý và hiệu quả

Để tìm hiểu về tỷ lệ các chủng mang gen kháng kháng sinh tại các bệnh viện trên địa bàn Hà Nội, cũng như đặc điểm dịch tễ học phân tử của các chủng phân lập được, chúng tôi tiến hành nghiên cứu: “Đ ặc tính sinh học phân tử chủng

Klebsiella pneumoniae kháng carbapenem mang gen blaKPC phân lập tại một

số bệnh viện trên địa bàn Hà Nội” với ba mục tiêu cụ thể sau:

- Xác định đặc tính đề kháng carbapenem qua KPC của các chủng K

pneumoniae phân lập tại ba bệnh viện trên địa bàn Hà Nội

- Xác định khả năng truyền gen kháng kháng sinh của các chủng K

pneumoniae kháng carbapenem mang gen blaKPC.

- Xác định đặc tính dịch tễ học phân tử của các chủng K pneumoniae mang gen blaKPC.

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Klebsiella pneumoniae gây bệnh trên người

1.1.1 Đặc điểm sinh học

• Phân loại

Dựa vào độ tương đồng di truyền, chi Klebsiella được chia làm 8 loài:

Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Klebsiella planticola, Klebsiella terrigena, Klebsiella mobilis (Enterobacter aerogenes), Klebsiella ornithinolytica

và Klebsiella variicola

K pneumoniae lại được chia làm 3 loài phụ là K pneumoniae, K ozaenae

và K.a rhinoscleromatis

Sự phân chia này dựa theo sự khác nhau trong quá trình phát sinh bệnh chứ

không dựa vào khoảng cách di truyền (Brisse, 2006) Trong chi Klebsiella, K

pneumoniae là thành viên quan trọng nhất về bệnh học và đã trở thành một trong

những tác nhân gây nhiễm khuẩn bệnh viện nghiêm trọng trong những năm gần đây (https://en.wikipedia.org/wiki/Klebsiella)

Đặc điểm phân loại của K pneumoniae:

• Phân bố

K pneumoniae có thể được tìm thấy trong miệng, da và đường ruột nhưng

những chủng vi khuẩn này ban đầu không có khả năng gây bệnh (Postgate, 1998)

Mặc dù được tìm thấy trong hệ vi khuẩn chí bình thường ở người, K pneumoniae

có thể biến đổi thành dạng vi khuẩn có khả năng gây nhiễm khuẩn nặng cho người như viêm phổi, nhiễm trùng máu, nhiễm trùng vết thương, nhiễm trùng đường tiết niệu và viêm màng não (https://en.wikipedia.org/wiki/Klebsiella)

• Đặc điểm hình thái

K pneumoniae là trực khuẩn gram âm, không di động, có khả năng lên

men lactose, là vi khuẩn kị khí tùy tiện (Ryan, 2004) Vi khuẩn này thường đứng thành đôi, không di động, có vỏ dày (kích thước có thể gấp 2-3 lần tế bào vi khuẩn)

Trên môi trường thạch máu, K pneumoniae thường có khuẩn lạc dạng S, nhày,

mỡ, đường kính 2 mm, sắc tố màu trắng đục, có thể tan máu hoặc không tan máu Trên môi trường DCA, SS, Mac Conkey khuẩn lạc màu hồng do lên men lactose

Vi khuẩn này được bao quanh bởi một lớp vỏ, có tác dụng làm tăng độc tính của

vi khuẩn bằng cách hoạt động như một rào cản vật lý để tránh phản ứng miễn dịch của vật chủ Lớp vỏ này còn có khả năng bảo vệ các tế bào vi khuẩn không bị khô

do tác động của môi trường ngoại cảnh K pneumoniae là vi khuẩn phổ biến trong

môi trường sống, nó có thể cư trú trong hệ vi sinh của người

1.1.2 Vai trò gây bệnh

K pneumoniae là một trong ba tác nhân vi khuẩn hàng đầu (K

pneumoniae, E coli, S aureus) trong 7 tác nhân gây nhiễm khuẩn cho người được

Tổ chức Y tế thế giới liệt kê, đưa vào danh sách các chủng vi khuẩn kháng kháng sinh mấu chốt (O’Neill, 2014) K pneumoniae có thể gây viêm và xuất huyết kèm hoại tử làm tổn thương phổi nặng Thông thường, nhiễm trùng Klebsiella được ghi

nhận chủ yếu ở những người có hệ miễn dịch suy yếu Phân là nguồn lan truyền

vi khuẩn quan trọng nhất từ những bệnh nhân bị nhiễm trùng, kế đến là việc tiếp

xúc với dụng cụ bị nhiễm bẩn (Epstein, 2015) Ngoài ra, việc sử dụng thuốc kháng sinh có thể là một yếu tố làm tăng nguy cơ nhiễm trùng bệnh viện với vi khuẩn

Klebsiella K pneumoniae là một trong những chủng vi khuẩn nhiễm khuẩn bệnh

viện kháng đa kháng sinh, trong đó, nguồn lây truyền tính kháng kháng sinh chủ yếu thông qua các gen kháng kháng sinh nằm trên plasmid từ chủng này sang chủng khác (Hudson, 2014)

Môi trường sống của K pneumoniae không chỉ giới hạn ở người mà còn lan rộng trong môi trường sinh thái, như đất, nước và nước thải K pneumoniae

có thể sống sót trong môi trường khắc nghiệt trong thời gian dài (Pitout, 2015)

Do vậy, K pneumoniae sinh KPC đã được phát hiện trong môi trường và các trang

thiết bị ở bệnh viện như áo choàng, găng tay (Rock, 2014) và nước thải (Galler,

2014) Tần suất lây nhiễm K pneumoniae sinh KPC do găng tay của nhân viên y

tế cũng tương tự như nhiễm khuẩn do Staphylococcus aureus và Enterococcus

kháng Vancomycin (Rock, 2014) Điều này cho thấy sự lan truyền nhanh chóng

của K pneumoniae sinh KPC trong môi trường bệnh viện Một nghiên cứu cho thấy sau khi bệnh nhân xuất viện, các chủng K pneumoniae sinh KPC vẫn có thể

sống sót sau 3 năm (Lübbert, 2014) Việc chuyển gen KPC giữa các vi khuẩn

Enterobacteriaceae (từ K pneumoniae đến E coli) cư trú trong ruột người xảy ra

thường xuyên (Gona, 2014) Do đó, các ổ chứa là trang bị bảo hộ của nhân viên y

tế, đồ dùng bệnh nhân, hoặc môi trường bệnh viện có thể là một phương thức chủ yếu lây lan các nhiễm khuẩn bệnh viện

Các chủng Klebsiella kháng thuốc mới đang ngày một gia tăng gây khó

khăn cho công tác điều trị và là vấn đề toàn cầu (Groopman, 2008) Một nghiên cứu gần đây cho thấy, đến năm 2050, hơn 10 triệu người sẽ chết mỗi năm nếu sự gia tăng của các vi khuẩn kháng kháng sinh vẫn tiếp tục duy trì tốc độ phát triển như hiện tại (O’Neill, 2014) Chính vì vậy, nghiên cứu các đặc tính kháng kháng

sinh và dịch tễ học phân tử các chủng K pneumoniae gây bệnh trên người có vai

trò hết sức quan trọng trong việc kiểm soát sự gia tăng kháng kháng sinh trên toàn cầu

1.2 Kháng sinh carbapenem

1.2.1 Giới thiệu chung về kháng sinh

Trước đầu thế kỷ 20, điều trị nhiễm trùng chủ yếu dựa trên các phương pháp

y học dân gian Các hợp chất với các đặc tính kháng khuẩn đã được sử dụng trong điều trị nhiễm khuẩn đã được phát hiện cách đây hơn 2000 năm (Lindblad, 2008) Nhiều nền văn hóa cổ, bao gồm Hy Lạp cổ đại và Ai Cập cổ đại sử dụng nấm mốc được chọn lọc đặc biệt, nguyên liệu thực vật và các chiết xuất để trị nhiễm khuẩn (Forrest, 1982; Wright, 1999) Các nghiên cứu mới đây trong phòng thí nghiệm vi sinh đã phát hiện các kháng sinh tự nhiên được tạo ra từ vi sinh vật (Kingston, 2008)

Năm 1928, Alexander Fleming lần đầu tiên quan sát thấy kháng sinh chống

lại vi khuẩn từ 1 loài nấm trong chi Penicillium Tuy nhiên, phải đến khi các nhà

khoa học khác trên thế giới bắt đầu nghiên cứu, công nghệ sản xuất kháng sinh mới thật sự phát triển (Fleming, 1980; Sykes, 2001)

Kháng sinh thường được phân loại dựa theo cấu trúc hoặc chức năng:

• Theo cấu trúc: các kháng sinh có vòng beta lactam, các kháng sinh

aminoglycoside thay đổi tùy theo chiều của chuỗi phân tử

• Theo chức năng:

- Các kháng sinh ức chế tổng hợp thành tế bào: các beta lactam (penicillin,

cephalosporin, monolactam, carbapenem), các glycopeptide, các fosfomycin

- Kháng sinh ức chế tổng hợp protein: aminoglycoside, tetracycline,

glycylcycline, phenicol, oxazolidinone, ansamicin

- Kháng sinh ức chế các chức năng của màng tế bào: lipopeptide, polymyxin

- Kháng sinh ngăn cản quá trình trao đổi chất

- Kháng sinh ức chế quá trình tổng hợp axit nucleic: quinolonee, furane

1.2.2 Kháng sinh carbapenem

Carbapenem (imipenem, meropenem, biapenem, ertapenem và doripenem)

là các thuốc kháng sinh nhóm β lactam

Hình 1.1 Cấu tạo các kháng sinh carbapenem

(Nguồn: ( Moellering, 1989)

Các nghiên cứu trên carbapenem đã chỉ ra có rất nhiều cấu trúc carbapenem khác nhau Imipenem, meropenem, biapenem, ertapenem, và doripenem có cấu trúc tương tự như penicillin nhưng nguyên tố lưu huỳnh được thay thể bằng nguyên tử các bon ở vị trí 1 và 1 liên kết đôi giữa C-2 Và C-3 (hình 1.1) (Moellering, 1989)

Tên thuốc và phổ tác dụng của một số kháng sinh carbapenem được trình bày trong bảng 1.1 Carbapenem có khả năng khuếch tán dễ dàng trong vi khuẩn

Do vậy, chúng có khả năng tiêu diệt các vi khuẩn kháng kháng sinh sinh men - lactamase (ESBL) thông qua việc ức chế quá trình tổng hợp vỏ ngoài của tế bào

vi khuẩn bằng cách bám vào protein gắn penicillin (PBP-penicillin-binding

protein) của vi khuẩn và ngăn cản sự hình thành peptidoglycan, qua đó ngăn cản

sự hình thành màng tế bào Hệ quả của quá trình này là làm thành tế bào vi khuẩn

bị yếu đi và bị ly giải hoặc chết dưới tác dụng của áp suất thẩm thấu (Kotra, 1998) Ertapenem, imipenem và meropenem là 2 đại diện được sử dụng rộng rãi

được trên phần lớn các chủng Pseudomonas và Acinetobacter Tác động trên nhiều chủng kỵ khí, bao gồm cả B fragilis Không bền vững

đối với men DHP-1 tại thận nên cần phối hợp cilastatin

Meropenem Phổ tác dụng tương tự imipenem, có tác dụng trên một số chủng gram

âm như P aeruginosa, kể cả đã kháng imipenem

Doripenem Phổ tác dụng rộng tổng hợp của cả imipenem và meropenem Có khả

năng kháng Pseudomonas tốt hơn

Ertapenem

Phổ tác dụng tương tự các carbapenem nhưng tác dụng trên các

chủng Pseudomonas và Enterococcus spp yếu hơn so với các thuốc

cùng nhóm

(Nguồn: ( Zhanel, 2007; Nicolau, 2008)

Hiện nay, carbapenem là kháng sinh thuộc nhóm “lựa chọn cuối cùng”

để điều trị cho các trường hợp nhiễm trùng với các vi khuẩn kháng kháng sinh

phổ rộng như E coli, K pneumoniae Vì carbapenem có phổ rộng nhất trong số

tất cả các β lactam và chủ yếu được sử dụng để điều trị nhiễm trùng bởi các vi khuẩn Gram âm đa kháng kháng sinh, việc sử dụng rộng rãi đã tạo áp lực chọn lọc cho vi khuẩn kháng lại kháng sinh này thông qua cơ chế phân hủy kháng sinh nhờ carbapenemase Sự xuất hiện và lan truyền carbapenemase đã trở thành một mối thách thức lớn đối với sức khoẻ cộng đồng (Jeon, 2015)

1.3 Klebsiella pneumoniae kháng kháng sinh qua cơ chế sinh KPC

1.3.1 Đặc tính kháng kháng sinh của vi khuẩn

Hình 1.2 Dự kiến số lượng bệnh nhân tử vong trên thế giới do một số nguyên

nhân hàng đầu tại thời điểm 2050

Ghi chú: - KKS: kháng kháng sinh

(Nguồn: ( O’Neill, 2014)

Khả năng kháng thuốc là sức đề kháng của vi sinh vật với 1 loại kháng sinh

mà ban đầu có hiệu quả để điều trị các bệnh nhiễm trùng Do tình trạng kháng kháng sinh của vi khuẩn mà phương pháp điều trị tiêu chuẩn trở nên không còn hiệu quả và nhiễm trùng trở nên kéo dài, làm tăng nguy cơ lây lan trong cộng đồng Một nghiên cứu đã chỉ ra rằng đến năm 2050, tỷ lệ bệnh nhân tử vong do

vi khuẩn kháng sinh là 10 triệu người, cao hơn rất nhiều so với các nguyên nhân khác (hình 1.2) (O’Neill, 2014)

Sự tiến hóa của các chủng kháng thuốc là một hiện tượng tự nhiên xảy ra khi có sự sai sót trong quá trình tự nhân bản hoặc truyền tính kháng thuốc giữa các vi sinh vật Vi khuẩn trở nên kháng kháng sinh qua một loạt các cơ chế

(Wright, 2005), (hình 1.3): sinh enzyme phân hủy các hoạt chất kháng sinh, thay đổi áp suất thẩm thấu của thành tế bào vi khuẩn qua đó giới hạn khả năng xâm nhập của kháng sinh vào vùng đích của tế bào, hoạt hóa kênh bơm đẩy kháng sinh

ra khỏi tế bào, thu nhận các con đường trao đổi chất thay thế các con đường bị ức chế bởi kháng sinh hay thay đổi đích tác động của kháng sinh

Hình 1.3 Cơ chế kháng kháng sinh của các vi khuẩn Gram âm

(Nguồn: ( https://www.britannica.com/science/antibiotic-resistance)

Trong tất cả các cơ chế kháng kháng sinh, khả năng sinh enzyme phân hủy kháng sinh là một trong những cơ chế quan trọng hàng đầu đang được các nhà nghiên cứu trên thế giới tập trung nghiên cứu Enzyme của vi khuẩn đầu tiên được tìm thấy có khả năng phá hủy kháng sinh đầu tiên, penicillin, được gọi là AmpC

β-lactamase được phân lập từ E coli Khả năng kháng lại kháng sinh beta lactam

của vi khuẩn ngày càng gia tăng và trở thành một hiện trạng thường được ghi nhận

Cơ chế kháng thường thấy và quan trọng nhất là vi khuẩn có khả năng tiết enzyme

-lactamase như ESBL, enzyme AmpC, và -lactamase ly giải carbapenem

(Jacoby, 2009) Beta lactamase mã hóa qua trung gian plasmid đầu tiên được phát hiện ra vào những năm 1960 trên vi khuẩn Gram âm (Datta, 1965) Ngày nay, hơn

1150 beta lactamase được mã hóa trên chromosome, plasmid và các gen nhảy đã được ghi nhận (Bush, 2010)

Dựa trên hoạt động ly giải của enzyme có thể chia thành các các nhóm hẹp, trung bình, rộng và phổ rộng hơn (ESBL) Enzyme -lactamase phổ rộng (ESBL)

có khả năng kháng lại penicillin, cephalosporin thế hệ 1, 2 và 3 và aztreonam, nhưng không kháng lại carbapenem và có thể bị ức chế bởi các chất ức chế -lactamase Tuy nhiên, các vi khuẩn có khả năng sinh enzyme carbapenemase có khả năng ly giải penicillin, cephalosporin, monobactam và carbapenem đang làm

vô hiệu hoạt lực của các kháng sinh -lactam dẫn đến nhiễm trùng trở nên trầm trọng kéo dài (Queenan, 2007) Trong một vài năm gần đây, các gen kháng kháng sinh vi khuẩn thu nhận được mang gen mã hóa ESBL, carbapenem đang trở thành một vấn đề nan giải trên toàn cầu (Bradford, 2001)

1.3.2 Đặc tính kháng carbapenem

1.3.2.1 Các cơ chế kháng carbapenem

Khả năng kháng carbapenem của vi khuẩn Gram âm thông qua các cơ chế:

- Kênh vận chuyển carbapenem ra khỏi tế bào, tăng cường cơ chế bơm đẩy

- Sự đột biến hay mất một số porin màng ngoài, ngăn cản các kháng sinh vào trong tế bào (Little, 2012):

Thay đổi protein của porin gây khó khăn cho việc khuếch tán kháng sinh vào trong chu chất của tế bào (Logan, 2012): các vi khuẩn có khả năng sinh ESBL qua plasmid có thể trở thành chủng kháng carbapenem nếu có chuỗi trình tự 4 nucleotid lặp lại xuất hiện trong bộ gen mã hóa cho tổng hợp protein porin màng tế bào (Little, 2012)

K pneumonia kháng lại kháng sinh bằng cơ chế không hình thành protein

porin ở màng ngoài tế bào, OmpK35 và OmpK36: các protein porin màng ngoài tham gia vào việc vận chuyển các vật liệu di truyền kháng kháng sinh trong tế bào Việc mất hoặc OmpK35 và OmpK36 (Bratu, 2007) dẫn đến việc kháng lại carbapenem Sự thiếu hụt porin OmpK36 có thể xuất phát từ đột biến điểm gây ra sự sai sót trong quá trình phiên mã, cho ra những

protein bị cắt ngắn và không còn chức năng vốn có Với Klebsiella

pneumonia, sự thiếu hụt hoặc OmpK35 và OmpK36 đem lại khả năng kháng

carbapenem, đặc biệt khi thiếu hụt cả 2 protein cùng lúc, khả năng kháng kháng sinh được tăng cường hơn nhiều lần Đã có những ghi nhận về sự gia tăng khả năng kháng kháng sinh từ 32 lên đến 64 lần trong thí nghiệm MIC của carbapenem khi cả 2 protein porin không được thể hiện (Bratu, 2005)

- Túi màng ngoài (OMV), có thể vận chuyển ADN giữa các tế bào vi khuẩn qua hoạt động trao đổi chất Các chủng gây bệnh có thể sản sinh các túi cao gấp 10-25 lần so với chủng không gây bệnh Đây là điều kiện giúp lan truyền khả năng kháng carbapenem rộng rãi của vi khuẩn OMV bảo vệ plasmid không bị ly giải bởi nuclease màng ngoài tế bào và đây là điều kiện phù hợp để chúng tham gia quá trình chuyển gen ngang (Buynak, 2004)

- Cơ chế sinh enzyme carbapenemase phân hủy kháng sinh: đây là cơ chế

quan trọng nhất tạo nên khả năng kháng carbapenem của Klebsiella

1.3.2.2 Enzyme carbapenemase

Các vi khuẩn đường ruột kháng lại carbapenem do có khả năng sinh ra enzyme carbapenemase, là một dạng của beta lactamase (Bratu, 2007) Những enzyme này chia cắt vòng beta lactam, là thành phần cần thiết của các kháng sinh

họ beta lactam dùng để nhận diện và bám vào các PBP (penicillin binding protein)

Carbapenemase là họ β-lactamase linh hoạt nhất có khả năng thủy phân carbapenems và nhiều β-lactam khác Dựa trên sự hoạt hóa enzyme dưới tác động

của các cation hóa trị 2, các carbapenemase có thể chia thành các metallo carbapenemase (carbapenemase nhóm B hoạt hóa bởi kẽm) và non-metallo carbapenemase (các carbapenemase nhóm A, C và D hoạt hóa không phụ thuộc

kẽm) (Lee, 2006) Hầu hết các carbapenemase đều có thể phân lập được từ K

pneumoniae cho thấy vi khuẩn này là một trong những vi khuẩn hàng đầu có khả

năng sản sinh các enzyme phân hủy kháng sinh nhóm carbapenem (bảng 1.2)

Bảng 1.2 Phân loại, các biến thể của carbapenemase

K pneumoniae, E coli, K oxytoca, S

marcescens, Enterobacter spp., C freundii, S enterica, Raultella spp

VIM-1,-2,-4, -5,-6

K pneumoniae, E coli, K oxytoca, S

marcescens

VIM-11,-12, -13,-19,-23

S liquefaclens, Enterobacter spp., C freundii

VIM-24,-25, -26,-27,-32 M morganii, P stuartii, P mirabilis

IMP-1,-3,-4, -6, -8

K pneumoniae, E coli, K oxytoca, S

marcescens

IMP-11,-24, -27

a Tham khảo (Hall, 2005)

b Tham khảo (Bush, 2010)

• Enzyme carbapenemase nhóm A

Carbapenemase nhóm A (bảng 1.2), bao gồm KPC (Klebsiella pneumoniae carbapenemase), IMI (imipenem-hydrolyzing β-lactamase), SME (Serratia

marcescens enzyme), SFC (Serratia fonticola carbapenemase), NMC-A (non

metallo carbapenemase của nhóm A) và một số enzyme GES (Guiana

extended-spectrum β-lactamase) được phát hiện nhiều nhất trong các Enterobacteriaceae và

Pseudomonas aeruginosa (Henriques, 2004; Lee, 2006; Thomson, 2010)

Các enzyme này bị ức chế bởi clavulanat, ngoại trừ một số enzyme KPC như KPC-2 Carbapenemase nhóm A đầu tiên mã hoá trên chromosome (NMC-

A: non metallo carbapenemase nhóm A) được xác định từ chủng Enterobacter

cloacae được phân lập từ mủ của một bệnh nhân nhiễm trùng dưới da tại Paris

(Nordmann, 1993) Các enzyme IMI (imipenem hydrolyzing β-lactamase) được xác định từ các chủng hiếm gặp của họ Enterobacter ở Mỹ, Pháp, Croatia, Phần

Lan, Argentina và Ireland Các enzyme SME, được tìm thấy trong S marcescens

Các enzyme họ GES (Guiana extended-spectrum β-lactamase) gồm 26 biến thể khác nhau từ 1 đến 4 axit amin (Jeon, 2015) Enzyme KPC chủ yếu được phân lập

từ K pneumoniae hiện nay là những enzyme quan trọng có ý nghĩa lâm sàng nhất

trong số các loại carbapenemase ở nhóm A với khả năng đề kháng cao với kháng sinh họ carbapenem và hầu hết các kháng sinh β-lactam (Nordmann, 2014) KPC được phân lập lần đầu năm 2009 tại Bắc Mỹ Hiện nay, có 22 biến thể KPC khác nhau bởi 1 đến 3 axit amin

Các cấu trúc tinh thể của các carbapenemase nhóm A như NMC-A,

SME-1, GES-5, SFC-SME-1, và KPC-2 đã được các nhà khoa học xác định Hiệu suất xúc tác (Kcat/Km) của NMC-A, SME-1, GES-5, SFC-1 và KPC-2 đối với imipenem là 11,3, 0,515 , 0.286, 0.659, và 0.295 μM-1·S-1 Cấu trúc chung của chúng được bảo tồn trong các loại β-lactamase điển hình nhóm A khác bao gồm 2 vùng chính Vùng 1 chỉ bao gồm chuỗi xoắn α và vùng 2 bao gồm năm sợi β có các chuỗi xoắn

α Các vùng hoạt động của các motif Ser70-X-X-Lys73, Ser130-Asp131-Asn132

và Lys234-Thr/Ser235-Gly236 được bảo tồn trong tất cả các loại β-lactamase và carbapenemase Ngoại trừ SHV-38, tất cả các carbapenemase nhóm A chỉ chứa 2

dư lượng cysteine (Cys69 và Cys238) tạo thành một cây cầu disulfide duy nhất (Jeon, 2015)

Hình 1.4 Vùng hoạt động của carbapenemase nhóm A

(a) Sự chồng chất các vùng hoạt động của KPC-2 (PDB nhập 2OV5, xanh lá) và GES-5 (PDBA nhập 4GNU, vàng) Cầu disulfide giữa C69 và C238 (mũi tên) được thể hiện trong KPC-2 và GES-5;

(b) Sự chồng chất các vùng hoạt động của các carbapenemase nhóm A (KPC-2 (PDB nhập 2OV5, xanh lá) và GES-5 (PDB nhập 4GNU, vàng)) và các loại enzyme không phải là carbapenemase nhóm A (TEM-1 (PDB nhập 1ZG4, đỏ ) và SHV-1 (PDB nhập 1SHV, xanh biển)) Các dư lượng (C69/M69, S70, K73, S130, N132, E166, N170/S170, T237/A237 và C238/G238) trong khe nứt tại vùng hoạt động được thể hiện dưới dạng que Sự chồng chất đã được thể hiện bằng cách sử dụng SSM Superpose (Krissinel and Henrick, 2004) để sắp xếp các chuỗi hoàn chỉnh Các số liệu này đã được chuẩn bị bằng PyMOL (DeLano S., 2015)

Cơ chế hoạt động của enzyme carbapenemase nhóm A đối với carbapenem cũng tương tự như các β-lactam nhóm A của các kháng sinh β lactam Nó bao gồm các bước acyl hóa và deacyl hóa Trong bước acyl hóa, hoạt tính Ser70 tấn công

liên kết amide của cơ chất β-lactam và tạo thành phức hợp acyl-enzyme Để kích hoạt hydroxyl của chuỗi Ser70, Glu166 và Lys73 cùng đóng vai trò như cơ chất chung cùng cạnh tranh hoặc hợp tác Trong bước deacyl hoá, adduct acyl được thủy phân bằng 1 phân tử nước đã deacylating, sau đó sản phẩm thủy phân được giải phóng khỏi vị trí hoạt động Thông qua bước này, Ser70 được tái sinh Vai trò của Glu166 (cơ chất chung) là sự kích hoạt của 1 phân tử nước deacyl hóa để thủy phân acyl adduct (Fonseca, 2012) Vùng hoạt động của các carbapenemase nhóm

A bao gồm một số dư lượng có tính bảo tồn cao, bao gồm Cys69, Ser70, Lys73, Ser130, Asn132, Glu166, Asn170, Thr237 và Cys238 (hình 1.4)

Trong KPC-2, sự thay đổi của 4 dư lượng (Ser70, Ser130, Asn132, và Asn170) của carbapenemase (KPC-2, NMC-A và SME-1) so với các enzyme khác như SHV-1 và TEM-1) cũng đã được ghi nhận Sự chuyển đổi các dư lượng chính như Ser70, Ser130, Asn132, và Asn170 trong SFC-1 so với các enzyme không phải là carbapenemase (SHV-1, CTX-M-16, BlaC và TEM-1) cũng đã được phát hiện (Jeon, 2015) Vị trí dễ tiếp xúc ở chuỗi bên của Ser70 trong vùng hoạt động của carbapenemase cho phép dễ dàng tiếp cận các cơ chất cồng kềnh Các nhà khoa học đã đưa ra giả thuyết sự di chuyển của các dư lượng chính trong vùng hoạt động của carbapenemase có thể mở rộng khu vực hoạt động và cho phép tiếp cận carbapenem ở vị trí hoạt động bằng cách quay vòng nhóm 6α-1R-hydroxyethyl carbapenem (Jeon, 2015)

• Enzyme carbapenemase các nhóm khác

Các carbapenem nhóm B phổ biến nhất là VIM (Verona integron

metallo-β-lactamase) và IMP (imipenem resistant Pseudomonas) Gần đây, các

carbapenemase NDM bắt đầu trở nên nổi trội IMP-1 được phát hiện ra đầu tiên ở

chủng S marcescens phân lập tại Nhật năm 1991 VIM-1 được phân lập lần đầu

tiên tại Ý vào năm 1997 Và một trong những enzyme carbapenemase quan trọng

hàng đầu trong lâm sàng, NDM-1 được phát hiện lần đầu tiên trên chủng E coli

từ 1 bệnh nhân người Thụy Điển vừa trở về từ Ấn Độ vào năm 2008 (Jeon, 2015)

Các loại carbapenemase của nhóm C, như ACT-1 (AmpC-type lactamase), DHA-1 (Bệnh viện Dhahran ở β-lactamase Ả Rập Saudi), CMY-2 (hydrolyzing β-lactamase cephamycin) và CMY-10 được phân lập trong

β-Enterobacteriaceae (Mammeri, 2010)

Các nhóm carbapenemase nhóm D thuộc họ OXA (oxacillinase) và đã được

nhận dạng trong phân lập Acinetobacter lâm sàng Chúng thủy phân carbapenem

yếu và bị ức chế yếu bởi clavulanat OXA-48 được phát hiện ra lần đầu tiên trên chủngK pneumoniae tại Thổ Nhĩ Kỳ vào năm 2003 (Poirel, 2004)

Carbapenemase quan trọng hàng đầu của họ vi khuẩn đường ruột

Enterobacteriace là enzyme nhóm A của các chủng có khả năng sản xuất KPC và

nhóm B (MbLs), đại diện cho các nhóm này là các gen VIM, IMP, và NDM Các plasmid nhóm D bao gồm OXA 48 cũng góp phần hoàn thiện bản đồ phân bố của enzyme này (bảng 1.2) (Grundmann, 2010; Miriagou, 2010; Patel, 2011)

1.3.3 Đặc điểm dịch tễ học của Klebsiella pneumoniae sinh KPC

1.3.3.1 Klebsiella pneumoniae sinh KPC kháng carbapenem trên thế giới

Trong vòng 10 năm trở lại đây, sự gia tăng đột biến tỷ lệ Klebsiella kháng

carbapenem đã được ghi nhận trên toàn cầu (hình 1.5) Bản đồ dịch tễ cho thấy sự gia tăng một cách nhanh chóng của các chủng vi khuẩn kháng carbapenem mang

gen blaKPC mã hóa KPC Sự phân bố của KPC thay đổi tùy vùng Sự có mặt của những vi khuẩn này đã được ghi nhận ở Mỹ, Trung Quốc, Ý, Ba Lan, Hy Lạp, Israel, Brazil, Argentina, Colombia và Đài Loan Các ca bệnh nhiễm khuẩn rải rác

có nguyên nhân do K pneumoniae sinh KPC cũng đã được báo cáo ở nhiều nước

châu Âu như Tây Ban Nha, Pháp, Đức, Hà Lan, Anh, Ailen, Bỉ, Thụy Điển, Phần Lan, và một số nước ở khu vực châu Á, bao gồm Ấn Độ, Hàn Quốc và Úc (Munoz-Price, 2013; Nordmann, 2014)

Hình 1.5 5 Phân bố các chủng K pneumoniae sinh KPC

Chú thích: (1) Mỹ; (2) Colombia; (3) Brazil; (4) Argentina; (5) Italy; (6) Hy Lạp; (7) Phần Lan; (8) Israel; (9) Trung Quốc; (10) Đài Loan; (11) Canada; (12) Tây Ban Nha; (13) Pháp; (14) Bỉ; (15) Hà Lan; (16) Đức; (17) Anh; (18) Ireland; (19) Thụy Điển; (20) Phần Lan; (21) Hungary; (22) Ấn Độ; (23) Hàn Quốc; (24) Úc; (25) Mexico; (26) Cuba; (27) Puerto Rico; (28) Uruguay; (29) Bồ Đào Nha; (30) Thụy Điển; (31) Austria; (32) Czech Republic; (33) Denmark; (34) Norway; (35) Croatia; (36) Turkey; (37) Algeria; (38) Egypt; (39) Nam Phi; (40) Iran; (41) Các tiểu vương quốc

và New Jersey (Bratu, 2007) Sau đó, các chủng vi khuẩn sinh KPC lan truyền một cách nhanh chóng dọc theo bờ đông và phân bố trên khắp nước Mỹ

(http://www.cdc.gov/HAI/organisms/cre.html) Các chủng sinh KPC cũng đã được phát hiện tại Colombia (Villegas MV, 2006; Rojas, 2013), Braxin (Peirano

G, 2009; Fehlberg, 2012) và Argentina (Pasteran, 2008; Gomez, 2011) Ở Canada,

nhiễm khuẩn do K pneumoniae sinh KPC cũng đã được báo cáo (Goldfarb D, 2009; Lefebvre, 2015) Sau khi phát hiện K pneumoniae sinh KPC qua trung gian

plasmid ở Ottawa (Goldfarb D, 2009), chương trình giám sát từ năm 2010 đến năm 2012 ở Canada cũng đã phát hiện tỷ lệ các chủng sinh KPC kháng carbapenem cao (89,3%) (Lefebvre và cộng sự, 2015) Ở Argentina, các chủng sinh KPC lại có sự khác biệt: đầu tiên là sự xuất hiện của các chủng

Enterobacteriaceae khác nhau chứa blaKPC-2 nằm trên plasmid IncL/M phân lập được ở các vùng khác nhau, lần thứ hai lại là sự lan truyền đột ngột của các dòng

K pneumoniae ST258 mang gen blaKPC-2 trong Tn4401a (Gomez, 2011) Các chủng K pneumoniae sinh KPC gần đây cũng được phát hiện ở Cuba (Quinones,

2014), Mexico (Garza-Ramos, 2014), Uruguay (Marquez, 2014) và Puerto Rico (Robledo IE, 2011)

• Tại Châu Âu

Vi khuẩn sinh KPC đầu tiên được phát hiện là chủng KPC-2 tại Paris, Pháp (Naas T, 2005) Điều thú vị là bệnh nhân này đã nhập viện tại 1 bệnh viện ở Mỹ 2

tháng trước đó Các vụ dịch do K pneumoniae sản xuất bởi KPC đã được báo cáo

ở Phần Lan (Osterblad, 2012; Kanerva, 2015) Gần đây, các chủng K pneumoniae

sinh KPC cũng đã được phát hiện ở các nước Đông Âu bao gồm Cộng hòa Séc (Hrabak, 2013), Hungary (Toth, 2010) và Croatia (Bedenic, 2012) Tại Hy Lạp,

K pneumoniae sinh KPC lần đầu tiên được phân lập vào tháng 8 năm 2007 và tỷ

lệ nhiễm khuẩn hiện mắc có nguyên nhân do những vi khuẩn kháng carbapenem thu được tại 1 bệnh viện ở Hy Lạp tăng từ 0% (2003) lên 38,3% (2010) Hầu hết

các chủng K pneumoniae sinh KPC ở Hy Lạp đều thuộc KPC-2 Trong khi nhiều

ca nhiễm khuẩn do K pneumoniae sinh carbapenemase ở Mỹ và Hy Lạp mang các

enzyme KPC (Zagorianou A, 2012), một số nghiên cứu ở Tây Ban Nha cho thấy

hầu hết các chủng K pneumoniae sinh carbapenemase lại là OXA-48, các carbapenemase nhóm B (Palacios-Baena, 2016) Những kết quả này chỉ ra rằng K

pneumoniae sinh enzyme carbapenemase nhóm nào thay đổi theo từng vùng địa

lý Sự lưu hành của các chủng vi khuẩn kháng carbapenem trong các nước Châu

Âu thường chỉ giới hạn là các vụ dịch lẻ tẻ do các chủng từ nơi khác đến (Woodford N, 2008) Ở Italy, nước đại diện của Nam Âu nơi KPC đang là tác nhân gây dịch, 89,5% chủng sinh carbapenemase được ghi nhận do enzyme KPC, tiếp theo là VIM-1 (9,2%) và OXA-48 (1,3%) (Giani, 2011) Tại Anh, NDM-1 mới là các carbapenemase nổi trội trong các vi khuẩn đường ruột (Canton R, 2012)

• Tại châu Phi

Ở châu Phi, một số quốc gia như Nam Phi, Algeria và Ai Cập cũng đã phân

lập được K pneumoniae sinh KPC (Lee, 2016)

• Tại Trung Đông

Ca bệnh phân lập được KPC đầu tiên tại Israel là một người du lịch từ New York trở về vào năm 2005 Tuy nhiên, kể từ sau ca bệnh đầu tiên, cả KPC-2 và KPC-3 đều được tìm thấy tại các vụ dịch địa phương của Israel Tương tự như Mỹ,

dòng K pneumoniae ST258 là phổ biến tại Israel May mắn là chính phủ Israel đã

nhận định được mối nguy hiểm tiềm tàng của các chủng KPC và thi hành 1 hệ thống giám sát trên toàn quốc Sau khi đưa vào hoạt động với các biện pháp kiểm soát dịch bệnh, sự xuất hiện của các chủng KPC tại Israel đã giảm và ổn định (Ciobotaro P, 2011)

• Tại Châu Á

Các chủng KPC phân bố tương đối rộng tại Châu Á (Jean SS, 2011; Lee,

2016) Sự lưu hành K pneumoniae sinh KPC đã được báo cáo ở Trung Quốc (Li,

2014) và Đài Loan (Tseng, 2015) Ở Trung Quốc, tỷ lệ của các chủng mang gen

mã hóa KPC trong số các chủng sinh carbapenemase cũng tương đối cao (63%) (Li, 2014) Một biến thể mới của KPC, KPC-15 có sự tương đồng với biến thể KPC-4 cũng đã được phát hiện ở Trung Quốc (Wang, 2014) Các ca bệnh rải rác cũng đã được ghi nhận ở Ấn Độ (Shanmugam, 2013) và Hàn Quốc (Yoo, 2013)

Dòng K pneumoniae ST11 tuy có mối quan hệ tương đồng với ST258 (dòng nổi

trội được ghi nhận ở các nước châu Âu và Mỹ) (Bowers, 2015), lại là dòng phổ biến tại châu Á (đặc biệt là ở Trung Quốc và Đài Loan) (Tseng, 2015) ST11 sinh KPC cũng đã được phát hiện ở Mỹ Latinh Mặc dù chưa biết nguyên nhân dòng

ST11 lại trở nên nổi trội, một báo cáo gần đây cho thấy dòng K pneumoniae ST11

sinh KPC đã kháng lại kháng huyết thanh (Chiang, 2016) Trong 1 bệnh viện

Trung Quốc, một vụ dịch nhiễm khuẩn bệnh viện có nguyên nhân do K

pneumoniae sinh KPC-2 lại do nhiều dòng K pneumoniae bao gồm ST37, ST392,

ST395 và ST11 Kết quả này cho thấy có sự chuyển gen blaKPC-2 ngang giữa các

dòng khác nhau của K pneumoniae ở Trung Quốc (Yang, 2013) Tại Đài Loan,

hai biến thể KPC mới cũng được xác định là KPC-16 và KPC-17 Một điều tra toàn quốc ở Đài Loan giữa năm 2011 và năm 2013 đã cho thấy sự lan truyền của

KPC-2 và KPC-17 trên toàn quốc (Tseng, 2015) K pneumoniae sinh KPC gần

đây cũng được phát hiện ở Nhật Bản, Pakistan, Iran và Các tiểu vương quốc Ả rập

thống nhất Tuy nhiên, ở Ả rập, tỷ lệ nhiễm khuẩn do K pneumoniae sinh KPC

rất thấp so với các carbapenemase nhóm NDM-1 và OXA-48 (Lee, 2016)

• Tại Châu Úc

Úc và New Zealand không có nhiều các báo cáo về sự lan rộng của các chủng sinh KPC mà chỉ có các ca bệnh lẻ tẻ xuất hiện do việc du lịch trở về từ các

vùng có dịch địa phương Ca bệnh đầu tiên phân lập được blaKPC tại Úc và New

Zealand đều là 1 chủng K pneumoniae từ 1 bệnh nhân đã từng nhập viện tại Hy

Lạp và Trung Quốc (Partridge, 2015)

Ngoài ra, sự có mặt đồng thời của KPC và các carbapenemase khác ở K

pneumoniae đã được ghi nhận thường xuyên trên toàn thế giới, bao gồm ở Italy

(KPC-3/VIM-2, KPC-2/VIM-1, KPC-2/VIM-24), Brazil (KPC-2/NDM-1), Trung Quốc (KPC-2/NDM-1, KPC-2/CMY-2 và KPC-2/IMP-4), Canada (KPC-3/CMY-

2) và Hy Lạp (KPC-2/VIM-1), đã cho thấy sự phổ biến trên toàn thế giới của K

pneumoniae có chứa 2 nhóm carbapenemase (Lee, 2016)

Khả năng kết hợp các gen ESBL của các chủng K pneumoniae sinh KPC

cũng góp phần làm giảm nhạy cảm đối với kháng sinh carbapenem Trong đó, kiểu hình CTX-M là kiểu hình ESBL phổ biến nhất trên toàn thế giới, tiếp đến là SHV

và sau cùng là TEM (Du, 2014)

1.3.3.2 Klebsiella pneumoniae sinh KPC kháng carbapenem tại Việt Nam

Tại Việt Nam, hiện các nghiên cứu tập trung vào xác định tỷ lệ nhiễm khuẩn

bệnh viện do vi khuẩn K pneumoniae gây ra và mức độ kháng kháng sinh của các

chủng phân lập được mà chưa có nhiều các nghiên cứu chuyên sâu về đặc tính phân tử của các chủng này

Báo cáo sử dụng kháng sinh và kháng kháng sinh tại 15 bệnh viện Việt Nam

năm 2008-2009 cho thấy tỷ lệ kháng kháng sinh của các chủng Klebsiella rất khác nhau giữa các bệnh viện (Báo cáo y tế, 2010) Các chủng Klebsiella giảm nhạy

cảm với một số loại kháng sinh nhất định như cephalosporin thế hệ 3, (ceftazidime), cotrimoxazole, ciprofloxacin và gentamicin Một số kháng sinh vẫn còn hiệu lực bao gồm carbapenem và beta lactamase phối hợp với chất ức chế beta

lactamase Tỷ lệ kháng của Klebsiella với imipenem thấp hơn 10%, trừ bệnh viện

Bệnh Phổi trung ương có tỷ lệ đáng nghi ngờ lên tới 53.6%

Theo nghiên cứu của Phạm Hùng Vân và nhóm nghiên cứu MIDAS trên 16

bệnh viện tại Việt Nam năm 2010, tỷ lệ các chủng K pneumoniae kháng IMP là

3,2%; MEM là 1,2%) (Phạm Hùng Vân, 2010)

Đến năm 2014, nghiên cứu của Phạm Thị Hoài An và cộng sự trên 35 chủng

K pneumoniae dương tính từ 680 mẫu bệnh phẩm tại Viện Pasteur thành phố Hồ

Chí Minh từ tháng 1-6/2014 thu được kết quả như sau: K pneumonia kháng cao

nhất với AM (94,29%), tiếp đó SXT (79,31%), CN, PIP (62,86%), CAZ (51,43%), chỉ một tỷ lệ nhỏ kháng lại CS, IMP, MEM (2,86%); 65,71% chủng sinh ESBL

và 20% chủng sản xuất carbapenemase (Phạm Thị Hoài An, 2014)

Kết quả nghiên cứu căn nguyên vi khuẩn gram âm đa kháng gây nhiễm khuẩn tiết niệu tại Bệnh viện Trung ương Quân đội 108 từ 2014 đến 2015 đã cho

thấy tỷ lệ các vi khuẩn kháng kháng sinh như sau: E coli đa kháng chiếm 46,1%, Klebsiella chiếm 19,7%, Pseudomonas chiếm 18,4%, Enterobacter là 6,6%, Morganella morganii là 3,9%, Acinetobacter và Proteus chiếm 2,9%

Klebsiella đa kháng kháng sinh có đề kháng cao với ciprofloxacin và norfloxacin

100%, kháng hết với các kháng sinh cephalosporin, piperacilin/tazobactam 93%, kháng cao với amikacin (60%) và gentamycin (80%), đề kháng với nhóm carbapenem tỷ lệ cao nhất (60%) trong ba loài vi khuẩn đa kháng gây nhiễm khuẩn (http://m.benhvien108.vn/khoakhambenh/TinBai/1167/Vi-khuan-gram-am-da-khang-khang-sinh-gay-nhiem-khuan-tiet-nieu-tai-Benh-vien-TUQD-108)

Mới đây nhất, nghiên cứu của Trần Nhật Phương và cộng sự trên các vi

khuẩn K pneumoniae kháng carbapenem mang gen blaKPC tại một số bệnh viện

trên địa bàn thành phố Hồ Chí Minh cho thấy các chủng K pneumoniae phân lập được mang gen blaKPC nhóm 2 và cũng kháng nhiều kháng sinh ở mức độ cao (Trần Nhật Phương, 2012) Nhóm nghiên cứu cũng phát hiện sự kết hợp giữa các

gen blaKPC và ESBL trên các chủng K pneumoniae Thêm vào đó, khả năng truyền plasmid mang gen blaKPC của các chủng K pneumoniae sang E coli J53 trong điều

kiện phòng thí nghiệm của các chủng phân lập được tại miền Nam Việt Nam cũng

đã được chứng minh trong nghiên cứu (Trần Nhật Phương, 2015)

1.3.4 Đặc tính phân tử của các chủng Klebsiella pneumoniae sinh KPC

Gene blaKPC đầu tiên được phân lập tại Bắc Carolina được đặt tên là KPC 1 (Yigit, 2001) Các biến thể sau này của KPC được đặt tên lần lượt theo thứ tự từ KPC-2 đến KPC-22 (Wang, 2014; Wang D, 2014; Lee, 2016) Tuy nhiên, một

nghiên cứu mới đã tìm ra sai sót trong việc giải trình tự của KPC-1 đã cho thấy KPC-1 và KPC-2 trên thực tế chỉ là một Do vậy, thuật ngữ KPC-1 đã không được

sử dụng nữa (Yigit H, 2008) Các bằng chứng thu được trong việc phân tích cây bao trùm tối thiểu cũng chỉ ra rằng KPC-2 là chủng ban đầu, sau đó tiến hóa tạo thành các biến thể KPC khác nhau Hiện tại, các biến thể KPC chỉ khác KPC-2 ở

2 nucleotid trong 4 codon (nucleotide 147, 308, 716 và 814) (Chen L, 2011) (hình 1.6)

Hình 1.6 6Sự khác nhau của các biến thể blaKPC

(Nguồn: ( Chen L, 2011)

Cây tiến hóa của các biến thể KPC cũng được thể hiện ở hình 1.7 trong nghiên cứu của Wang và cộng sự Thêm vào đó, sự thay đổi về mặt di truyền liên quan đến gen KPC là bền vững trong tự nhiên và ngày càng trở nên phổ biến do khả năng kháng kháng sinh thu được nhờ KPC giúp vi khuẩn thích ứng được với các áp lực chọn lọc của kháng sinh Trong hơn 20 biến thể khác nhau của gen

blaKPC (Girmenia, 2016), KPC-2 và KPC-3 là phổ biến nhất trong các mẫu bệnh phẩm lâm sàng và trong hầu hết các vụ dịch địa phương KPC-2 được xem là phổ

biến nhất trên toàn thế giới, với các vụ dịch không chỉ giới hạn trong phạm vi nước

Mỹ mà còn cả ở Châu Âu (đặc biệt là Hy Lạp) và Trung Quốc KPC-3 chủ yếu được phát hiện ở Mỹ, Mỹ La tinh và Israel

Hình 1.7 7 Cây tiến hóa của các biến thể blaKPC

(Nguồn: ( Wang, 2014)

Gen blaKPC của các chủng K pneumoniae đã được phát hiện trên nhiều loại

plasmid như IncF, IncI2, IncX, IncA/C, IncR, và ColE1 Tuy nhiên, dòng plasmid nổi trội là IncF với các đơn vị sao chép FIIK IncF thường chứa thêm một số gen

mã hóa đề kháng với các kháng sinh khác, bao gồm aminoglycosid, tetracycline, quinolone, trimethoprim và sulfonamide (Pitout, 2015)

Nhiều gen blaKPC nằm trên các gen nhảy, Tn4401, có kích thước khoảng 10

kb bao gồm 1 gen transposase, 1 gen resolvase, gen blaKPC và 2 trình tự chèn, ISKpn6 và ISKpn7 (hình 1.8) Gen nhảy này đã chuyển vị lên rất nhiều plasmid

tiếp hợp Tn4401 có 5 đồng vị khác nhau bởi mất đoạn base (68-255 bp) ngay vùng ngược hướng (upstream) của gen blaKPC Đáng chú ý, trong nhiều trường

hợp, các đồng phân Tn4401 khác nhau liên kết với plasmid khác nhau mang gen