XÁC ĐỊNH PHẢ HỆ PHÂN TỬ CỦA MỘT SỐ LOÀI RUỒI ĐỤC QUẢ (Bactrocera spp.) Ở MIỀN NAM VIỆT NAM BẰNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP XÁC ĐỊNH PHẢ HỆ PHÂN TỬ CỦA MỘT SỐ LOÀI RUỒI ĐỤC QUẢ (Bactrocera spp.) Ở MIỀN NAM VIỆT NAM BẰNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực : ĐÀNG NGUYÊN LƯU VI VY Niên khóa : 2006 – 2010 Tháng 07 năm 2010 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC XÁC ĐỊNH PHẢ HỆ PHÂN TỬ CỦA MỘT SỐ LOÀI RUỒI ĐỤC QUẢ (Bactrocera spp.) Ở MIỀN NAM VIỆT NAM BẰNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực TS NGUYỄN HỮU ĐẠT ĐÀNG NGUYÊN LƯU VI VY KS NGUYỄN VĂN LẪM Tháng 07 năm 2010 LỜI CẢM ƠN Người sinh cha mẹ, người nuôi dưỡng khôn lớn cha mẹ, trưởng thành hôm không thiếu bóng dáng cha mẹ, xin ghi nhớ công lao to lớn trời biển cha mẹ Nguồn kiến thức bao la rộng lớn giúp ta hiểu được, nhờ quan tâm, lo lắng khơng chút ngần ngại ban giám hiệu tập thể thầy cô trường đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh nói chung thầy mơn cơng nghệ sinh học nói riêng Cảm ơn thầy, người cho em kiến thức, cho em tảng vững để bước vào đời Em xin trân trọng cảm ơn thầy Nguyễn Hữu Đạt hết lòng hướng dẫn tạo điều kiện thuận lợi cho em suốt trình thực đề tài tốt nghiệp Đề tài em hơm thành cơng nhờ đóng góp to lớn anh Lẫm người ln dìu dắt, giúp đỡ em vượt qua khó khăn Chị Hiền trực tiếp nêu hướng mới, đúng, sai, thúc đẩy em hồn thành cơng việc thời gian Em xin chân thành cảm ơn anh Châu, chị Oanh, chị Thư anh chị trung tâm tạo điều kiện cho em hồn thành tốt khóa luận Bạn bè bên em, học tập vui chơi, cổ vũ động viên em Cảm ơn tất bạn, bạn thật tốt, thật vui, thật may mắn có bạn bạn, tập thể lớp DH06SH i TÓM TẮT Ruồi đục đối tượng gây hại nguy hiểm hàng đầu tất vùng trồng rau ăn nước ta, đối tượng kiểm dịch khắt khe tất nước nhập rau tươi Cơ sở liệu ruồi đục nhà khoa học tiếp tục nghiên cứu xây dựng hoàn thiện Việc xây dựng phả hệ phân tử giống Bactrocera có ý nghĩa quan trọng xác định giống lồi ruồi từ có biện pháp hữu hiệu để phòng chóng ngăn ngừa tác hại chúng Chính việc xây dựng phả hệ phân tử Bactrocera vô cấp thiết cho mục đích kiểm dịch nhu cầu bảo vệ ăn nhân dân Nghiên cứu thực dựa vào khuếch đại trình tự gen 16S cytochrome oxydase II + tRNALys + tRNAAsp DNA ty thể Sau sản phẩm PCR giải trình tự tiến hành tham chiếu sơ liệu gen bank để xây dựng phả hệ phân tử giúp xác định loài Kết nghiên cứu thu thập ruồi thuộc hệ F1, 10 thuộc hệ F3, 10 thuộc hệ F4 loài Bactrocera carambolea chủng phòng thí nghiệm 10 mẫu thuộc lồi Bactrocera dorsalis Tối ưu hóa quy trình ly trích DNA từ phận ruồi đục Xây dựng thành cơng quy trình PCR phù hợp cho ruồi đục cặp primer 16S cặp primer C2KD Hoàn thành phả hệ phân tử loài ruồi đục xét nghiên cứu ii SUMMARY "Determinating some species’s molecular genealogy of fruit flies (Bactrocera spp.) in South VietNam by molecular biological technology" thesis is carried out by Dang Nguyen Luu Vi Vy, Nong Lam University, from February 2010 to June 2010 at the Quaranting plants after importing center Fruit flies are one of the dangerous insects which damage all the vegetables and fruits in our country, are quarantined strictly in imported fresh fruits and vegetables countries Databases which concern about the fruit fly are still researched and perfected The construction of molecular genealogy Bactrocera is very important in determining species of fruit fly This thing results in finding measures for combatting and preventing their harmful effects; therefore, the construction of Bactrocera molecular genealogy is necessary thing for quarantined and protected purposes The research was done base on the 16S gene sequence amplification and cytochrome oxydase II + + tRNAAsp tRNALys on mitochondrial DNA Then PCR products were sequenced and then proceed on the reference database in gene bank As the result to build molecular genealogy for identifing species Researched results are obtained in flies in F1 generation and 10 flies in F3 generation, 10 flies in F4 generation of Bactrocera carambolea species, all they were domesticed in the laboratory and 10 nondomesticed flies of Bactrocera dorsalis species Optimizing the extracting DNA from parts of the fruit flies, then building suitable PCR process which uses 16S primer pairs and C2KD primer pairs The basic molecular genealogy of two fruit fly species using in the research was completed Keywords: Bactrocera carambolea, Bactrocera dorsalis, mitochondrial DNA, fruit fly, gene 16SrRNA, gene cytochrome oxidase II iii MỤC LỤC Lời cảm ơn i Tóm tắt .ii Mục lục iii Danh sách chữ viết tắt iv Danh sách bảng v Danh sách hình vi Chương MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Yêu cầu .2 1.3 Nội dung thực Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan ruồi đục 2.2 Ruồi đục Bactrocera 2.2.1 Phân loại 2.2.2 Lịch sử phát triển 2.2.2.1 Bactrocera carambolea 2.2.2.2 Bactrocera dorsalis 2.2.3 Các nghiên cứu nước 10 2.2.3.1 Nghiên cứu nước 10 2.2.3.2 Nghiên cứu nước 11 2.2.4 Một số phương pháp nghiên cứu ruồi đục 13 2.2.4.1 Dựa vào đặc điểm hình thái .13 2.2.4.2 Dựa vào kỹ thuật sinh học phân tử 13 2.2.4.3 Phương pháp khác 14 2.3 Tổng quan DNA ty thể .15 2.3.1 DNA ti thể 15 2.3.2 Gen 16S rRNA 17 2.3.3 Cytochrome oxidase II (COII) 18 2.4 Quá trình thực phản ứng PCR .19 iv 2.4.1 Định nghĩa PCR 19 2.4.2 Thành phần phản ứng PCR .20 2.4.3 Nguyên tắc phản ứng PCR 20 2.5 Phương pháp xây dựng phả hệ phân tử 21 2.5.1 Khái niệm 21 2.5.2 Một số loại phả hệ 21 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 3.1 Thời gian địa điểm 22 3.2 Đối tượng thí nghiệm 22 3.3 Vật liệu hoá chất 22 3.3.1 Thiết bị 22 3.3.2 Dụng cụ 22 3.3.3 Hóa chất 22 3.4 Phương pháp nghiên cứu 23 3.4.1 Phương pháp lấy mẫu 23 3.4.2 Phương pháp ly trích DNA 23 3.5 Trình tự cặp mồi phản ứng 24 3.6 Điện di sản phẩm PCR 26 3.7 Giải trình tự phân tích số liệu 27 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29 4.1 Kết ly trích 29 4.2 Kết chạy PCR 30 4.2.1 Sử dụng primer 16S 31 4.2.2 Sử dụng primer cytochrome oxidase II 32 4.3 Kết so sánh chuỗi trình tự cá thể 32 4.3.1 Kết so sánh chuỗi trình tự vùng CoII mẫu I2 C1 32 4.3.2 Kết so sánh chuỗi trình tự vùng CoII mẫu K1 F8 32 4.3.3 Kết so sánh chuỗi trình tự vùng 16S mẫu I3 G9 33 4.3.4 Kết so sánh chuỗi trình tự vùng 16S mẫu K1 A1 33 4.4 Kết phân nhóm tạo phả hệ di truyền 34 v 4.4.1 Kết phân nhóm dựa vào trình tự vùng 16S 34 4.4.2 Kết phân nhóm dựa vào trình tự vùng CoII 36 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 37 5.1 Kết luận 37 5.2 Đề nghị 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO 39 PHỤ LỤC vi DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT bp Base pair DNA Deoxyribonucleic acid dNTP Deoxynucleotide triphosphate EDTA Ethylene diaminetetra acetic acid EtBt Ethidium bromide OD Optical density PCR Polymerase chain reaction RNA Ribonucleic acid Rnase Ribonuclease UV Ultra Violet TE Tris EDTA TAE Tris Glacial Acetic Acid EDTA mtDNA Mitochondrial DNA rRNA Ribosomal Ribonucleotide acid UI Unit Ctv Cộng tác viên AK Attact and Kill vii DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 3.1 Trình tự vùng khuếch đại primer (Simon ctv, 1994) 24 Bảng 3.2 Nồng độ thành phần phản ứng PCR sử dụng hóa chất 24 Bảng 3.3 Nồng độ thành phần phản ứng PCR sử dụng hóa chất 25 Bảng 3.4 Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR 25 Bảng 3.5 Trình tự vùng khuếch đại primer (Simon ctv, 1994) 25 Bảng 3.6 Nồng độ thành phần phản ứng PCR sử dụng hóa chất 26 Bảng 3.7 Nồng độ thành phần phản ứng PCR sử dụng hóa chất 26 Bảng 3.8 Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR 27 Bảng 4.1 Tỉ lệ ly trích DNA thành cơng ruồi đục B dorsalis B carambolea 30 viii Hai mẫu ruồi B carambolea thu Thị xã Bà Rịa (A5) Đồng Tháp (G1) nằm chung nhóm, điều cho thấy khơng có khác biệt điều kiện ngoại cảnh việc phân nhóm di truyền (I) (II.1) (II) (II.2) (III) Hình 4.6 Sơ đồ phân nhóm di truyền dòng B carambolea B dorsalis vùng 16S rDNA 35 4.4.2 Kết xây dựng phả hệ dựa vào trình tự vùng cytochrome oxidase II Với liệu thu trình tự vùng gen ti thể cytochrome oxidase II loài B carambolea B dorsalis Chúng tơi tiến hành so sánh trình tự với phần mềm Clustal X 1.83, kết đọc phần mềm TreeView 1.6.6, từ phân nhóm xác định mối quan hệ di truyền chúng (hình 4.7) Kết cho thấy, chúng phân thành nhóm chính, mẫu K1(B dorsalis) có mối quan hệ di truyền với mẫu E3 (B carambolea) Còn mẫu I2 (B dorsalis) có khác biệt di truyền so với K1 vùng COII (cytochrome oxidase II), điều cho thấy thông tin di truyền ruồi đực ruồi có khác biệt Việc so sánh dựa vào trình tự vùng cytochrome oxidase II cho thấy tất dòng ruồi thuộc hệ F3 nằm chung nhóm, biểu chứng tỏ tính tương đồng cao ruồi F3 mặt di truyền, khẳng định tính ứng dụng rộng rãi hệ nghiên cứu sau phương diện di truyền Kết phân nhóm vùng gen ti thể 16S cytochrome oxidase II cho ta kết hữu ích cho việc xây dựng phả hệ phân tử giống Bactrocera Kết vùng có tác động hỗ trợ, bổ sung giúp xác định giống lồi xác Hình 4.7 Sơ đồ phân nhóm di truyền dòng B carambolea B dorsalis vùng coII 36 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Từ kết thu được, rút số kết luận sau Đã tối ưu hóa thành cơng quy trình ly trích DNA ruồi đục Bactrocera camrambolea ruồi Bactrocera dorsalis Trong tất phận dùng để ly trích đầu ruồi phận dễ ly trích nhất, lượng DNA mẫu thu tốt Thiết lập hồn thiện quy trình nhiệt cho phản ứng khuyếch đại vùng gen DNA ti thể cytochrome oxidase II 16S cặp primer COIIF/COIIR 16SF/16SR Xác định tên lồi xác 13 ruồi khảo sát thí nghiệm, kết phù hợp với kết định danh loài ruồi Thiết lập mối quan hệ di truyền hệ loài Mối quan hệ di truyền lồi bền vững, khơng phụ thuộc vào phân bố sinh thái, địa lý, đối tượng lấy mẫu phù hợp với mối quan hệ hình thái Tạo nguồn liệu trình tự vùng cytochrome oxidase vùng 16S hệ thuộc lồi Bactrocera Dữ liệu đóng góp vào nguồn gen, hổ trợ cho cơng tác định danh, phân nhóm, trao đổi thơng tin di truyền nghiên cứu đa dạng di truyền dòng Bactrocera Việt Nam với liệu chúng vùng sinh thái, địa lý khác giới Kết việc kiểm tra, so sánh có kết hợp vùng gen DNA ti thể hữu ích để tạo nên phát sinh loài giúp cho việc phân loại loài thuộc giống Bactrocera Một vài số liệu phân tích cách sử dụng phương pháp miêu tả theo nhánh Nghiên cứu chúng tơi góp phần giải phần tồn đọng phân loại, tiến hóa vấn đề liên quan đến Bactrocera sử dụng liệu trình tự DNA Rõ ràng, nhiều đơn vị phân loại cần phải phân tích, nhiều liệu hơn, đặc biệt từ gen để có đủ thơng tin giải số khó khăn nội 37 5.2 Đề nghị Tăng số dòng, số lồi số mẫu nghiên cứu có loài, hệ loài Bactrocera carambolea 22 mẫu nghiên cứu Trong loài sử dụng đề tài có lồi có nguồn gốc xác định xác nên khơng thể nhận xét quan hệ di truyền loài hay hệ Số lượng mẫu 22 lấy 13 ruồi, khơng thể phân biệt chúng diện rộng Mở rộng khu vực khảo sát mẫu để đảm bảo tính xác phân biệt lồi với 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Nguyễn Thị Chắt Huỳnh Trí Đức 2004 Một số đặc điểm hình thái sinh học kí chủ ruồi đục Bactrocera correcta (Bezz) địa bàn số tỉnh phía nam năm 2001 – 2002 Khoa Nơng Học, Đại học Nơng Lâm Thành phố Hồ Chí Minh Tạp chí KHKT Nơng Lâm Nghiệp số 3/2004 Nguyễn Hữu Đạt Nguyễn Văn Tuất 2007 Kết sử dụng nóng xử lý ruồi đục Bactrocera dorsalis (Hendel) hại xoài sau thu hoach Chi cục kiểm dịch thực vật Thành phố Hồ Chí Minh Đào thị Ngọc Hiền 2009 Xác định phả hệ phân tử ruồi đục Bactrocera spp số tỉnh miền Nam Việt Nam kĩ thuật sinh học phân tử Luận văn tốt nghiệp kĩ sư Công nghệ sinh học, trường Đại học Nơng Lâm Thành phố Hồ Chí Minh Tài liệu nước Agricultural Experiment Station, Paramaribo, Suriname 1990 Anthony R Clarke at el 2005 Invasive Phytophagous Pests Arising Through a Recent Tropical Evolutionary Raditation: the bactrocera dorsalis complex of fruit flies Baimai at el 1999 Cytological evidence for a complex of species within the taxon Bactrocera tau (Diptera: Tephritidae) in Thailand Chandrasekhar 2002 How to write a thesis: A working guide The University of Western Australia, Australia Tock H Chua, Yi Vern Chong and Saw Hoon Lim 1998 Determination Malaysian Bactrocera pests using PCR-RFLP analyses (Diptera: Tephritidae) Drew and Hancock 1994 The Bactrocera dorsalis complex of fruit flies (Diptera: Tephritidae: Dacinae) in Asia, Bulletin of entomological research supplement 10 Drew and Raghu 2002 The fruit fly fauna (Diptera: Tephritidae: Dacinae) of the rainforest habitat of the Western Ghats, India 11 Drew and Hancock 1954 Bactrocera carambolae (Diptera: Tephritidae) in Suriname, South America Host Plants of the Carambolea Fruit Fly Alies Van and Sauers Muller 12 Takao Ebina and Kenji Ohto 2006 Morphological characters and PCR-RFLP markers in the interspecific Hybrids between Bactrocera carambolae and B Papayae of the B dorsalis species complex (Diptera: Tephritidae) 13 Francesco Frati, Chris Simon, Jack Sullivan and David L Swofford Evolution of the Mitochondrial Cytochrome Oxidase II Gene in Collembola 14 Hanife Genc and James L Nation 2008 Survival and development of Bactrocera oleae Gmelin (Diptera:Tephritidae) immature stages at four temperatures in the laboratory 15 Ho-Yeon Han Kyung-EuiRo 2006 Molecular Phylogeny of the Subfamily Tephritinae (Diptera: Tephritidae) Based on Mitochondrial 16S rDNA Sequences 16 Michael Jay Katz 2009 From Research to Manuscript: A guide to scientific writing Case Western Reserve University Cleveland OH, USA 39 17 Margaret L Margosian, USDA-APHIS-PPQ-CPHST-STT, Manhattan, KS Christie A Bertone, Daniel M Borchert, Yu Takeuchi, USDA-APHIS-PPQCPHST-PERAL, Raleigh, NC Identification of Areas Susceptible to the Establishment of Fifty-three Bactrocera spp (Diptera: Tephrididae: Dacinae) in the United States 18 Malavasi, Midgarden, Sauers-Muller van A 1998 Operations manual 19 Nakahara and Masahiko MURAJI 2002 PCR-RFLP Analysis of Bactrocera dorsalis (Tephritidae: Diptera) Complex Species Collected in and Around the Ryukyu Islands of Japan Using the Mitochondrial A-T Rich Control Region 20 Ann Caviani Peasat at el 1994 Light-generated oligonucleotide arrays for rapid DNA sequence analysis 21 Smith, Srini Kambhampati and Karen A Armstrong 2003 Phylogenetic relationships among Bactrocera species (Diptera: Tephritidae) inferred from mitochondrial DNA sequences 22 Sunnucks and Dinah F Hales Numerous Transposed Sequences of Mitochondrial Cytochrome Oxidase I-II in Aphids of the Genus Sitobion (Hemiptera: Aphididae) School of Biological Sciences, Macquarie University, Sydney 23 Saurs-Muller 2005 Identification of Areas Susceptible to the Establishment of Fifty-three Bactrocera spp (Diptera: Tephrididae: Dacinae) in the United States 24 Suk-Ling Wee and Keng-Hong Tan 2000 Sexual maturity and intraspecific mating success of two sibling species of the Bactrocera dorsalis complex Entomologia Experimentalis et Applicata 94, pp: 133–139 Tài liệu internet 1991 25 Okinawa Oriental Fruit Fly Wiped Out of Japan http://entomology.ifas.ufl.edu/creatures/fruit/tropical/oriental_fruit_fly.htm 26 TP Việt Báo Hoàn chỉnh kĩ thuật giải trình tự gen 2004 http://vietbao.vn/Khoa-hoc/Truong-DH-Y-Ha-Noi-Hoan-chinh-ky-thuat-giaitrinh-tu-gene/40044544/188/ 27 Agricultural research service http://www.ars.usda.gov/is/ar/archive/may07/flies0507.htm?pf=1 40 PHỤ LỤC Phụ lục Bảng kí hiệu mẫu gửi giải trình tự STT 5 11 12 13 14 15 16 17 Kí hiệu mẫu C1 D2 E1 E3 E5 F6 F7 F8 G7 G9 H2 H7 I2 I3 K1 Tên mẫu Bactrocera carambolea Bactrocera carambolea Bactrocera carambolea Bactrocera carambolea Bactrocera carambolea Bactrocera carambolea Bactrocera carambolea Bactrocera carambolea Bactrocera carambolea Bactrocera carambolea Bactrocera carambolea Bactrocera carambolea Bactrocera dorsalis Bactrocera dorsalis Bactrocera dorsalis Phụ lục Kết giải trình tự mẫu Kết đọc trình tự dạng peak mẫu C1 sử dụng primer 16S Kết đọc trình tự dạng peak mẫu E3 sử dụng primer 16S Thế hệ F1 F1 F3 F3 F3 F3 F3 F3 F4 F4 F4 F4 ngẫu nhiên ngẫu nhiên ngẫu nhiên Kết đọc trình tự dạng peak mẫu E5 sử dụng primer 16S Kết đọc trình tự dạng peak mẫu F6 sử dụng primer 16S Kết đọc trình tự dạng peak mẫu F7 sử dụng primer 16S Kết đọc trình tự dạng peak mẫu G7 sử dụng primer 16S Kết đọc trình tự dạng peak mẫu G9 sử dụng primer 16S Kết đọc trình tự dạng peak mẫu H2 sử dụng primer 16S Kết đọc trình tự dạng peak mẫu H7 sử dụng primer 16S Kết đọc trình tự dạng peak mẫu I3 sử dụng primer 16S Kết đọc trình tự dạng peak mẫu K1 sử dụng primer 16S Kết đọc trình tự dạng peak mẫu C1 sử dụng primer COII Kết đọc trình tự dạng peak mẫu D2 sử dụng primer COII Kết đọc trình tự dạng peak mẫu E1 sử dụng primer COII Kết đọc trình tự dạng peak mẫu E5 sử dụng primer COII Kết đọc trình tự dạng peak mẫu F6 sử dụng primer COII Kết đọc trình tự dạng peak mẫu F8 sử dụng primer COII Kết đọc trình tự dạng peak mẫu G9 sử dụng primer COII Kết đọc trình tự dạng peak mẫu H2 sử dụng primer COII Kết đọc trình tự dạng peak mẫu I2 sử dụng primer COII Kết đọc trình tự dạng peak mẫu K1 sử dụng primer COII ... molecular genealogy of fruit flies (Bactrocera spp.) in South VietNam by molecular biological technology" thesis is carried out by Dang Nguyen Luu Vi Vy, Nong Lam University, from February 2010 to June... polymerase, phải liên tục lưu ý suốt q trình PCR Sau đó, quy trình gốc phát triển cách dùng DNA Polymerase lấy từ vi khuẩn thermophilic (ưa nhiệt) sống mạch nước phun nhiệt độ 110°C DNA polymerase... cần phải thêm DNA polymerase vào chu kỳ, q trình chép DNA đơn giản tự động Một DNA polymerase chịu nhiệt phân lập từ loài vi khuẩn sống nước có khả chịu nhiệt gọi Taq Taq polymerase dùng rộng