PHÁT HIỆN PHYTOPLASMA GÂY BỆNH TRÊN CÂY SẮN (Manihot esculenta Crantz) BẰNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÁT HIỆN PHYTOPLASMA GÂY BỆNH TRÊN CÂY SẮN (Manihot esculenta Crantz) BẰNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực : TRỊNH XUÂN THẢO Niên khóa : 2006 - 2010 Tháng 07/2010 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÁT HIỆN PHYTOPLASMA GÂY BỆNH TRÊN CÂY SẮN (Manihot esculenta Crantz) BẰNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ Hướng dẫn khoa học: Sinh viên thực hiện: ThS HUỲNH KIM HƯNG TRỊNH XUÂN THẢO Tp Hồ Chí Minh, Tháng 07/2010 LỜI CẢM ƠN Thành kính khắc ghi cơng ơn Cha Mẹ sinh thành dưỡng dục có ngày hơm Để hồn thành luận văn này, lời xin chân thành cám ơn sâu sắc đến cô HUỲNH KIM HƯNG, Viện Công nghệ Sinh học Công nghệ Môi trường, trường Đại học Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh Người tận tình dạy bảo, hướng dẫn giúp đỡ tơi hồn thành luận văn Xin chân thành cám ơn: ™ Ban Giám hiệu Trường Đại học Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh ™ Ban Chủ nhiệm Bộ môn Công nghệ Sinh học, Quý thầy (cô) Bộ môn Công nghệ Sinh học trường truyền đạt cho kiến thức quý báu thời gian học tập trường ™ Anh Nguyễn Minh Nam, anh Nguyễn Văn Lẫm, anh chị bạn làm đề tài Viện Công nghệ Sinh học Công nghệ Môi trường người tận tình giúp đỡ động viên thời gian làm đề tài ™ Viện Công nghệ Sinh học Công nghệ Môi trường, Đại học Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh tạo điều kiện thuận lợi cho suốt thời gian thực tập vừa qua Cuối xin cảm ơn tất bạn lớp DH06SH bạn bè gần xa động viên giúp đỡ trình thực đề tài Tp Hồ Chí Minh, tháng 07/2010 Trịnh Xuân Thảo i TÓM TẮT Hiện nay, nước ta, sắn bị loại tác nhân lạ gây bệnh, làm hư hại hàng ngàn hecta, làm giảm suất chất lượng sắn Cây sắn bị bệnh có triệu chứng tăng nhanh số lượng chồi nách gây tượng chổi phù thủy, kéo dài khác thường gióng làm cho chồi mảnh khảnh, khơng phát triển bình thường (hoa nhỏ, gióng bị rút ngắn lại), bạc màu mọc nhiều chồi, cuộn lại khum hình chén, xuất cụm chồi cuối thân xuất suy giảm thông thường (bị còi cọc, chết chồi, vàng trái mùa, hồng hồng đỏ mặt lá) v.v Tác nhân gây bệnh cho phytopasma Chúng tiến hành xây dựng quy trình phản ứng PCR phát phytoplasma gây bệnh sắn, từ có biện pháp để phòng bệnh ngăn chặn thiệt hại mầm bệnh gây Thành phần phản ứng chu trình nhiệt sau: + Thành phần phản ứng bao gồm: mM MgCl2; 200 µM loại dNTP (dATP, dCTP, dTTP, dGTP); 2,5 U đơn vị Taq polymerase; dung dịch đệm cho phản ứng PCR 1X; 25 pmol loại mồi (P1, P7, R16F2n, R16R2); 20 ng DNA, nước khử ion cho đủ thể tích 50 µl + Chu trình nhiệt: biến tính DNA khn 94oC phút; thực 38 chu kỳ chu kỳ gồm bước: biến tính 94oC phút, gắn mồi 55oC phút, kéo dài chuỗi 72oC phút; phản ứng kết thúc 72oC phút ủ mẫu 4oC Với thành phần phản ứng chu trình nhiệt trên, nhìn chung quy trình ổn định, phát phytoplasma gây bệnh sắn với sản phẩm đoạn DNA có kích thước tương đương 1,2 kb ii SUMMARY Topic: “Detecting Phytoplasma caused disease on cassava (Manihot esculenta Crantz) by molecular technologies” Cassava have currently been affected by an strange agent, making thousand of hectare of Cassava decay, reducing the cassava productivity and quality The symptoms in diseased cassava are such as the proliferation axillary shoots resulting in a witches’-broom appearance, abnormal elongations of interodes resulting in slender shoots, generalized stunting (small flowers and leaves and shortened internodes), discolouration of leaves or shoots, leaf curling or cupping, bunchy appearance of growth of the ends of the stems and generalized decline (stunting, dieback of shoots and unseasonal yellowing, pinkish or reddening of the leaves) v.v Phytoplasma is believed to be agent causing the disease We build Polymerase Chain Reaction procedue detecting phytoplasma which cause disease on Cassava so that we offer preventive methods PCR component and cycling condition as follow: + PCR condition: PCR was performed in a volume of 50 µl using 20 ng of DNA, 25 pmoles of each primer, 1X PCR buffer, 200 µM of each of the four deoxynucleotide triphosphates (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) and 2,5 units of Taq polymerase + PCR cycling condition: denaturation at 94oC for min; followed by 38 cycles at 94oC for min, 55oC for min, 72oC for min, and one additional extension run at 72oC for With PCR component and cycling condition above, the process is stable in general, enable to dectect phytoplasma causing disease on Cassava with product is DNA fragment size equal to 1,2 kb Keywords: phytoplasma, disease, Cassava, PCR iii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i TÓM TẮT ii SUMMARY iii MỤC LỤC iv DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT vii DANH SÁCH CÁC HÌNH .ix DANH SÁCH CÁC BẢNG ix Chương MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích yêu cầu 1.2.1 Mục đích 1.2.2 Yêu cầu Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Sắn 2.1.1 Phân loại 2.1.2 Đặc điểm thực vật 2.1.3 Nguồn gốc 2.1.4 Vùng phân bố lịch sử phát triển 2.1.5.1 Sản xuất tiêu thụ sắn giới 2.1.5.2 Sản xuất tiêu thụ sắn Việt Nam 2.1.6 Vị trí kinh tế sắn 2.1.6.1 Giá trị sử dụng 2.1.6.2 Thành phần dinh dưỡng 2.1.6.3 Lợi ích nghề sắn 2.1.6.4 Nhược điểm nghề sắn 2.1.6.5 Giải pháp phát triển sắn bền vững 2.1.7 Một số bệnh thường gặp sắn 2.1.7.1 Bệnh vết nâu sắn (Mycosphaerella manihotis (sid.) Sacc) 2.1.7.2 Bệnh vết loét đen cành (Glomerella manihotis Chevals) 2.1.7.3 Bệnh chấm trắng (Corynespora manihotis (Stev.et Solh) Solh) iv 2.1.7.4 Bệnh thối rễ (Phaeolus manihotis Heim) 2.1.7.5 Bệnh gỉ sắt (Uromices manihotis Henn) 10 2.1.7.6 Bệnh khảm phổ biến (virus) 10 2.1.7.7 Bệnh bướu rễ (tuyến trùng Meloidogyne sp.) 10 2.1.7.8 Bệnh thối củ sau thu hoạch (nấm Mucor mucedo Rhizopus nigricans) 10 2.1.7.9 Bệnh thán thư (nấm Colletotricum gloeosporiodes) 11 2.1.7.10 Bệnh phytoplasma .11 2.2 Kỹ thuật PCR 11 2.2.1 Giới thiệu sơ lược PCR 11 2.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến kết phản ứng PCR 13 2.2.3 Các thành phần khác phản ứng PCR 14 2.2.4 Số lượng chu kỳ phản ứng 14 2.2.5 Thiết bị dụng cụ cho phản ứng .15 2.2.6 Các ứng dụng phương pháp PCR 15 2.2.7 Những hạn chế phương pháp PCR .18 2.2.8 Các sai sót gây Taq polymerase 19 2.2.9 Kỹ thuật nested PCR 20 2.3 Phytoplasma bệnh chổi rồng sắn 20 2.3.1 Bệnh chổi rồng phytoplasma (witches’ broom) .20 2.3.2 Phytoplasma 21 2.3.2.1 Phân loại 21 2.3.2.2 Triệu chứng bệnh 22 2.3.2.3 Sự truyền lan rộng bệnh phytoplasma 22 2.3.2.4 Hình thái siêu cấu trúc 22 2.3.2.5 Tần số phân bố phytoplasma .23 2.3.5.6 Ảnh hưởng phytoplasma tới phát triển kinh tế 23 2.3.2.7 Các kỹ thuật phát phytoplasma .24 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 3.1 Thời gian địa điểm tiến hành thí nghiệm 25 3.2 Nội dung nghiên cứu 25 3.2.1 Ly trích DNA từ mẫu sắn 25 3.2.2 Xây dựng phản ứng nested PCR phát phytoplasma 25 v 3.3 Vật liệu hóa chất 25 3.3.1 Vật liệu 25 3.3.2 Cặp mồi sử dụng 26 3.3.3.1 Hóa chất ly trích DNA, điện di kít ly trích tế bào thực vật 26 3.3.3.2 Hóa chất PCR 26 3.3.4 Thiết bị dụng cụ 27 3.4 Phương pháp tiến hành 27 3.4.1 Quy trình ly trích DNA 27 3.4.2 Phản ứng PCR .28 3.4.2.1 Phản ứng PCR với cặp mồi P1 P7 .28 3.4.2.2 Phản ứng PCR với cặp mồi R16F2n R16R2 .28 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30 4.1 Mẫu sắn thu thập huyện Vĩnh Cửu, Đồng Nai 30 4.2 Kết ly trích DNA từ sắn .30 4.3 Kết phản ứng PCR 31 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 32 5.1 Kết luận 32 5.2 Đề nghị 32 TÀI LIỆU THAM KHẢO .33 vi DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT µg : Micro gam µM : Micro mol/lít µm : Micrometer BVTV : Bảo vệ thực vật cDNA : complementary DNA CIAT : Concurrent Information Access Technologies cm : Centimeter Ctv : Cộng tác viên DNA : deoxyribonucleic acid dNTP : Deoxyribonucleotide – 5- triphosphate dTTP : Thymidine triphosphate EF - Tu (Tuf) : Elongation factor Tu (tuf gene) FAO : Food and Agriculture Organization : Hecta HCN : Hidro xianua IFPRI : The International Food Policy Research Institute Kb : Kilo base Kg : Kilogam m : mete mm : Milimeter nm : Nano meter nPCR : Nested PCR ng : Nano gam PCR : Polymerase Chain Reaction pm : Picro mole rDNA : Ribosomal DNA RNA : ribonucleic acid rRNA : Ribosomal RNA TBE : Tris Borate EDTA vii Tm : Melting temperature TTTA : Ted Tokio Tanaka Architects THR : Thyroid Hormone Redeptor U : Unit UV : Ultra violet viii nhiều sản phẩm khuếch đại từ nhiều thao tác riêng biệt, so sánh trước đến trình tự thức (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998) 2.2.9 Kỹ thuật nested PCR Kỹ thuật nested PCR kỹ thuật phát triển nhằm mục đích gia tăng độ nhạy độ đặc hiệu phản ứng PCR Kỹ thuật nested PCR gia tăng độ nhạy phản ứng nhờ tổng số chu nhiều Nested PCR sử dụng cặp mồi thay cặp mồi kỹ thuật PCR cổ điển, cặp mồi thứ hai nằm cặp mồi thứ Mặc dù sử dụng cặp mồi kỹ thuật nested PCR để nhằm khuếch đại đặc hiệu đoạn gene Kỹ thuật gọi kỹ thuật PCR bước Lần đầu, phản ứng PCR thực 15 đến 30 chu kỳ, với cặp mồi thứ Cặp mồi thứ nhất, lần chạy PCR thứ nhất, cho phép khuếch đại đoạn gene dài đoạn gene cần xác định đoạn gene cần xác định nằm đoạn gene khuếch đại lần Sản phẩm PCR lần 1, sau làm khn mẫu cho PCR lần Cặp mồi thứ hai bắt cặp phía (nested) sản phẩm PCR lần Phản ứng PCR lần sau khuếch đại đoạn gene cần xác định Kỹ thuật nested PCR có nhiều đoạn sản phẩm DNA kỹ thuật PCR cổ điển, số đoạn DNA phát nói lên tính định lượng tương đối phản ứng Độ đặc hiệu phản ứng nPCR gia tăng bắt cặp cặp mồi thứ hai xảy chủ yếu với đoạn gene nhân lên phản ứng PCR thứ Nhược điểm lớn nPCR gia tăng mức tạp nhiễm trình chuyển mẫu lần chạy PCR 2.3 Phytoplasma bệnh chổi rồng sắn 2.3.1 Bệnh chổi rồng phytoplasma (witches’ broom) Bệnh “chổi rồng” sắn loại bệnh xuất nước ta nguy hiểm tốc độ lây lan nhanh, mức độ gây hại trầm trọng, hiểu biết bệnh lý học, côn trùng môi giới truyền bệnh chưa nhiều Theo kết điều tra quan chuyên môn, nước ta bệnh xuất rải rác từ năm 2005 đến 2009, bệnh lây lan nhanh nhiều tỉnh gây thiệt hại nặng cho ngành sắn nước ta Nguồn bệnh lây lan đồng ruộng thông qua hom giống rầy môi giới Phytoplasma gây bệnh "chổi rồng" sắn ghi nhận gây hại phổ biến Thái Lan 20 Về triệu chứng, sắn bị bệnh giai đoạn trước thu hoạch mọc nhiều chồi chồi thân Cây bị nặng nhỏ lại thô cứng, đốt thân ngắn lại, thân củ phần tiếp giáp với vỏ chuyển màu thâm đen, chồi bị chết khô Cây sắn bị bệnh sớm thường không cho thu hoạch, bị bệnh muộn thường giảm 10 – 20 %, suất giảm 20 - 30 % hàm lượng tinh bột (theo báo Nông nghiệp - 14/7/2009) 2.3.2 Phytoplasma 2.3.2.1 Phân loại (nguồn www.vi.wikipedia.org/wiki/phytoplasma ) Phytoplasma thuộc: Vực (domain): Bacteria Ngành (divisio): Firmicutes Lớp (class): Mollicutes Bộ (ordo): Acholeplasmatales Họ (familia): Acholeplasmataceae Chi (genus): Candidatus Phytoplasma Các nhà khoa học Nhật Bản người mô tả phytoplasma bệnh thực vật “MLOs” (mycoplasma like organisms) gây bệnh vàng thực vật năm 1967 (Doi ctv, 1967) Phytoplasma vi khuẩn thiếu vách tế bào tìm thấy mạch libe Bệnh phytoplasma lan rộng côn trùng hút nhựa ve sầu nhảy thân Việc xác định nguồn gốc phân nhóm phytoplasma dựa đặc tính sinh học triệu chứng gây thực vật bị nhiễm, dãy tế bào chủ mối quan hệ với côn trùng môi giới (Chiykowski ctv, 1991) Nhờ áp dụng kỹ thuật phân tử phát triển hệ thống xác định phân loại mà hiểu biết phytoplasma ngày mở rộng Theo Chen ctv (1992), việc sử dụng mẫu dò phân tử kháng thể đơn dòng kháng thể đa dòng, đoạn DNA phytoplasma tạo dòng mở rộng hiểu biết phytoplasma Thông qua việc phân tích phát sinh lồi vùng 16S rRNA protein ribosome (rp) biết tình trạng bệnh phân nhóm phytoplasma giống với lớp “Mollicutes”, loại vi khuẩn gram âm, khơng có màng thứ cấp hay vách tế bào (Lee ctv, 2000) 21 2.3.2.2 Triệu chứng bệnh Triệu chứng bệnh bệnh phytoplasma gồm hóa (sự phát triển hoa màu xanh sắc tố thông thường hoa) hoa bất thụ, tăng nhanh số lượng chồi nách làm xuất chổi phù thủy, kéo dài khác thường gióng làm cho chồi mảnh khảnh, khơng phát triển bình thường (hoa nhỏ, gióng bị rút ngắn lại), bạc màu mọc nhiều chồi, cuộn lại khum hình chén, xuất cụm chồi cuối thân xuất suy giảm thơng thường (bị còi cọc, chết chồi, vàng trái mùa, hồng hồng đỏ mặt lá) Sự nhiễm phytoplasma gây chết hoại rộng rãi mạch libe thái hóa cấu tạo mô libe, kết gân bị trương lên (Lee ctv, 2000) Thiệt hại kinh tế gây nhiễm phytoplasma từ giảm phần sản lượng chất lượng tới gần toàn mùa vụ 2.3.2.3 Sự truyền lan rộng bệnh phytoplasma Phytoplasma mầm bệnh thực vật tìm thấy mạch libe thực vật bị nhiễm Bệnh phytoplasma lan rộng trùng mơi giới hút nhựa có quan hệ gần gũi với họ Ciadellidea (leaf-hoopers) Fulgoridea (plant-hoopers) (Bantarri ctv, 1979) Sự truyền bệnh xảy côn trùng chích vào mạch libe, phytoplasma tìm thấy chúng truyền từ thực vật sang thực vật Phytoplasma sống qua đơng trùng mơi giới sống lâu năm thực vật, nơi mà chúng trải qua thời gian sống ổ chứa, từ phytoplasma lan rộng vào mùa xuân Phytoplasma lan rộng cách nhân giống sinh dưỡng thơng qua cắt cành, tích lũy thân củ, thân rễ củ (Lee Davis, 1992): phytoplasma cảnh ăn thường lan rộng theo cách Phytoplasma truyền thông qua mô ghép, nhiên không giống với virus chúng truyền cách tiêm nhựa có chứa phytoplasma từ bị bệnh 2.3.2.4 Hình thái siêu cấu trúc Phytoplasma bị thiếu vách tế bào, bao quanh lớp màng dễ bị phá hủy thuốc kháng sinh Tetracycline (Doi ctv, 1967; Mc Coy ctv,1989) 22 Phytoplasma có cấu tạo hình sợi, đường kính trung bình 0,2 - 0,8 µm Giai đoạn đầu bệnh, thực vật phytoplasma dạng sợi chiếm ưu 2.3.2.5 Tần số phân bố phytoplasma Phytoplasma gây bệnh thực vật có mối quan hệ gần gũi với 94 họ, liên kết với nhiều côn trùng môi giới thuộc cánh giống (sâu bọ), chủ yếu có quan hệ gần gũi với họ Cicadellidae (leaf hoppers) (Mc Coy ctv, 1989) Về mặt địa lý, bệnh phytoplasma xuất khắp giới chúng báo cáo có 85 nước (Mc Coy ctv, 1989) Theo Lee ctv (2000), phytoplasma có nhiều lồi khác chúng có tần số phân bố khác nhau: nhiều lồi có châu lục vùng địa lý đặc biệt Nhóm phytoplasma gây bệnh vàng úa tần bì (16Sr VII), nhóm gây bệnh tăng nhanh số lượng cỏ ba (16Sr VI) hầu hết nhóm gây bệnh X (16Sr III) xuất châu Mĩ tây bán cầu; nhóm phytoplasma gây bệnh chổi phù thủy lạc (16Sr II) nhóm gây bệnh vàng lùn lúa (16Sr XI) nhóm Stolbur (16Sr XII-A) có châu Âu Sự phân bố phytoplasma vùng địa lý khác dường có quan hệ với tần số phân bố thực vật chủ côn trùng môi giới Đặc biệt, có nhiều lồi phytoplasma lan rộng khỏi vùng phân bố, nơi mà chúng phát sinh loài thực vật tương tự trùng mơi giới sống vùng sinh thái Một vài lồi phytoplasma phân tán khắp giới, có số lồi tồn phát triển vùng sinh thái, nơi mà giống bố mẹ phát sinh 2.3.5.6 Ảnh hưởng phytoplasma tới phát triển kinh tế Theo Lee ctv (2000), phytoplasma có liên quan tới bệnh vài trăm lồi thực vật, có nhiều lồi loại thực phẩm quan trọng, rau, ăn quả, lấy gỗ bóng mát Bệnh phytoplasma, đặc biệt bệnh trắng mía phytoplasma gây tổn thất hàng trăm triệu baht (khoảng 4,5 triệu đô la Úc) năm cho ngành cơng nghiệp mía đường Thái Lan (WongKaew ctv, 1997) ngành cơng nghiệp mía đường Ấn Độ bị tổn thất nặng nề phytoplasma Năm 1996, Murral ctv (1996) cho biết, phytoplasma phá hủy nhiều mùa màng nước Mĩ mùa rau 23 diếp, cần tây, cà rốt dâu tây Ngồi phytoplasma gây thiệt hại nặng nề cho mùa màng nhiều nước Việt Nam, Úc, Trung Quốc, Mexico v.v 2.3.2.7 Các kỹ thuật phát phytoplasma Kỹ thuật PCR Trong năm cuối thập niên 80 đầu thập niên 90, xét nghiệm dựa phản ứng PCR dùng để chẩn đốn phytoplasma có liên quan với loại bệnh phát triển mạnh mẽ Việc phát phương pháp PCR nhạy nhiều so với phương pháp kiểm tra huyết học lai phân tử DNA - DNA Mồi phản ứng PCR thiết kế dựa trình tự đoạn DNA phytoplasma tạo dòng sử dụng để phát lồi phytoplasma cụ thể (Harrison, 1996) Một bước ngoặt lớn nghiên cứu phytoplasma phát triển mồi oligonucleotide đặc trưng cho phytoplasma, mồi thiết kế dựa vào trình tự vùng 16S rRNA Các cặp mồi cho phép khuếch đại trình tự vùng 16S rDNA từ hầu hết dòng phytoplasma dòng đặc thù thuộc nhóm phytoplasma Các cặp mồi thơng thường cặp mồi đặc trưng cho nhóm đặc trưng cho nhóm phytoplasma phát triển dựa trình tự vùng 16 - 23S trình tự vùng rp vùng kéo dài EF - Tu (Tuf) (Harrison, 1996) Kỹ thuật nested PCR Hiện nay, để phát phytoplasma sử dụng kỹ thuật nested PCR phản ứng PCR hai bước, sử dụng cặp mồi Cặp khuếch đại vùng 16S rDNA phytoplasma Cặp thứ hai khuếch đại vùng nằm vùng khuếch đại thứ Lý nested PCR thực nhạy xác phản ứng PCR thông thường Cặp mồi khuếch đại mẫu, cặp thứ hai khuếch đại nhiều hơn, đủ để phát 24 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Thời gian địa điểm tiến hành thí nghiệm Thí nghiệm tiến hành từ ngày 26/01/2010 đến 30/06/2010 Viện Công nghệ Sinh học Công nghệ Môi trường, trường Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh 3.2 Nội dung nghiên cứu 3.2.1 Ly trích DNA từ mẫu sắn DNA từ sắn ly trích theo quy trình sử dụng DNeasy Plant Mini Kit công ty QIAGEN sản xuất 3.2.2 Xây dựng phản ứng nested PCR phát phytoplasma 3.3 Vật liệu hóa chất 3.3.1 Vật liệu - Đề tài sử dụng mẫu DNA đối chứng Viện BVTV Hà Nội cung cấp - Mẫu sắn thu thập từ huyện Vĩnh Cửu, Đồng Nai Qua trình khảo sát thực tế vườn sắn huyện Vĩnh Cửu, Đồng Nai, tiến hành lấy mẫu sắn Mẫu sắn lấy có triệu chứng đốt thân sít lại, cành bệnh bị chết khơ, còi cọc, mọc nhiều chồi chồi thân, nhỏ lại thô cứng, đốt thân ngắn lại, thân củ phần tiếp giáp với vỏ chuyển màu thâm đen, chồi bị chết khô Mẫu lá, cành sắn cắt cho vào túi ni lông Mẫu sắn đưa Viện Công nghệ Sinh học Môi trường, trường đại học Nông Lâm TP.HCM bảo quản Mẫu sắn bảo quản -20oC 25 Hình 3.1 Mẫu sắn thu thập từ huyện Vĩnh Cửu, Đồng Nai A: thân; B: ngọn; C: thân có nhiều chồi con; D: lá; E: cắt ngang thân sắn 3.3.2 Cặp mồi sử dụng Trong thí nghiệm này, sử dụng cặp mồi cặp P1/P7 cặp R16F2n/R16R2 Bảng 3.1 Trình tự cặp mồi P1/P7 R16F2n/R16R2 Tên mồi Trình tự P1 5’-AAG AGT TTG ATC CTG GCT CAG GAT-3’ P7 5’-CGT CCT TCA TCG GCT CTT-3’ R16F2n 5’-GAA ACG AGT GCT AAG ACT GG-3’ R16R2 5’-TGA CGG GCG GTG TGT ACA CCC G-3’ (Nguồn: Deng Hiruki, 1991) 3.3.3 Hóa chất 3.3.3.1 Hóa chất ly trích DNA, điện di kít ly trích tế bào thực vật DNeasy Plant Mini Kit Agarose, TBE 0,5X, EB, loading dye 3.3.3.2 Hóa chất PCR Đệm PCR 10X (Promega), dNTP 10 mM (Promega), Taq DNA polymerase (Promega), MgCl2 25 mM (Promega), cặp mồi P1/P7 cặp R16F2n/R16R2 26 3.3.4 Thiết bị dụng cụ Cối, chày, bồn ủ nhiệt (Memmert); autoclave; máy cất nước lần; máy ly tâm lạnh (Eppenderf); máy chiếu tia UV; máy chụp ảnh Cannon 10.0; tủ lạnh; máy luân nhiệt GeneAmp PCR System 9700; điện di, micropipette; đầu tip; eppendorf loại v.v 3.4 Phương pháp tiến hành 3.4.1 Quy trình ly trích DNA DNA từ mẫu sắn ly trích theo quy trình sử dụng DNeasy Plant Mini kit Quy trình sử dụng DNeasy Plant Mini kit: Nghiền mẫu (nhỏ 100 mg mẫu tươi nhỏ 20 mg mẫu đông lạnh) cối chày Thêm 400 µl đệm AP1 µl RNase A Vortex ủ 10 phút 65oC Lắc đến lần suốt thời gian ủ Thêm 130 µl đệm AP2 Trộn ủ đá phút Sau ly tâm phút 20.000 vòng/phút Gắn cột QSA vào ống 2ml Chuyển dịch sang cột QSA Ly tâm 20.000 vòng/phút phút Chuyển phần dịch chảy qua cột vào eppendorf (không làm sáo trộn phần cặn đáy) Thêm đệm AP3/E gấp 1,5 lần dịch thu Lặp bước lần với phần dịch lại Gắn cột DNeasy Mini Spin vào tube 2ml Hút 650 µl hỗn hợp cho vào cột Ly tâm 12.000 vòng/phút phút Loại bỏ phần dịch qua cột Lặp lại bước đến hết mẫu Đặt cột vào tube 2ml Thêm 500 µl đệm AW ly tâm 12.000 vòng/phút phút Loại bỏ phần dịch qua cột Thêm 500 µl đệm AW Ly tâm 14.000 vòng/phút phút Chuyển cột sang effpendoff 1,5 hay ml Thêm 100µl đệm AE để rửa giải Ủ phút nhiệt độ phòng Ly tâm 14.000 vòng/phút phút Lặp lại bước lần 27 3.4.2 Phản ứng PCR 3.4.2.1 Phản ứng PCR với cặp mồi P1 P7 Hai mồi thiết kế vùng 16S/23S rRNA cho phép khuếch đại đoạn DNA có kích thước 1,8 kb (Deng Hikuri, 1991; Schneider ctv, 1995) Bảng 3.2 Thành phần phản ứng PCR với cặp mồi P1/P7 Thành phần Nồng độ cuối H2O - Đệm PCR 10X 1X 50 mM MgCl2 mM 10 mM dNTPs 200 µM Mồi P1 25 pmol Mồi P7 25 pmol 5U/µl Taq Polymerase 2,5 U DNA mẫu 20 ng (Nguồn: Lee ctv, 1993; Harrison ctv, 1994) Chu kỳ nhiệt Các bước phản ứng Nhiệt độ Thời gian Giai đoạn khởi động 940C phút - Biến tính 940C phút - Bắt cặp 550C phút - Kéo dài 720C phút phút Chạy chu kỳ (38 chu kỳ) Giai đoạn kết thúc 72 C Giữ 40 C 3.4.2.2 Phản ứng PCR với cặp mồi R16F2n R16R2 Hai mồi thiết kế vùng 16S rRNA cho phép khuếch đại đoạn DNA có kích thước 1,2 kb (Gundersen Lee, 1996) 28 Bảng 3.3 Thành phần phản ứng PCR với cặp mồi R16F2n/R16R2 Thành phần Nồng độ cuối H2O - Đệm PCR 10X 1X 50mM MgCl2 mM 10mM dNTPs 200 µM Mồi R16F2n 25 pmol Mồi R16R2 25 pmol 5U/µl Tag Polymerase 2,5 U DNA mẫu ng (Nguồn: Lee ctv, 1993; Harrison ctv, 1994) Chu kỳ nhiệt Các bước phản ứng Nhiệt độ Thời gian Giai đoạn khởi động 940C phút - Biến tính 940C phút - Bắt cặp 550C phút - Kéo dài 720C phút Giai đoạn kết thúc 720C phút Giữ 40 C Chạy chu kỳ (38 chu kỳ) 29 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Mẫu sắn thu thập huyện Vĩnh Cửu, Đồng Nai Chúng tiến hành lấy mẫu có triệu trứng trình bày Hình 4.1 Mẫu sắn bị bệnh thu thập huyện Vĩnh Cửu, Đồng Nai A: sắn mọc nhiều chồi ngọn; B: sắn bị bệnh; C: sắn mọc nhiều chồi thân 4.2 Kết ly trích DNA từ sắn DNA từ mẫu sắn ly trích DNeasy Plant Mini Kit Kết điện di 100 V/ 25 phút/ 400 mA sản phẩm gel agarose 1% thu nhận kết sau: Hình 4.2 Kết ly trích DNA 1:ladder 1,5 kb; 2: mẫu chồi; 3: mẫu thịt lá; 4, 5, 8: mẫu gân lá; 6,7: mẫu chồi non Dựa vào hình trên, thấy lượng DNA ly trích khơng nhiều lắm, khơng có DNA gãy 30 4.3 Kết phản ứng PCR Phản ứng PCR chịu ảnh hưởng nhiều yếu tố nồng độ DNA, nhiệt độ bắt cặp mồi, nhiệt độ kéo dài, cân đối thành phần phản ứng dựa vào quy trình phản ứng PCR với mẫu chứng dương TS Trịnh Xuân Hoạt, Viện BVTV Hà Nội cung cấp, tiến hành phản ứng mẫu DNA ly trích Kết thu sau: Hình 4.3 Kết khuếch đại vùng 16S-23S rDNA 1: Đối chứng dương; 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9: sản phẩm PCR lần 1; 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17: sản phẩm PCR lần 2; 18: ladder 3,0 kb Từ hình 4.3, nhận thấy kết có vạch mờ So với thang DNA chuẩn kb chứng dương, nhận thấy sản phẩm PCR thu có kích thước tương đương 1,2 kb Kích thước sản phẩm hồn tồn trùng khớp với nghiên cứu Isidro Humberto Almayda-Leon ctv, 2001 Vạch mờ lượng DNA ly trích ít, điều kiện phản ứng nested PCR chưa tối ưu Những mẫu khơng thấy có sản phẩm mẫu ly trích khơng có DNA phytoplasma phân bố phytoplasma khác vườn sắn sai sót q trình ly trích DNA trình thực phản ứng nested PCR Nhưng quy trình phản ứng nested PCR ổn định đáng tin cậy để phát phytoplasma gây bệnh sắn 31 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Chúng thiết lập quy trình phát phytoplasma gây bệnh sắn kỹ thuật PCR Quy trình thực sau: - Thu thập mẫu bệnh từ vùng trồng sắn: thu thập mẫu có bị nhỏ lại thô cứng, đốt thân ngắn lại, thân củ phần tiếp giáp với vỏ chuyển màu thâm đen, chồi bị chết khô cho vào túi nilông đem bảo quản - Ly trích DNA từ mô gân sắn DNeasy Plant Mini kit - Phương pháp nested PCR dùng cặp mồi P1/P7 R16F2n/R16R2 khuếch đại đoạn DNA vùng 16 - 23S rDNA Thành phần phản ứng chu trình nhiệt trình bày bảng 3.2 bảng 3.3 Phản ứng tạo sản phẩm có kích thước tương đương 1,2 kb khẳng định vi khuẩn gây bệnh phytoplasma 5.2 Đề nghị Do thời gian hạn hẹp, hóa chất không kịp nên tạm dừng nghiên cứu Nhưng bước đầu xây dựng quy trình phát phytoplasma sắn nên nói trình ổn định Và nghiên cứu tạo điều kiện thuận lợi cho nghiên cứu tiếp theo, với kết đạt được, chúng tơi có vài đề nghị sau: - Cần tối ưu thành phần hóa chất phản ứng PCR để tăng hàm lượng sản phẩm PCR - Giải trình tự sản phẩm PCR - Tạo dòng phytoplasma gây bệnh sắn để làm chứng dương, tạo điều kiện thuận lợi cho nghiên cứu 32 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT: Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang 1999 Di truyền phân tử Nhà xuất nông nghiệp Hồ Huỳnh Thùy Dương 1998 Sinh học phân tử Nhà xuất giáo dục Hoàng Kim, Phạm Văn Biên 1995 Cây sắn Nhà xuất Nông nghiệp (chi nhánh phía Nam), thành phố Hồ Chí Minh Mai Thạch Hồnh, Nguyễn Cơng Vinh 2003 Giống kỹ thuật thâm canh có củ Nhà xuất nơng nghiệp Hồng Kim 2003 Cơng nghệ chọn tạo nhân giống sắn lai Công nghệ giống trồng, giống vật nuôi giống lâm nghiệp, tập GS Ngô Thế Dân, TS Lê Hưng Quốc (Chủ biên), trang 95-108 Hoàng Kim, 2008 Bài giảng lương thực (lưu hành nội bộ) Tp.Hồ Chí Minh http://cayluongthuc.blogspot.com Hồng Kim, Nguyễn Đăng Mãi 1997 Tiến nghiên cứu khuyến nông sắn Việt Nam Nhà xuất nông nghiệp Tp Hồ Chí Minh Trần Đình Long, Hồng Tuyết Minh 2000 Giới thiệu số giống trồng Việt Nam Nhà xuất nông nghiệp Trịnh Xuân Ngọ, Đinh Thế Lộc 1997 Cây có củ kỹ thuật thâm canh sắn (khoai mỳ) (Manihot Esculenta Crantz) Nhà xuất lao động xã hội TÀI LIỆU NƯỚC NGOÀI: 10 Bantarri EE and Zeyea RJ 1979 Intereactions of mycoplasma like organisms and viruses in dually infected leafhoppers, plant hoppersand plants Leafhopper Vectors and Plant Desease Agents, 327-347 11 Bandara, W.M.S.M and SiKuRaJapathy, M (1992) Recent progress in cassava varietal and agronomic reseach in Srilanka In: Howeler, RH Cassava Breading, Agronomy and Utilization Reseach in Asia Proceedings of the rd Regional Workshop, Malang, Indonesia, pp 96-105 12 Cassava for food and energy security Investing in cassava research and development could boost yields and industrial uses http://www.fao.org/newsroom/en/news/2008/1000899/index.html 13 Chen TA, Lei JD ang Lin CP.1992 Detection and identification of plant and insect molliticutes In the Mycoplasmas, Edition 5: 393-424 14 Chiyowski LN 1991 Vector-pathogen host plant relationships of clover phyllody mycoplasma like organism and the vector leafhopper Paraphlepsius irroratus Canadian Journal of Plant Pathology 13: 11-18 15 Combating cassava mosaic Global plant genetics policy and research unite with emergency operations against lethal crop disease http://www.fao.org/newsroom/en/field/2007/1000693/index.html 16 David J.Rogers 1965 Some botanical and ethnological considerations of Manihot esculenta Journal Article 33 17 Deng S and Hengruki C 1991 Amplification of 16S rRNA genes from culturable and non- culturable mollicutes Journal of Microbiologycal Method 14: 53-61 18 Fang Baiping et al 1992 Recent progress in cassava varietal improvement In: Cassava Breading Agronomy Reseach and technology transfer in Asia.CIAT, 1995 19 FAO Corporate Document Repository (2006), ”Wind erosion”, Originated Originated by: Agriculture Department; http://www.fao.org/docrep/T1765E/t1765e00.htm 20 Harrison NA 1996 PCR assay for detection of the phytoplasma associated with maize bushy stunt disease Plant Desease 80: 263-269 21 Isidro Humberto Almeyda-Leon et al 2001 The Use of Polymerase chain Reaction and Molecular Hybridization for Detection of Phytoplasmas in Different Species in Mexico Revista Mexicana de FITOPATOLOGIA 22 Lee IM and Davis RE and Gundersen-Rindal DE (2000) Phytoplasma: phytopathogenic mollicutes Annual Review of Micobiology 54: 221-255 23 Lee IM and Davis RE, Sinclair WA, DeWitt ND and Conti M (1993) Genetic relatedness of mycoplasma like organisms detected in Ulmus spp In USA and Italy by means of DNA probe and polymerase chain reaction Phytopathology 83: 829-833 24 Mc Coy et al 1989 Plant deseases associated with mycoplasma like organisms In the Mycoplasmas 5: 545-600 25 The best practices for cassava genebank management are still being finalized and are not available at the moment Only cassava regeneration guideline is accessible http://cropgenebank.sgrp.cgiar.org/index.php?option=com_content&view=arti cle&id=132&Itemid=232 CÁC TRANG WEB http://foodcrops.blogspot.com/ http://fa.hcmuaf.edu.vn/hoangkim http://cayluongthuc.blogspot.com http://cassavaviet.blogspot.com http://cropsforbiofuel.blogspot.com 34 ... Các công đoạn thao tác khác thiết lập phản ứng PCR phân tích sản phẩm khuếch đại phải tiến hành địa điểm cách xa - Dụng cụ dùng để thiết lặp phản ứng (micropipette) không sử dụng vào thao tác khác... sinh vật từ dịch tăng sinh để tách chiết DNA làm khuôn cho phản ứng PCR Phương pháp đơn giản, dễ thao tác, thực vi sinh vật khó ni cấy, tốn mặt nhân sự, chi phí thấp, độ xác độ nhạy cao ưu điểm... việc giải trình tự gene người 2.2.7 Những hạn chế phương pháp PCR Do độ nhạy cao PCR đồng thời với thao tác đơn giản, người ta có khuynh hướng sử dụng phương pháp để giải nhiều vấn đề Tuy nhiên ta