Xác định kiểu gen virut viêm gan C trong huyết thanh bệnh nhân viêm gan C bằng kỹ thuật sinh học phân tử Real time – PCR

Xác định kiểu gen virut viêm gan C huyết bệnh nhân viêm gan C kỹ thuật sinh học phân tử Real time – PCR Phương Thị Hà Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn Thạc sĩ ngành: Vi sinh vật học; Mã số: 60 42 40 Người hướng dẫn: TS.BS Nguyễn Văn Tiến Năm bảo vệ: 2011 Abstract: Trình bày đặc điểm sinh học virut viên gan C (HCV), genotype HCV, bệnh học viêm gan virut C kỹ thuật real-time PCR Phân tích mẫu huyết bệnh nhân xác định anti HCV dương tính đến xét nghiệm Khoa Truyền nhiễm bệnh viện Bạch Mai từ tháng 01/ 2011 đến tháng 01/2012 Đưa kết nghiên cứu: tỷ lệ bệnh nhân chuẩn đoán viêm gan C theo giới tính; tỷ lệ bệnh nhân chuẩn đoán viêm gan C theo mạn; mối tương quan kết định lượng với kết định type; xác định lại kiểu gen type phương pháp giải trình tự gen (Sequencing) đoạn NS5B Keywords: Vi sinh vật học; Virus viêm gan C; Kiểu gen; Sinh học phân tử Content ĐẶT VẤN ĐỀ Sau xác định người dương tính với anti-HCV, Bác sĩ trước cho đinh điều trị phải làm xét nghiệm hai yếu tố quan trọng có vai trò tiên lượng cho thành công thời gian điều trị cần thiết định lượng số lượng siêu vi máu (HCV-ARN) định kiểu gen siêu vi gây viêm gan C (HCV Genotypes) Để xác định genotypes HCV ngày với phát triển công nghệ sinh học, đặc biệt chuyên ngành công nghệ sinh học phân tử phát minh nhiều kỹ thuật để xác định kiểu gen HCV Trên giới có nhiều công ty: Bayer, Beckman Coulter, QIAgen, Roche… cho đời kit xác định genotypes HCV với độ xác cao Tuy nhiên, giá thành kit cao nên chưa áp dụng rộng rãi Ở Việt Nam phổ biến hai kỹ thuật xác định genotypes HCV: Real-time PCR (RT-PCR) kỹ thuật giải trình tự gen (sequencing) Kỹ thuật Sequencing chuẩn đoán có nhiều tính ưu việt việc xác định kiểu gen xác cao, tránh nhầm lẫn type subtype phương pháp cần có máy móc trang thiết bị đại điều kiện kỹ thuật cao nên gía thành cao chủ yếu thực trung tâm nghiên cứu Kỹ thuật RT-PCR tiến hành tất phòng thí nghiệm PCR dễ thực không đòi hỏi máy móc trang thiết bị kỹ thuật cao, giá thành rẻ phù hợp với điều kiện kinh tế đa số người dân Việt Nam,tuy nhiên không xác định đến subtype có nhầm lẫn type1 type6 Với mục đích khuyến cáo bệnh nhân lựa chọn phương pháp xác định genotype, chọn đề tài: “Xác định kiểu gen virus viêm gan C huyết bệnh nhân viêm gan C kỹ thuật sinh học phân tử RT-PCR”, với mục tiêu sau : 1) Xác định tỉ lệ người mang kiểu gen HCV phương pháp RT-PCR sử dụng Taqman probe 2) Xác định lại kiểu gen Type phương pháp giải trình tự gen (Sequencing) đoạn gen NS5B Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đặc điểm sinh học virut viêm gan C (HCV) 1.1.1.Hình thái cấu trúc virut viêm gan C Virut viêm gan C loại virut hướng gan kính hiển vi điện tử người phát HCV có hình cầu, hình đa diện hình que kích thước nhỏ (Hình 1.1) Về cấu trúc virut viêm gan C bao gồm lõi ARN, nhân core, gai glycoprotein màng vỏ (Hình 1.2) Mà ng vỏ glycoprotein Core Mà ng vỏ ARN virus Kích thước khoảng 60nm Hình 1.2 Cấu trúc virut viêm gan C 1.1.2 Genome HCV Genome HCV có lõi chứa vật liệu di truyền sợi ARN có tính phân cực dương, bao quanh màng protein có chức bảo vệ tạo hình đa diện gói lại màng lipid từ nguồn tế bào gan, kích thước chuỗi đơn ARN (+) 9,6 kb Giống chuỗi ARN dương loại virut khác, tổ chức genome virut viêm gan C mang vai trò ARN thông tin (mARN) truyền đạt thông tin di truyền cho protein virut [17,40,47] Tổ chức Genome HCV chia làm hai vùng Vùng cấu trúc mã hóa cho protein cấu trúc gồm: - Gen C mã hóa cho protein nuclecapsit p22 làm nhiệm vụ gắn với ARN để tạo nuclecapsit - Gen E1 mã hóa cho glycoprotein vỏ p33 - Gen E2 mã hóa cho protein vỏ gp 70 Vùng không cấu trúc mã hóa cho protein không cấu trúc bao gồm: - Gen NS2 mã hóa cho protein gắn vào màng (p23) - Gen NS3 mã hóa cho proteaza helicaza (p72) - Gen NS4 chia thành NS4A mã hóa cho protein p10 NS4B mã hóa cho protein p27 - Gen NS5 chia thành NS5a mã hóa cho replicaza NS5b mã hóa cho ARN- Polymeraza phụ thuộc ARN cần cho trình chép Phân tử ARN dạng mạch thẳng có chứa đơn khung mở (ORF- open reading frame), mã hóa cho tiền chuỗi protein với chiều dài khoảng 3000 gốc amino axit (Hình 1.3) Trong trình virrut chép chuỗi protein kích hoạt enzyme virut giống tế bào chủ ba protein cấu trúc (gồm nhân lõi-core, E1,E2) bảy protein không cấu trúc (bao gồm: p7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B)[31] Một protein khác (kí hiệu FTemed) ARF (khung đọc thay thế) dự đoán kết khung đọc thay riboxome trình chép với vùng nhân hệ gen ARN[39,43,46] Cấu trúc Không cấu trúc Tổng hợp chuỗi polyprotein Protein Core Glycoprotein vỏ Protease Proteaza helicaza Replica ARN-polymerase Hình 1.3: Tổ chức genome HCV Các gen cấu trúc mã hóa cho lõi protein virut protein vỏ virut E1,E2 đặt phần đuôi 5’ khung đọc mở theo chiều ngược vùng mã hóa cho protein phi cấu trúc p7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B (Hình 1.3) Các protein cấu trúc hợp phần quan trọng virut viêm gan C, protein phi cấu trúc gắn kết với virut xong lại nằm trình chép ARN morphogenesis virut [50] 1.1.3 Vòng đời virut viêm gan C Chưa biết đầy đủ vòng đời HCV chưa có môi trường nuôi cấy HCV in vitro để thể vòng đời sinh trưởng HCV Nhưng hình thành hệ thống replicon cách mạng giúp tìm hiểu sinh trưởng vòng đời HCV Hình 1.4 : Mô hình vòng đời sinh trƣởng HCV [51] (1:Sự hấp phụ bề mặt tế bào gan nhờ đồng tiếp nhận 2: Xâm nhập nội tế bào 3: Sự dung hợp với àng lipit tế bào gan 4: Phá bỏ lớp vỏ giải phóng ARN (+) 5: Dịch mã chép ARN nhờ Web màng 6: Tập hợp đóng gói 7: Tạo virut hoàn chỉnh 8: Sự phóng thích khỏi tế bào gan) 1.2 Genotype HCV HCV virus có gen ARN, chu kỳ nhân đôi virus phải sử dụng men RNA polymerase, mà men khả sửa sai trình tổng hợp ARN, từ làm cho gen virus đa dạng nên người ta phân virus thành nhiều loại (type) khác nhau[7,50] Tiến hành so sánh đối chiếu chuỗi nucleotit chủng virut thu nhận từ bệnh nhân nhiễm bệnh với nhóm bệnh khác trình lây nhiễm vùng miền địa lý khác người ta phát thấy tồn 06 nhóm gen bao gồm type 1, type 2,type type 4,type type 6[12,39] Khi tính toán mức trung bình toàn genome hoàn chỉnh, khác biệt tâm nucleotit 30- 35% với biến đổi nhỏ vùng xác định glycoprotein E1 E2 mà chuỗi gen nhân số gen cấu trúc NS3 có bảo toàn cao Khả khác chuỗi mức thấp genotype phát thấy 5’ NCR, chuỗi riêng lẻ cấu trúc ARN thứ cấp cần thiết cho trình chép chức chuyển hóa[44,47] Mặc dù có đa dạng chuỗi HCV, tất trình tự bổ sung kích thước đoạn gen có đồng Tuy nhiên trái ngược với quan sát chung biến đổi chuỗi trình tự mã hóa hai vị trí khung đọc kích thước protein bảo tồn cao với kiểu gen Điều trái ngược với tính chất bảo tồn tiến hóa nhiều HCV, đồng ý với ý kiến cho có khả gen sản phẩm sinh từ nhân đôi ARN có biến đổi codon thứ ba gen lõi[42,44] Kiểu gen 1a phân bố rộng rãi bắc Âu Mỹ, nước có công nghiệp hóa Kiểu gen [2a,2b,2c] tìm thấy chủ yếu nước vùng Địa Trung Hải viễn Đông Kiểu gen 1b thường thường phân bố toàn giới Kiểu gen 3a phân bố khu vực công nghiệp hóa Châu Âu Type 4a phân bố rộng rãi Trung Đông Type 6a tìm thấy Việt Nam, khu công nghiệp Hồng Kông gần tìm thấy Autralia Type 5a thường tìm thấy Nam Phi Hình 1.6 : Sự phân bố kiểu gen [44] Mỗi nhóm gen 06 nhóm gen quan trọng HCV có chứa chuỗi subtype có liên quan chặt chẽ với Trong đó, khác biệt subtype vào khoảng 20- 25% chuỗi nucleotit, với genotype số >30% Một số genotype 1a,1b, 3a có phân bố rộng cả, điều kết trình truyền máu dùng chung kim tiêm người sử dụng ma túy vòng 30-70 năm qua phần lớn phân bố nước phương tây (Hình 1.6 ).(Đây kiểu gen gặp phổ biến thử nghiệm lâm sàng thông tin thu thập phản ứng với interferon (INF) phương pháp điều trị virus khác) Trong 1a phân bố toàn giới, 1b phân bố nhiều Châu Âu Bắc Mỹ, type phân bố địa trung hải Trung Đông, type chủ yếu Châu Âu, type phân bố trung đông, type Nam Phi, type Hồng Kông Việt Nam [42,44] Một mô hình khác tính đa dạng chuỗi quan sát thấy khu vực châu Phi Đông Nam Á, Ở có kiểu gen gần gũi khu vực địa lý cụ thể Ví dụ, lây nhiễm HCV miền tây Châu Phi genotype 2, người Trung Phi, chẳng hạn Cộng hòa Dân chủ Congo Gabon, lại có lưu hành kiểu gen 4,còn kiểu gen lưu hành khu vực Đông Á phổ biến Phân tích mức độ phân tử cho thấy có mặt kiểu gen có thời gian lưu hành khu vực địa lý tương ứng vài kỷ [42,44] Kiểu gen ví dụ bật đa dạng HCV vùng lưu hành Thật vậy, kiểu gen HCV phân lập từ Đông Á khác mà ban đầu nhà nghiên cứu phân loại kiểu gen 7,8,9 11[42] Những chủng phân loại phân nhóm kiểu gen Lây nhiễm kiểu gen số đáng kể vùng dịch tễ: tổ chức WHO xác định có 62 triệu người bị nhiễm khu vực Tây Thái Bình Dương, chiếm 1/3 lây nhiễm kiểu gen toàn giới [42] Kiểu gen phân lập thu từ cư dân Thái Lan, Ấn Độ, Campuchia, Lào, Myanmar, Việt Nam, Trung Quốc, Hồng Kông Indonesia [42,44] Sự lưu hành HCV cộng đồng có thay đổi nước Đông Á, từ khoảng 0,5% Singapore Hồng Kông, khoảng 6% Việt Nam Thái Lan [42] vượt 10% Myanma, tỷ lệ báo cáo Trung Quốc khoảng 2-3% xấp xỉ khoảng 30 triệu người [42] Tất nhiên,không phải nhiễm HCV Đông Á kiểu gen phân bố kiểu gen HCV thay đổi nước khu vực Đông Á Các genotype HCV có khác độc lực, khẳ gây bệnh khả đáp ứng điều trị interferon (genotype đáp ứng thấp genotype khác: 18,1% so với 54,9%)[2] Hậu tính đa dạng gen HCV: +Làm virut có khả né tránh đáp ứng miễn dịch vật chủ dẫn đến tỉ lệ nhiễm HCV mạn cao (>80%) + Sau khỏi bệnh, thể miễn dịch bảo vệ có nguy bị tái nhiễm + Việc nghiên cứu sản xuất vacin phòng bệnh khó khăn chưa có vacin (do thiếu hệ thống nuôi cấy tế bào thích hợp, HCV đột biến gen tạo chủng virut mới) 1.3 Các kỹ thuật xét nghiệm xác định kiểu gen HCV Hiện kỹ thuật ứng dụng xác định kiểu HCV Việt Nam kỹ thuật Realtime PCR giải trình tự gen ( InoLIPA Sequencing) Chƣơng 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu 2.1.1.Thời gian địa điểm nghiên cứu Thời gian nghiên cứu: tháng 1/2011 đến tháng 1/2012 Địa điểm nghiên cứu: Phòng xét nghiệm - Khoa truyền nhiễm - Bệnh viện Bạch Mai 2.1.2 Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu mẫu huyết bệnh nhân xác định Anti HCV dương tính đến xét nghiệm Khoa Truyền nhiễm Bệnh viện Bạch Mai 2.2 Các kĩ thuật sử dụng nghiên cứu Mẫu có đủ điều kiện tách chiết tinh ARN sau tổng hợp thành cDNA nhờ men phiên mã ngược Reverse Transciptase, sản phẩm cDNA mẫu bệnh nhân định lượng phương pháp Real-time Kĩ thuật tách chiết ARN Kĩ thuật tổng hợp cDNA với mồi ngẫu nhiên Kỹ thuật Real - time PCR sử dụng Taqman Probe phát đinh lượng HCV-RNA Kĩ thuật Real-time PCR sử dụng taqman probe để xác định kiểu gen HCV Kỹ thuật sequencing xác định kiểu gen HCV 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu Sử dụng phương pháp nghiên cứu mô tả có đối chứng Thống kê mẫu theo độ tuổi giới tính, phân bố lưu hành kiểu gen mẫu lựa chọn Chƣơng 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1 Đặc điểm nhóm bệnh nhân nghiên cứu 3.1.1 Tỉ lệ bệnh nhân chẩn đoán viêm gan C theo giới tính 3.1.2 Tỉ lệ bệnh nhân chẩn đoán viêm gan C mạn 3.2 Tỉ lệ kiểu gen HCV kỹ thuật RT-PCR 3.2.1 Mối tương quan kết định lượng với kết định type 3.2.2 Tỉ lệ kiểu gen 228 bệnh nhân xác định genotype Bảng 3.4 Tỉ lệ kiểu gen HCV Kiểu gen Type Type Type Type Không xác Tổng định đƣợc HCV Số mẫu 151 70 228 Tỉ lệ % 66.23% 2.19% 0% 30.7% 0.88% 100% Qua bảng 3.4 ta thấy số 228 mẫu huyết định genotype tỉ lệ type chiếm nhiều 151 mẫu chiếm 66.23%, sau type gồm 70 mẫu chiếm 30.7% tỉ lệ thấp type có mẫu chiếm tỉ lệ 2.19%, không xác định type có mẫu với tỉ lệ 0.88%, không phát type 228 trường hợp bệnh nhân nghiên cứu Tỉ lệ phân bố kiểu gen biểu diễn hình 3.3 Hình 3.3 Tỉ lệ phân bố kiểu gen Trong nghiên cứu Hồ Thị Thanh Thủy cộng năm 2006, tác giả sử dụng kỹ thuật Real-time Rever Transcription PCR định kiểu gen HCV ghi nhận có 28 trường hợp type chiếm 56 %, 15 trường hợp type chiếm 30%, trường hợp type chiếm 14%, trường hợp type 3[50] Cũng tương đồng với kết nghiên cứu Hồ Tấn Đạt cộng trung tâm y khoa MEDIC Thành phố Hồ Chí Minh, tác giả sử dụng kỹ thuật LIPA để xác định tần suất kiểu gen HCV người Việt Nam bị viêm gan siêu vi C mạn tính, tác giả xác định kiểu gen 1,2 Trong kiểu gen chiếm 58,4% ( type 1:5,8%,type 1a:6,4%,type1a/1b:0,3%, type 1b:45,9%), kiểu gen (toàn 6a) 23,9% kiểu gen 13,1% (type 2: 1,5%;type 2a/2c: 11,6%), có trường hợp kiểu gen 3b (0,3%)[ 50] Trong nghiên cứu Hồ Thị Thanh Thủy luận văn sử dụng kỹ thuật Realtime PCR sử dụng Taqman probe khuếch đại vùng 5’NC nghiên cứu Hồ Tấn Đạt sử dụng phương pháp giải trình tự gen vùng 5’NC, cho thấy kết nghiên cứu có tương đồng kết với hai tác giả trên, dựa vùng gen 5’NC đa số kiểu gen HCV tập trung genotype genotype chiếm cao Tuy nhiên tỉ lệ chưa thể phản ánh thật phân bố tỉ lệ kiểu gen HCV người nhiễm HCV Việt Nam Bảng 3.4 Tỉ lệ kiểu gen HCV Kiểu gen Type Type Type Type Không xác Tổng định đƣợc HCV Số mẫu 151 70 228 Tỉ lệ % 66.23% 2.19% 0% 30.7% 0.88% 100% Qua bảng 3.4 ta thấy số 228 mẫu huyết định genotype tỉ lệ type chiếm nhiều 151 mẫu chiếm 66.23%, sau type gồm 70 mẫu chiếm 30.7% tỉ lệ thấp type có mẫu chiếm tỉ lệ 2.19%, không xác định type có mẫu với tỉ lệ 0.88%, không phát type 228 trường hợp bệnh nhân nghiên cứu Tỉ lệ phân bố kiểu gen biểu diễn hình 3.3 Hình 3.3 Tỉ lệ phân bố kiểu gen Trong nghiên cứu Hồ Thị Thanh Thủy cộng năm 2006, tác giả sử dụng kỹ thuật Real-time Rever Transcription PCR định kiểu gen HCV ghi nhận có 28 trường hợp type chiếm 56 %, 15 trường hợp type chiếm 30%, trường hợp type chiếm 14%, trường hợp type 3[50] Cũng tương đồng với kết nghiên cứu Hồ Tấn Đạt cộng trung tâm y khoa MEDIC Thành phố Hồ Chí Minh, tác giả sử dụng kỹ thuật LIPA để xác định tần suất kiểu gen HCV người Việt Nam bị viêm gan siêu vi C mạn tính, tác giả xác định kiểu gen 1,2 Trong kiểu gen chiếm 58,4% ( type 10 1:5,8%,type 1a:6,4%,type1a/1b:0,3%, type 1b:45,9%), kiểu gen (toàn 6a) 23,9% kiểu gen 13,1% (type 2: 1,5%;type 2a/2c: 11,6%), có trường hợp kiểu gen 3b (0,3%)[ 50] Trong nghiên cứu Hồ Thị Thanh Thủy luận văn sử dụng kỹ thuật Realtime PCR sử dụng Taqman probe khuếch đại vùng 5’NC nghiên cứu Hồ Tấn Đạt sử dụng phương pháp giải trình tự gen vùng 5’NC, cho thấy kết nghiên cứu có tương đồng kết với hai tác giả trên, dựa vùng gen 5’NC đa số kiểu gen HCV tập trung genotype genotype chiếm cao Tuy nhiên tỉ lệ chưa thể phản ánh thật phân bố tỉ lệ kiểu gen HCV người nhiễm HCV Việt Nam 3.2.3 Tỉ lệ kiểu gen lưu hành theo giới tính 3.2.4 Sự phân bố kiểu gen theo nhóm tuổi 3.3 Xác định lại kiểu gen Type phƣơng pháp giải tình tự gen (Sequencing) đoạn NS5B Đối với hệ mồi mẫu dò vùng 5’NC HCV thiết kế thí nghiệm sử dụng RNA chứng dương HCV genotype đưa vào hỗn hợp cho phản ứng revers transcription RT- PCR chứa probe đặc trưng cho HCV genotype 1,2,3 Việc bố trí thí nghiệm tiến hành tương tự cho genotype lại Kết có hỗn hợp chứa mẫu dò Probe đặc trưng cho HCV genotype cho tín hiệu dương tính Kết tương tự cho genotype lại (Hình 3.6) HCV genotype HCV genotype HCV genotype2 HCV genotype Chứng âm Hình 3.6 Kết khảo sát khả khuếch đại mồi mẫu dò vùng 5’NC HCV 11 Hình 3.6 cho thấy phản ứng có kiểu gen tương ứng với mẫu dò đặc trưng tín hiệu huỳnh quang vượt tín hiệu nền, mẫu chứng âm (được thiết kế với thành phần tương tự cho phản ứng real-time PCR real-time RT PCR) có tín hiệu huỳnh quang thấp tín hiệu Tuy nhiên 228 bệnh phẩm xác định genotype HCV có 59 trường hợp kết cho hai tín hiệu dương tính đặc trưng cho HCV genotype (Hình 3.7) Tín hiệ u mẫ u dò type Tín hiệ u mẫ u dò type Tín hiệ u mẫ u dò type Tín hiệ u mẫ u dò type Hình 3.7 Tín hiệu dƣơng tính genotype Vậy tín hiệu mẫu dò type type có tương đồng cao.Theo số nhà nghiên cứu giới [18] chứng minh định genotype HCV vùng NS5B phân biệt subtype tốt dựa vùng 5’NC, phân biệt type với subtype 1b Trong số 151 mẫu bệnh nhân xác định genotype l ta l ngẫu nhiên 30 trường hợp đem giải trình tự gen đoạn NS5b kết bảng sau: Bảng 3.7 Kết giải trình tự gen đoạn NS5b HCV Kiểu gen Type Type 1a Type Type 1b Type 6k Type 6e Không Type 6f Type 6h xác định Số mẫu Tổng 16 11 12 3 Tỉ lệ % 53.33 36.67 10.0 Trong 30 mẫu giải trình tự gen có 16 mẫu huyết type 11 mẫu huyết xác định type có mẫu không giải trình tự gen, không xác định type mà giải trình tự gen xác định đến subtype Như có 11 mẫu huyết định type phương pháp RT- PCR dùng taqman probe gắn huỳnh quang FAM phát genotype HCV cho tín hiệu dương tính với genotype phương pháp giải trình tự gen cho kết type 6, có mẫu type 6k, mẫu type 6e, mẫu type 6f mẫu type 6h (Bảng 3.7 ) Kết định type kỹ thuật RT- PCR cho tín hiệu dương tính với genotype1 ta đem giải trình tự kết hình dưới,kết giải trình tự gen type 6h (Hình 3.8) 78 HCV GAGGTACTTGCCACATATTGCGGCTTTCCCTCCTTGGGCGATAAGTTTGGCCC TGACCGCTCGGGCTCGGTGTCTCCAAGCTCTCAAGGGAGGAGCCCCAAGTTTTCT GAGGCATGATGCCACCCGATTGAGTTCGCCGGGAGAGTACCCATGGAGTGAGAA TGCGGCCATGCCGTGGAGTCTTTGAATGATCACTGGGAGATCAAGCGGAGTGATT GAATATGTGACTCCGTAGATATCGAAGTCAAGTGCCCTGTCCAAAGTCTCCTGTG CCTGGAGTATTTGAAAGAAATGGGTCATGAGTACCATACGCACCCAAATGGTGG GGGCATACATAATGATGTTCCCTAACCATGAATTCACAGGAGTGTGGCGAGCGGT CTCCCAGGCCGCCCTCGCCAGTGGAGTGACAGGGTCACGAGTGAGGTAGTAATAT CTTCTGCCGTCTCCATCGTGGGCCACGGAAACATTGGATGAGCATGATGTTA Hình 3.8 Kết giải trình tự gen đoạn NS5b Trong mẫu không giải trình tự gen có mẫu có ARN-HCV thấp 1,1x102 4,2x102 có mẫu 5,8x103 Như giải trình tự gen có xác định kết xác đến subtype tránh nhầm lẫn type type định lượng 13 ARN-HCV có số copies< 103 ta không định type, điều nhà sản xuất kit hóa chất khuyến cáo Ta thấy tỉ lệ nhầm lẫn type type 30 mẫu định type phương pháp Real-time PCR với phương pháp giải trình tự gen 11/27 mẫu 40,74% Như định type phương pháp Real-time PCR xét mặt kinh tế phù hợp với đa số điều kiện bệnh nhân, nhiên không xác định subtype tỉ lệ nhầm lẫn type type 40,74% ảnh hưởng đến kết điều trị bệnh nhân,do genotype HCV có khác độc lực, khả gây bệnh khả đáp ứng điều trị genotype thường đáp ứng thấp với genotype khác (Genotype thường điều trị vòng 48 tuần genotype khác điều trị 24 tuần) Do bệnh nhân xác định type phương pháp RT- PCR có kết định lượng >103copies/ml nên kiểm tra lại phương pháp giải trình tự gen KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Qua kết nghiên cứu định genotype HCV kỹ thuật sinh học phân tử Real-time PCR cho tỉ lệ genotype cao chiếm 66,23%, tiếp type chiếm tỉ lệ 30,7%, type có tỉ lệ thấp 2,19%, type 228 trường hợp nghiên cứu Lấy ngẫu nhiên 30 mẫu xác định genotype kỹ thuật Real-time PCR giải trình tự gen có 16 mẫu huyết type 1trong có mẫu type 1a mẫu type 1b , có 11 mẫu huyết xác định type mẫu type 6k, mẫu type 6e, mẫu type 6f mẫu type 6h Ta thấy tỉ lệ nhầm lẫn type type 30 mẫu định type phương pháp Real-time PCR với phương pháp giải trình tự gen 40,74%, nhiên nồng độ virut thấp không làm giải trình tự gen KIẾN NGHỊ: Vẫn dùng kỹ thuật Real-time PCR để định type nồng độ virut thấp Khi xác định type phương pháp Real-time PCR có kết định lượng >103copies/ml nên kiểm tra lại phương pháp giải trình tự gen (Sequencing) References Tài liệu tiếng viêt: 14 Nguyễn Thanh Bảo, Phạm Hùng Vân (2008), “ Áp dụng kỹ thuật giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR thu nhận từ thử nghiệm RT Real-time PCR vùng 5’-NC để làm xét nghiệm định kiểu gen HCV”, Y học TP Hồ Chí Minh, 13(1), pp.243-248 Hồ Huỳnh Thùy Dương (2008), Sinh học phân tử, NXB Giáo dục, TP Hồ Chí Minh Lê Thanh Hòa, Lê Thanh Hà, Hoàng Quang (2007), “ Định typ (genotyping), virus viêm gan C (HCV) sử dụng thị 5’ UTR bệnh nhân viêm gan virus Hà Nội”, Tạp chí y học Việt Nam, 7, pp.29-36 Học viện quân y (2008), Bệnh học truyền nhiễm nhiệt đới, NXB y học Hà Nội Võ Thị Thương Lan (2008), Sinh học phân tử, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội, Hà Nội Hà Văn Mạo (2006), Ung thư gan nguyên phát, NXB y học, Hà Nội Phạm Song (2009), Viêm gan virut B,D,C,A,E,GE bản, đại cập nhật, NXB Y học, Hà Nội Trường Đại học Y Hà Nội (2006), Bài giảng vi sinh vật y học, NXB y học, Hà Nội Phạm Văn Ty (2005),Virut học, NXB giáo dục, Hà Nội 10 Phạm Hùng Vân (2009), PCR Real-time PCR vấn đề áp dụng thường gặp, NXB y học, TP Hồ Chí Minh Tài liệu tiếng Anh 11 Akazawa D., Date T., Morikawa K., Murayama A., Miyamoto M., Kaga M., Barth H., Baumert T.F., Dubuisson J., Wakita T (2007), “ CD81 expression is important the permissiveness of huh7 cell clones for heterogeneous hepatitis C virus infection”, Journal of Virology, 81, pp.5036-5045 12.Alfonso V., Mbayed V.A., Sookozian S., Campos R.H (2005), “Intra-host evolutionary dynamies of hepatitis C virus E2 in treated patients”, Journal of General Virology, 86, pp.2781-2786 13.Alter M.J (2007), “Epidemiology of hepatitis C virus infection”, World J Gastroenterol, 13(17), pp.2436-2441 14 Batey R.G (2007), “ Controversies in and challenges to our understanding of hepatitis C”, World Journaly Gastroenterology,13(31), pp.4168-4176 15 Barth H., Schafer C., Adah M.I., Zhang F., Linhardt R.J., Toyoda H., Toyoda A.K., Toida T., Kuppevelt T.H., Depla E., Weisackev F.V., Blum H.E., Bacmert T.F (2003), “ Cellular Binding of hepatitis C virus envelope glycoprotein E2 requires cell surface heparin sulfate”, The Journal of Biologycal chemistry, 278 (42), pp 41003-41012 15 16 Blanchard E., Blouzard S., Goueslain L., Wakita T., Dubuisson J., Wychowski C., Rouille Y (2006), “ Hepatitis C virus entry depends on clathrin-mediated endocytosis”, Journal of Virology, 80(14), pp.6964-6972 17 Branch A.D., Stump D.D., Gutierrez J.A., Eng F., Walewski J.L (2005), “ The hepatitis virus alternate reading frame (ARF) and its family of novel products: the alternate reading frame protein/F-protein, the double-frameshift, and others”, Seminars in liver disease 2005, 25(1), pp.105-117 18 Donahue J.G., D.V.M., Munoz A., Paul M., Ness M.D., Donald E., Broun J.R., David H., Yawn M.D., Hugh A., McAllister J.R., Bruce A., Rettz M.D (1992), “ The declining risk of posttransfusion hepatitis C virus in fection”, The new England Journal of Medicine, 327(6), pp.369-373 19 Duvet S., Beeck A.O.D., Cocquerel L., Wychowski C., Cacan R., Dubuisson J (2002), “ Glycosylation of the hepatitis C virus envelope protein E1 occurs posttranslationally in a mannosylphosphorylclolichol-deficient CHO mutant cell line”, Insttutde Biologie delille/ Instiut Pasteur delille, BP447,59021 LILLE Cedex, France 20 Esfahani S.N., Shahhosseing M.H., Yaghmai P., Praivar K., Moslemi E., Amini H.K (2010), “ Rapid and simple detection of Hepatitis C virus by reverse transcriptase-loop-mediated isothermal amplification method”, African Journal of Microbiology Research, 4(23), pp.25802586 21 Friebe P., Bartenschlager R (2002), “Genetic analysis of sequences in the 3’ nontranslated region of hepatitis C virus that are important for RNA replication”, Journal of Virology, 76(11), pp.5326-5338 22 Friebe P., Boudet T., Simorre J.P., Bartenschlager R (2005), “ Kissing-loop interation in the 3’ end of the hepatitis C virus genome essential for RNA replication”, Journal of Virology, 79(1), pp.380-392 23 Fu Y., Wang Y., Xia W., Pybus O.G., Qin W., Lu L., Nelson K (2011), “New treds of HCV infection in China revealed by genetic analysis of viral sequences deter mined from firt-time volunteer blood donors”, Journal of viral hepatitis, 18, pp.42-52 24 Germer J.J., Rys P.N., Thorvilson., Persing D.H (1999), “ Determination of hepatitis C virus genotype by direct sequence analysis of products generated with the amplicon HCV test”, Journal of Clinical Microbiology, 37(8), pp.2625-2630 25 Gastaminza P., Cheng G., Wieland S., Zhong J., Liao W., Chisari F.V (2008), “ Cellular determinants of hepatitis C virus assembly, maturation, degradation and seretion”, Journal of Virology, 82(5), pp.2120-2129 16 26 Halfon P., Trimoulet P., Bourliere M., Khiri H., Deledinghen V., Couzigou P., Feryn J.M., Alcaraz P., Renou C., Fleury H.J.A., Ouzan P (2001), “ Hepatitis C virus genotyping based on 5’ noncoding sequence analysis (Trugene)”, Journal of Clinical Microbiology, 39(5), pp.1771-1773 27 Haqshenas G., Mackenrie J.M., Dong X., Gowans E.J (2007), “ Hepatitis C virus p7 protein is localized in the endoplasmic reticulum when it is encoded by a replication-competent genome”, Journal of General Virology, 88, pp.134-142 28 Helle F., Dubuisson J (2008), “Hepatitis C virus entry into host cells”, Cellularand Molecular Life Sciences, 65, pp 100-112 29 Honda M., Beared M.R., Ping L.H., Lemon S.M (1999), “ A phylogenetically conserved stemloop structure at the 5’ border of the internal ribosome entry site of hepatitis C virus is required for cap-independent viral translation”, Journal of Virology, 83(2), pp.1165-1174 30 Hotta H., Handajami R., Lusida M.I., Soemarto W., Doi H., Miyajama H., Homma M (1994), “ Subtype analysis of hepatitis C virus in Indonesia on the basis of NS5b region sequences”, Journal of Clinical Microbiology, 32(12), pp.3049-3051 31 Hsu M., Zhang J., Flint M., Logvinoff C., Cheng-Mayer C., Rice C., McKeating J.A (2003), “ Hepatitis C virus glycoproteins mediate pH-dependent cell entry of pseudotyped retro viral particles”, 1230 York Avenue, New York 32 James G., Donahue Jr., David H., Yawn M.D., Hugh A., McAllister J.R., Bruce A., Rettz M.D., Kenrad E (1992), “The declining risk of post-transfusion hepatitis C virus infection”, The new England Journal of Medicine, 327(6), pp.369-373 33 Kapadia S.B., Barth H., Baumert T., Mekeating J.A., Chisari F.V (2007), “ Initiation of hepatitis C virus infection is dependent on cholesterol and cooperativity between CD81 and scavenger receptor B type 1”, Journal of Virology, 81(1), pp.374-383 34 Kolykhalov A.A., Feinstone S.M., Rice C.M (1996), “ Identification of a highly conserved sequence element at the 3’ terminus of hepatitis C virus genome RNA”, Journal of Virology, 70(6), pp 3363-3371 35 Marshall D.J., Heisler L.M., Lyamichev V., Murvine C., Olive D.M., Ehrlich G.D., Neri B.P., deArruda M (1997), “ Determination of hepatitis C virus genotypes in the United States by Cleavase fragment length polymorphism analysis”, Journal of Clinical Microbiology, 35(12), pp.3156-3162 17 36 Martell M.,Gomez J., Esteban T., Sauleda S., Quer J., Cabot B., Esteban R., Guardia J (1999), “ High-throughput Real-time reverse transcription – PCR quantitation of hepatitis C virus RNA”, Journal of Clinical Microbiology, 37(2), pp.327-332 37 Martial J., Morice Y., Albel S., Cabie A.,Rat C., Lombard F., Edouard A., Bierre-louis S., Chout R., Gordien E., Deny P., Cesaire R (2004), “ Hepatitis C virus (HCV) genotypes in the Caribbean island of martinique: evidence for a large radiation of HCV for a recent introduction from Europe of HCV-4”, Journal of Clinical Microbiology, 42(2), pp.784-791 38 McOmish F., Yap P.L., Dow B.C., Follett E.A.C., Seed C., Lin C., Lai C., Leong S., Medgyesi G.A., Hejjas M., Kiyokawa H., Fukada K., Cuypers T., Saeed A.A., Al-rasheed A.M (1994), “ Geographical distribution of hepatitis C virus genotypes in blood donors : an international collaborative survey”, Journal of Clinical microbiology, 32(4), pp.884-892 39 Moradpour D., Cerny A., Heim M H., Blum H.E (2003), “ Hepatitis C: an update”, Swiss Med Wkly, 131, pp.291-298 40 Ndjomou J., Dybus O.G., Matz B (2003), “ Phylogentic analysis of hepatitis C virus isolates indicates a unique pattern of endemic infection in Cameroon”, Journal of General Virology, 84, pp 2333-2341 41 Pybus O.G., Barnes E., Taggart R., Lemey P., Markov P.V., Rasachak B., Syhavong B., Phetsouvanah R., Sheridan I., Humphrey I.S., Lu L., Newton P.N., Klenerman P (2009), “ Genetic history of hepatitis C virus in East Asia”, Journal of Virology, 83(2), pp.1071-1082 42 Simmonds P., Holmes E.C., Cha T.A., Chan S.W., McOmish F., Irvine B., Beall E., Yap P.L., Kolberg J., Urdea M.S (1993), “ Classification subtype by phylogenetic analysis of the NS-5 rigion”, Journal of General Virology, 74, pp 2391-2399 43 Simmonds P (2004), “Genetic diversity and evolution of hepatitis C virus-15 years on”, Journal of General Virology, 85, pp.3173-3188 44 Simmonds P., Bukh J., Combet C., et al (2005), “ Consensus proposals for a unified system of nomenclature of hepatitis C virus genotypes”, Hepatology 2005, 42, pp 962-973 45 Song Y., Friebe P., Tzima E., Junemann C., Bartenschlager R., Niepmann M (2006), “ The hepatitis C virus RNA 3’-untranslated region entry site”, Journal of Virology, 80(23), pp.11579-11588 46 Walewski J.L., Keller T.R., Stump D.D., et al (2001), “ Evidence for a new hepatitis C virus antigen encoded in an overlapping reading frame”, RNA 2001, 7, pp.710-721 47 Xu Z., Fan X., Xu Y., Bisceglie A.M.D (2008), “ Comparative analysis of nearly full-length hepatitis C virus quasispecies from patients experiencing viral break through during antiviral 18 therapy: clustered mutations in three functional genes, E2,NS2 and NS5a”, Journal of Virology, 82(19), pp.9417-9424 48 You S., Rice C.M (2008), “ 3’RNA elements in hepatitis Cvirus replication: kissing partners and long poly (U)”, Journal of Virology, 82(1), pp.184-195 Trang web 49 http://www.drthuthuy.com 50 http://www.HepatologyTextbook.com 51 http://www.ncbi.nlm.nih.gov 19