Xác định sự khuếch đại gen MYCN ở bệnh nhân u nguyên bào thần kinh bằng kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN  NGUYỄN XUÂN HUY XÁCĐỊNH SỰ KHUẾCH ĐẠI GEN MYCN Ở BỆNH NHÂN U NGUYÊN BÀO THẦN KINH BẰNG KỸ THUẬT LAI HUỲN

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN



NGUYỄN XUÂN HUY

XÁCĐỊNH SỰ KHUẾCH ĐẠI GEN MYCN

Ở BỆNH NHÂN U NGUYÊN BÀO THẦN KINH BẰNG KỸ THUẬT LAI HUỲNH QUANG TẠI CHỖ

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

PGS TS Nguyễn Thị Hồng Vân

Hà Nội– Năm 2016

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN



NGUYỄN XUÂN HUY

XÁCĐỊNH SỰ KHUẾCH ĐẠI GEN MYCN

Ở BỆNH NHÂN U NGUYÊN BÀO THẦN KINH BẰNG KỸ THUẬT LAI HUỲNH QUANG TẠI CHỖ

Tôi xin được cảm ơn các đồng nghiệp trong khoa Di Truyền và Sinh học phân tử – Bệnh viện Nhi TW đã nhiệt tình giúp đỡtrong thời gian tôi thực hiện đề tài nghiên cứu của mình

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô khoa Sinh học, trường Đại học khoa học tự nhiên đã giảng dạy và tạo điều kiện tốt nhất để tôi có thể thực hiện tốt việc nghiên cứu của mình

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới bố mẹ, gia đình và bạn bè đã luôn giúp

đỡ, ủng hộ tôi trong suốt thời gian qua

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày …… tháng …… năm 2016

Học viên

Nguyễn Xuân Huy

MỤC LỤC

DANH MỤC KÍ HIỆU VÀ VIẾT TẮT 1

DANH MỤC BẢNG 2

DANH MỤC HÌNH 3

MỞ ĐẦU 4

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 6

1.1 Lịch sử nghiên cứu 6

1.2 Bệnh u nguyên bào thần kinh 6

1.2.1 Đặc điểm lâm sàng 6

1.2.2 Phân loại u NBTK 8

1.2.3 Phân loại giai đoạn u NBTK 9

1.2.4 Một số yếu tố tiên lượng của u NBTK 10

1.3 Các biến đổi di truyền liên quan đến bệnh u nguyên bào thần kinh 14

1.3.1 Khuếch đại gen MYCN 14

1.3.2 Các bất thường nhiễm sắc thể 17

1.4 Mô hình di truyền trong u NBTK 19

1.5 Tính cấp thiết của đề tài 20

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

2.1 Đối tượng nghiên cứu 21

2.2 Hóa chất thiết bị 22

2.2.1 Hóa chất 22

2.2.2 Trang thiết bị 22

2.3 Phương pháp nghiên cứu 22

2.3.1 Nuôi cấy tế bào mẫu bệnh phẩm tủy xương 22

2.3.2 Phản ứng lai huỳnh quang tại chỗ 23

2.4 Đạo đức trong nghiên cứu 24

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 26

3.1 Xác định khuếch đại gen MYCN trên bệnh nhân u NBTK bằng kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ (FISH) 26

3.2 Đánh giá khuếch đại gen MYCN với một số yếu tố tiên lượng khác 31

3.2.1 Tỷ lệ khuếch đại gen MYCN theo tuổi 31

3.2.2 Tỷ lệ khuếch đại gen MYCN theo giới tính 33

3.2.3 Tỷ lệ khuếch đại gen MYCN theo mô bệnh học 34

KẾT LUẬN 39

KIẾN NGHỊ 40

TÀI LIỆU THAM KHẢO 41

1 DANH MỤC KÍ HIỆU VÀ VIẾT TẮT

DMs Double-Minute chromatin bodies Đoạn nhiễm sắc thể kép ngắn

FISH Fluorescent in-situ hybridization Kỹ thuật lai huỳnh quang tại

Risk Group Staging System

Hệ thống phân giai đoạn u nguyên bào thần kinh theo nhóm nguy cơ

Staging System

Hệ thống phân giai đoạn u nguyên bào thần kinh

2 DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Các giai đoạn theo INSS 9

Bảng 1.2 Các giai đoạn theo INRGSS 10

Bảng 1.3 Chỉ số MKI 13

Bảng 1.4 Bảng phân loại mô bệnh học 14

Bảng 2.1 Thành phần môi trường nuôi cấy tế bào 22

Bảng 3.1 Kết quả xác định gen MYCN trên bệnh nhân UNBTK 28

Bảng 3.2 Danh sách 11 bệnh nhân u NBTK có khuếch đại gen MYCN 29

Bảng 3.3 Phân bố khuếch đại gen MYCN theo nhóm tuổi 31

Bảng 3.4 Phân bố không khuếch đại gen MYCN theo nhóm tuổi 31

Bảng 3.5 Phân bố khuếch đại gen MYCN theo trạng thái biệt hóa tế bào u NBTK 34

Bảng 3.6 Phân bố không khuếch đại gen MYCN theo trạng thái biệt hóa tế bào u NBTK 35

Bảng 3.7 Phân bố khuếch đại gen MYCN theo phân loại mô bệnh học 36

Bảng 3.8 Phân bố khôngkhuếch đại gen MYCN theo phân loại mô bệnh học 37

3 DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Các vị trí xuất hiện khối u[26] 7

Hình 1.2 Phân loại bệnh nhân theo nhóm nguy cơ [34] 11

Hình 1.3 Cơ chế khuếch đại gen [27] 16

Hình 1.4 Mô hình di truyền về sự phát triển của u nguyên bào thần kinh [10] 19

Hình 2.1 Vị trí đánh dấu huỳnh quang trên nhiễm sắc thể số 2 24

Hình 3.1 Khuếch đại gen MYCN trên tế bào u 26

Hình 3.2 Khuếch đại gen MYCN trên tế bào tủy xương 27

Hình 3.3 Khuếch đại gen MYCN theo 2 dạng HSR và DMs 27

Hình 3.4 Tỷ lệ khuếch đại gen MYCN trên bệnh nhân U NBTK 29

Hình 3.5 Tỷ lệ khuếch đại gen MYCN theo nhóm tuổi 31

Hình 3.6 Tỷ lệ khuếch không đại gen MYCN theo nhóm tuổi 32

Hình 3.7 Tỷ lệ khuếch đại gen MYCN theo giới 33

Hình 3.8 Tỷ lệ khuếch đại gen MYCN theo giới 33

Hình 3.9 Tỷ lệ khuếch đại gen MYCN theo trạng thái biệt hóa tế bào u 34

Hình 3.10 Tỷ lệ không khuếch đại gen MYCN theo trạng thái biệt hóa tế bào u 35

Hình 3.11 Tỷ lệ khuếch đại gen MYCN theo tiên lượng MBH 36

Hình 3.12 Tỷ lệ khuếch đại gen MYCN theo tiên lượng MBH 37

4 MỞ ĐẦU

Ung thư là một rối loạn về phát triển của các tế bào, ở đó các tế bào tăng sinh không kìm hãm, kết quả là hình thành các khối u trong cơ thể Khối u là một tập hợp các tế bào có chung các đặc điểm là phát triển vô tổ chức, xâm lấn và chèn ép vào các

cơ quan tổ chức xung quanh Ung thư có thể xảy ra ở mọi lứa tuổi,trong đó ung thư nhi chiếm khoảng 2% tổng số các loại ung thư

U nguyên bào thần kinh là dạng khối u bào thai c ủa hệ thần kinh giao cảm, ở đó

tế bào khởi đầu là các tế bào tiền thân đang phát triển và chưa biệt hóa xuất phát từ mô mào thần kinh, chủ yếu xảy ra ở trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ (dưới 6 tuổi), hiếm khi tìm thấy trên trẻ hơn 10 tuổi Bê ̣nh chiếm khoảng 7% số ca ung thư ở trẻ em trên toàn th ế giới [43] Tỷ lệ mắc mới tại bệnh viện Nhi Trung Ương là khoảng 50 ca/năm Con số này

ổn định trong nhiều năm gần đây Độ tuổi chẩn đoán của bệnhtrung bình là 18 tháng Các biến đổi di truyền ở các tế bào ung thư rất phong phú, từ các bất thường về cấu trúc, số lượng nhiễm sắc thể đến các đột biến gen; dẫn đến làm thay đổi hoạt động của tế bào Tuy nhiên, có một vài chuyển đoạn hay đột biến gen là đặc trưng của một loại ung thư nhất định, ví dụ như 90% bệnh nhân mắc u lympho thể Burkitt có chuyển đoa ̣n đă ̣c trư ng t(8;14) (đầu của nhiễm sắc thể 8 đã được chuyển đến phần cuối của nhiễm sắc thể 14) hay 20-25% bệnh nhân u nguyên bào thần kinh có đột biến khuếch

đại gen MYCN[40]

Hiện nay các bất thường di truyền này được sử dụng rộng rãi trên thế giới trong việc tiên lượng và phân nhóm nguy cơ cho các b ệnh nhân u nguyên bào thần kinh Tuy vậy, ở Việt Nam, việc phát hiện các biến đổi di truyền này vẫn chưa được thực hiện, gây nhiều khó khăn cho các bác sĩ lâm sàng trong vi ệc tiên lượng bê ̣nh và lựa chọn phác đồ đi ều trị cho bệnh nhân Vì vậy, từ nhiều năm nay, việc cần thiết có các xét nghiệm di truyền cho bệnh u nguyên bào thần kinh luôn được đặt ra

Xuất phát từ yêu cầu lâm sàng thực tiễn như vậy, nghiên cứu đề tài “Xác định sự khuếch đại gen MYCN ở bệnh nhân u nguyên bào thần kinh bằng kĩ thuật lai huỳnh quang tại chỗ” được thực hiện với các mục tiêu sau:

- Phát hiện được sự khuếch đại gen MYCN ở bệnh nhân u nguyên bào thần kinh bằng kĩ thuật lai huỳnh quang tại chỗ

- Xác định đượcsự liên quan với các yếu tố tiên lượng khác và ý nghĩa khuếch đại gen MYCN

1 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Lịch sử nghiên cứu

U nguyên bào thần kinh (Neuroblastoma – u NBTK) được mô tả là bệnh ung thư tiến triển Các tế bào thần kinh chưa trưởng thành được tìm thấy trong bào thai hoặc thai nhi, được gọi là các tế bào nguyên bào thần kinh (Neuroblast) Năm 1864, bác sĩ người Đức tên là Rudoft Virchow phát hiện các khối u được tìm thấy trong ổ bụng của trẻ em mắc bệnh u thần kinh đệm (glioma) Năm 1910, James Horner-Wright, một nhà giải phẫu bệnh ở Boston (Hoa Kỳ), đã công bố một mô tả một loạt khối u thượng thận

ở trẻ em, có đặc điểm tế bào giống với các tế bào thần kinh nguyên thủy của tuyến tủy thượng thận bào thai Vì vậy, ông đã đặt tên hiện tượng này là “u nguyên bào thần kinh”[31] Các kiểu di căn của u NBTK cũng được mô tả với công bố của bác sĩ William Pepper về các nốt di căn gan của trẻ u NBTK giai đoạn 4S và công bố của bác sĩ Robert Hutchison về các ổ di căn tại mắt [31]

UNBTK ban đầu được phẫu thuật cắt bỏ và xạ trị tại Bệnh viện Nhi Boston từ những năm 1940 [31] Đồng thời, giá trị tiên lượng của tuổi chẩn đoán và di căn xương cũng được xác định Hóa trị liệu bắt đầu được sử dụng vào năm 1951 bởi Farber [17]và 1964 bởi Thurman[34] với một vài thành công bước đầu

1.2 Bệnh u nguyên bào thần kinh

U nguyên bào thần kinh là dạng khối u bào thai c ủa hệ thần kinh giao cảm Ở đó

tế bào khởi đầu là các tế bào tiền thân đang phát triển và chưa biệt hóa xuất phát từ mô mào thần kinh Chính vì thế, u NBTK thường xảy ra ở trẻ nhỏ[10]

Tỷ lệ mắc mới của u NBTK là 10,2 ca trên một triệu trẻ em dưới 15 tuổi; là một trong những dạng ung thư phổ biến nhất được chẩn đoán trong năm đầu tiên của cuộc đời [8, 10, 32]

1.2.1 Đặc điểm lâm sàng

Khối u bắt nguồn từ các mô c ủa hệ thần kinh giao cảm, điển hình là từ tủy tuyến thượng thận và các hạch thần kinh dọc hai bên cột sống, và vì vậy u có thể xuất hiê ̣n ở nhiều vi ̣ trí khác nhau như ở cổ, ngực, bụng và tiểu khung

Hình 1.1 Các vị trí xuất hiện khối u[26]

Các biểu hiện lâm sàng rất đa da ̣ng phu ̣ thuô ̣c vào vi ̣ trí u tiên phát và các biểu hiê ̣n di căn Các triệu chứng như chướng bụng, đau bụng, nôn và kém ăn hay gặp trường hợp u ổ bụng Các khối u ở lồng ngực thường được chẩn đoán một cách tình cờ khi bệnh nhân được chụp X quang tim phổi trong những trường hợp chấn thương hay nhiễm trùng Trong các trường hợp khác, bệnh nhân có thể có các bệnh lý hô hấp kèm theo như viêm phổi, tràn dịch màng phổi Các khối u nằm cao trong lồng ngực hay ở

cổ có thể có triệu chứng sụp mi mắt một bên, co đồng tử, giảm tiết mồ hôi (Hội chứng Horner) Những khối u rất to ở cạnh lồng ngực có thể gây chèn ép cơ giới các cơ quan xung quanh[1]

U NBTK di căn theo đường bạch huyết và đường máu Tế bào u theo đường bạch huyết di căn vào hạch lympho khu vực hoặc hạch xa Theo đường máu tế bào u thường di căn vào tủy xương, xương, gan, da, hiếm khi vào phổi hay não[7, 30].Các bệnh nhân ở giai đoạn này thường có biểu hiện toàn thân như sốt, mệt mỏi, sụt cân

Biểu hiện di căn trên lâm sàng ở trẻ dưới 1 tuổi có một số đặc điểm khác biệt với trẻ lớn: hay gặp di căn gan và da, di căn vào tủy xương và xương ít gặp hơn[29, 39].Các

trường hợp di căn não thường có khuếch đại gen MYCN và mô bệnh học không thuận

lợi Các bệnh nhân này có tiến triển xấu, thường nhanh chóng tử vong U NBTK còn

có thể di căn vào phổi, màng phổi[5]

1.2.2 Phân loại u NBTK

ChẩnđoánmôbệnhhọcuNBTKchủyếudựatrênhìnhtháihọc Năm 2003, Hiệp hội

Giải phẫu bệnh U nguyên bào thần kinh Quốc tế (INPC, International Neuroblastoma Pathology Committee) đã thống nhất đưa ra HệthốngphânloaiuNBTKquốctếdựatrêncácbiếnđổihìnhtháiphốihợpvớiquátrìnhbiệthoácũngnhưcácyếutốtiênlượngMBH,phânloạiuNBTKthành4nhómnhưsau[31]

UNBTK(neuroblastoma)là các u mà thành phần mô đệm Schwann chiếm dưới

50% toàn bộ khối u Dựa trên thành phần nguyên bào thần kinh, các u nguyên bào thần kinh được chia thành chưa biệt hóa, ít biệt hóa và đang biệt hóa:

 U nguyên bào thần kinh chưa biệt hóa (undifferentiatedneuroblastoma) chiếm

khoảng 2-3% tổng số u nguyên bào thần kinh

 U nguyên bào thần kinh ít biệt hóa (poorly differentiatedneuroblastoma),

chiếm tới 65-75% các u nguyên bào thần kinh

 U nguyên bào thần kinh đang biệt hóa (differentiatingneuroblastoma) chiếm

khoảng 5% các u nguyên bào thần kinh

UhạchNBTK,hỗnhợp(ganglioneuroblastoma, intermixed) là các khối u giàu mô

đệm Schwann, quá trình biệt hóa chưa hoàn thành, chiếm 2-3% các u nguyên bào thần kinh

UhạchTK(ganglioneuroma) bao gồm u hạch thần kinh đang biệt hóa và u hạch

thần kinh biệt hóa U hạch thần kinh đang biệt hóa là các u mà thành phần mô đệm Schwann chiếm ưu thế chủ yếu kèm theo các tế bào đang biệt hóa (nguyên bào thần kinh, tế bào hạch) và đã biệt hóa hoàn toàn (tế bào hạch trưởng thành) Khác với u hạch nguyên bào thần kinh hỗn hợp, thành phần tế bào ở đây rất ít, không tạo thành các ổ vi thể mà chỉ là các tế bào riêng lẻ pha trộn lẫn vào U hạch thần kinh biệt hóa bao gồm mô đệm Schwann và các tế bào hạch trưởng thành, không có thành phần

nguyên bào thần kinh U hạch thần kinh chiểm tỷ lệ thấp hơn 1% các u nguyên bào thần kinh

UhạchNBTK,nốt(ganglioneuroblastoma, nodular) thường là các ổ nguyên bào

thần kinh chảy máu trên đại thể (nghèo mô đệm Schwann); kèm theo u hạch nguyên bào thần kinh hỗn hợp (giàu mô đệm Schwann) và u hạch thần kinh (mô đệm Schwann chủ yếu)[35]

Ngoài racókhoảng4-5 %các uNBTKkhông xếp loại được

1.2.3 Phân loại giai đoạn u NBTK

Hệ thống phân loại u NBTK được sử dụng rộng rãi hiện nay là hệ thống INSS

(International Neuroblastoma Staging System), sử dụng kết quả của cuộc mổ đầu tiên,

ra đời năm 1988 bởi Brodeur và cộng sự (Bảng 1.1)[41]

Bảng 1.1 Các giai đoạn theo INSS

1 Khối u khu trú có khả năng cắt bỏ hoàn toàn, có hoặc không có tồn

dư bệnh vi thể; biểu hiện qua không di căn hạch bạch huyết 1 bên cơ thể ở mức độ vi thể

2A Khối u khu trú không có khả năng cắt bỏ hoàn toàn, biểu hiện qua

không có di căn hạch bạch huyết ở xa khối u 1 bên cơ thể ở mức độ

vi thể

2B Khối u khu trú có hoặc không có khả năng cắt bỏ hoàn toàn; có di

căn hạch bạch huyết ở xa khối u 1 bên cơ thể Hạch bạch huyết mở rộng đối bên phải không có tế bào u di căn ở mức độ vi thể

3 Khối u 1 bên không thể cắt bỏ đã vượt qua đường giữa cơ thể, có

hoặc không có di căn hạch bạch huyết lân cận

4 Bất kỳ khối u tiên phát nào đã di căn các hạch bạch huyết ở xa, tủy,

tủy xương, gan, và/hoặc các nội tạng khác 4S Khối u tiên phát khu trú, đã di căn có giới hạn đến da, gan và/hoặc

tủy xương (tỷ lệ di căn ít hơn 10%), giới hạn với trẻ nhỏ hơn 12 tháng

Hệ thống phân loại INRGSS (International Neuroblastoma Risk Group Staging System) (Bảng 1.2) sử dụng hệ thống các yếu tố nguy cơ về hình ảnh chặt chẽ[28]

Bảng 1.2 Các giai đoạn theo INRGSS

L1 Khối u khu trú không liên quan đến các tạng thiết yếu và giới hạn ở

một bên của cơ thể L2 Khối u khu trú ở một khu vực kèm theo một hoặc nhiều hơn yếu tố

nguy cơ về hình ảnh

M Bệnh đã di căn xa (trừ giai đoạn MS)

MS Bệnh di căn ở trẻ ít hơn 18 tháng tuổi, và vị trí di căn là da, gan

và/hoặc tủy xương

Tuy nhiên, với INRGSS, giai đoạn MS còn phải xem xét đến 2 yếu tố là tuổi chẩn đoán (từ 12 đến 18 tháng) và khối u tiên phát lớn không thể cắt bỏ được Bên cạnh đó, nghiên cứu một số lượng lớn bệnh nhân đã cho thấy việc sử dụng 18 tháng làm mốc chia nhóm tuổi chẩn đoán có nhiều ý nghĩa với lâm sàng hơn so với việc sử dụng 12 tháng tuổi như trước đó.Hiện nay, việc sử dụng hệ thống phân giai đoạn INSS hay INRGSS tùy thuộc vào cơ sở vật chất và bác sĩ INSS được lựa chọn ở những nơi

có cơ sở vật chất hay bác sĩ chẩn đoán hình ảnh có nhiều hạn chế Do đó, việc xác định giai đoạn sẽ dựa vào phẫu thuật và điều trị sẽ dựa theo phân loại đó Còn ở những nơi có cơ sở vật chất và tay nghề bác sĩ tốt hơn, các nhà lâm sàng lại sử dụng hệ thống INRGSS Vì khi đó, nhiều bệnh nhân không cần có sự can thiệp về y tế mà vẫn có thể khỏi bệnh, đặc biệt là các khối u khu trú ở trẻ ít hơn 1 tuổi

1.2.4 Một số yếu tố tiên lượng của u NBTK

1.2.4.1 Sự khuếch đại gen MYCN

Nhiều biến đổi di truyền đã được xác định ở u NBTK có ý nghĩa tiên lượng bệnh, dựa trên đó có thể xác định được các bệnh nhân có nguy cơ tái phát hoặc có xu

hướng tiến triển nặng Trong đó việc xác định khuếch đại gen MYCN có giá trị tiên

lượng cao được sử dụng để phân nhóm nguy cơ [11]