NGHIÊN CỨU ĐỘT BIẾN GEN TP53 TRÊN BỆNH NHÂN U NGUYÊN BÀO THẦN KINH ĐỆM GLIOBLASTOMA

1 I ĐẶT VẤN ĐỀ U nguyên bào thần kinh đệm (Glioblastoma-GB) khối u não phổ biến nay, chiếm khoảng 12% đến 15% tất khối u não Glioblastoma thường hình thành chất trắng não, phát triển nhanh chóng, thành khối u lớn trước xuất triệu chứng nên biểu lâm sàng hội chứng tăng áp lực nội sọ nặng nề Về mô học, u đặc trưng vùng mô hoại tử, bao quanh tế bào biệt hóa kèm theo tượng tăng sinh mạch [1,2] Tổ chức y tế giới (WHO) phân loại Glioblastoma u tế bào hình (Astrocytoma) cấp IV với độ ác tính cao [3,4] Bệnh nhân mắc loại ung thư thường có tiên lượng khơng tốt tiến triển nhanh chóng xâm lấn tổ chức mô não, thần kinh khối u hộp sọ Tỷ lệ mắc Glioblastoma giới thống kê khoảng 35 ca/100.000 dân Nghiên cứu Richard Johnson cộng cho thấy năm 2010 có khoảng 10.800 bệnh nhân Hoa Kỳ chẩn đoán u nguyên bào thần kinh đệm, có gần 10.000 ca tử vong Tỷ lệ mắc u nguyên bào thần kinh đệm nam giới xấp xỉ 1.6 lần so với nữ giới Tỷ lệ Glioblastoma phát nhiều vào độ tuổi từ 45 đến 62 10% trường hợp ung thư dạng xảy trẻ em [3,4,17] Hiện giới với hiểu biết chế phân tử kết hợp nhiều phương pháp điều trị, có liệu pháp điều trị đích dựa phân tích tình trạng đột biến gen, làm gia tăng đáng kể thời gian sống bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm năm qua Bên cạnh đó, xác định đột biến gen đối tượng huyết thống yếu tố nguy góp phần vào việc làm giảm tỷ lệ mắc ngăn ngừa phát sinh, phát triển ung thư [6, 8,9] Nghiên cứu tổn thương gen u nguyên bào thần kinh đệm công bố khoảng 35 năm trước Trong nhiều năm sau đó, gen đóng vai trò quan trọng bệnh sinh ung thư thụ thể yếu tố phát triển nguyên bào sợi (fibroblast growth factor receptor, FGFR), số gen đánh giá mức độ ác tính biệt hố, hay kiểm sốt phân chia tế bào ung thư RTEL1 Hes3, gen áp chế ung thư TP53 nghiên cứu Dựa tình trạng đột biến gen, nhà khoa học, bác sỹ lâm sàng có nhìn tổng thể nguy cơ, mức độ tiến triển để có biện pháp can thiệp điều trị kịp thời, nâng cao hiệu điều trị theo dõi tiên lượng bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm [6, 8,9] TP53 gen áp chế ung thư nằm đường tín hiệu TP53 đóng vai trò quan trọng việc trì tính ổn định gen tác động yếu tố có hại thương tổn DNA, giảm oxy máu, rối loạn chuyển hóa hay tăng cường hoạt động gen sinh ung thư Khi hoạt động, TP53 có tác dụng sửa chữa thương tổn DNA, thúc đẩy chết tế bào thương tổn DNA sửa chữa Ngồi TP53 kiểm sốt nhiều hoạt động chức khác tế bào thông qua tăng cường hay ức chế chép loạt gen đường tín hiệu TP53 [11,20] Chính vậy, p53 xem trạm gác gen tế bào (guardian genome) Do vậy, gen TP53 bị đột biến, tế bào bị tổn thương DNA không sửa chữa nhân lên khơng giới hạn, sở dẫn đến phát triển khối u ung thư Tỷ lệ đột biến gen TP53 u nguyên bào thần kinh dao động từ 30% đến 35%, tỷ lệ cao khối u thứ phát phát triển từ u thần kinh đệm có mức độ ác tính thấp [26] Đột biến gen TP53 u nguyên bào thần kinh đệm hầu hết đột biến điểm nằm rải rác toàn chiều dài gen TP53 tập trung chủ yếu ba mã hoá codon-175, -248 -273 thuộc exon 5-8 Các dạng đột biến chứng minh có vai trò quan trọng q trình tiến triển xâm lấm ung thư [26] Chính việc xác định đột biến gen TP53 xem marker quan trọng đánh giá tiên lượng điều trị bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm Tại Việt Nam, tỷ lệ người mắc u nguyên bào thần kinh đệm chiếm tỷ lệ lớn, nhiên chưa có nghiên cứu đặc điểm gen đột biến nói chung gen TP53 nói riêng đối tượng bệnh nhân Do đó, phân tích gen TP53 giúp bác sỹ lâm sàng đánh giá nguy mắc loại ung thư ác tính, nâng cao hiệu điều trị tiên lượng , tiến triển bệnh bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm Xuất phát từ lý trên, thực nghiên cứu trạng thái gen biến đổi GB với mục tiêu: Xác định đột biến gen TP53 u nguyên bào thần kinh đệm (Glioblastoma) II TỔNG QUAN 2.1 Tổng quan u não 2.1.1.Triệu chứng lâm sàng Triệu chứng lâm sàng u não đa dạng U não có khoảng thời gian dài khơng có biểu triệu chứng có biểu triệu chứng đau đầu, tính chất dội mơ hồ khơng rõ vị trí đau Tính chất đau đầu u não đau thường xuyên có xu hướng ngày tăng thêm, phát sinh xúc cảm mạnh, ho, đỡ bệnh nhân ngồi dậy mạnh, đau tăng giảm phụ thuộc vào tư đầu Người ta thấy 80% đến 90% bệnh nhân bị u não có đau đầu cục tồn thể Đau đầu cục giải thích yếu tố học chèn ép vào dây thần kinh sọ não xoang tĩnh mạch gây phản xạ co thắt mạch máu não màng não Bruns Busep cho đau đầu toàn thể tăng áp lực nội sọ, kích thích thụ cảm thể thực thông qua tăng áp lực nội sọ chọc não thất cho thuốc chống phù não đau đầu có đỡ Người ta chứng minh tràn dịch não thất gây giãn bên não thất đau đầu biểu nửa đầu bên (Wolff Agdubr) Hội chứng tăng áp lực nội sọ với nhức đầu lan toả, buồn nơn, ói mửa, soi đáy mắt có phù gai thị triệu chứng có giá trị nghĩ đến u não [1, 2,3] Triệu chứng hay gặp u não động kinh - dấu hiệu thần kinh gợi ý nghĩ đến u não khoảng 40% trường hợp Một vài dấu hiệu thần kinh khu trú từ nhẹ đến nặng khác như: - Liệt dây thần kinh sọ đó, yếu tay chân, giảm trí nhớ thị lực giảm gợi ý đến u não - Nơn: Có khoảng 65-68% trường hợp có biểu nơn dấu hiệu tăng áp lực nội sọ Nôn u não có đặc điểm nơn vọt, nơn khơng liên quan với bữa ăn, khơng có biểu đau bụng trước nôn Trong u não hố sau hay gặp nôn nhiều nhất, u lều gặp nhất, chóng mặt đồng thời với nôn buồn nôn gặp u sọ hố sau - Phù gai thị: Phù teo gai thị giác triệu chứng khách quan Khi tăng áp lực nội sọ đè ép vào bó mạch dây thần kinh thị giác dẫn đến ứ máu tĩnh mạch phù gai thị Phù nề gai thị dẫn đến teo gai thị giác, cần phải khám phát sớm hội chứng tăng áp lực nội sọ để tránh di chứng mắt 2.1.2.Triệu chứng cận lâm sàng Hiện nay, u não nói chung GB nói riêng sử dụng phương tiện chẩn đoán cận lâm sàng chẩn đốn hình ảnh chẩn đốn mơ bệnh học X quang hộp sọ: Chụp sọ thấy hình ảnh tăng áp lực nội sọ, đường khớp cách xa nhau, dấu ấn ngón tay lưu ý thời gian tăng áp lực nội sọ từ tháng trở lên dấu hiệu có giá trị Ngồi thấy hình ảnh biến đổi hố yên bào mòn hố yên chất vôi tăng tăng áp lực nội sọ lâu ngày Đối với u sọ hầu thấy u bị ngấm vơi tồn Hình ảnh tiêu xương gặp u dây VIII làm cho lỗ tai rộng thay đổi bờ xương đá Các u màng não ăn khuyết xương sọ Điện não đồ: Đo điện não phát sóng chậm delta, bêta khu vực kết hợp với triệu chứng lâm sàng đắn giúp ta chẩn đốn định khu u não Siêu âm: Siêu âm đường giữa, có dịch chuyển đường từ 1-1,5cm có giá trị chẩn đốn Siêu âm hai chiều hay gọi hiệu Doppler, áp dụng việc chẩn đoán bệnh não trẻ sơ sinh thóp hở, phương pháp siêu âm hai chiều thuận lợi rẻ tiền chẩn đoán u não trẻ em Đối với người lớn khoan lỗ sọ để chẩn đoán Chụp động mạch não: Đây phương tiện chẩn đoán u não thập niên 70, lần Egas Monis thực năm 1927 qua hai đường từ động mạch cảnh (CAG) động mạch đốt sống (VAG) Ngoài người ta chụp động mạch não kỹ thuật Seldinger (1953) chọc kim vào động mạch đùi luồn cathéter lên động mạch đốt sống Sự tăng sinh xô đẩy mạch máu não hình ảnh gián tiếp khối chốn chỗ Chụp cắt lớp vi tính: Hình ảnh vi tính cho phép xác định vị trí, kích thước tổ chức học u não theo S.Wende 3750 trường hợp u não vấn đề chẩn đoán tổ chức học phim cắt lớp vi tính đến 80% trường hợp, loại meningioma chẩn đốn 84% trường hợp loại u Chụp cộng hưởng từ (MRI): Định vị vị trí u não Đánh giá tương quan chiều thương tổn với tổ chức lân cận Chẩn đốn mơ bệnh học: Theo phân loại WHO (2000) u tế bào thần kinh đệm bao gồm u tế hình sao, u tế bào thần kinh đệm nhánh u tế thần kinh đệm lợp ống nội tuỷ U tế hình bao gồm: u tế hình thể long lành tính, u tế bào hình lan toả độ II, u tế bào hình giảm biệt hố (độ III) u ngun bào thần kinh đệm (độ IV) thuộc loại ác tính [9] U nguyên bào thần kinh đệm (Glioblastoma): Các tế bào u nguyên bào thần kinh đệm có nguồn gốc phơi thai giảm biệt hố tăng sản chia thành loại dựa vào nguồn gốc phát sinh u phôi thai tiên phát (60%) u thứ phát từ tế bào hình Hình ảnh đại thể u nguyên bào thần kinh đệm điển hình với ranh giới hình vòng cung khơng rõ rệt, cắt ngang u gặp màu xám hay hồng, có điểm hoại tử màu vàng vùng có xuất huyết máu đỏ màu nâu thẫm Thành mạch máu u tăng sinh dày Có thể gặp u thể nang hay u nhiều ổ, u thường có mật độ mềm cứng xâm lấn dính vào màng não, gây chảy máu Hình ảnh vi thể khối u nguyên bào thần kinh đệm khác Khối u ln dày đặc tế bào, đồng dạng đa hình với nhiều giai đoạn trung gian loại tế bào Tính biệt hố thấp, tạo giảm thiểu nhánh bào tương nhân bắt màu đậm, hình thái thường cho phép chẩn đốn u nguyên bào thần kinh đệm Nhiều tác giả cho thường gặp thể u chủ yếu sau: U nguyên bào thần kinh đệm đa hình: U gồm chủ yếu nguyên bào thần kinh đa hình xen kẽ số neuron vỏ não Các tế bào biệt hố, nhân bắt mầu đậm, thơ, nhiều hình nhân chia, chúng cụm xung quanh số điểm hoại tử nhỏ Mao mạch u thành dày, tăng sản mạnh tế bào nội mô, nhiều điểm xuất huyết rải rác, có chỗ lòng mạch bị chít hẹp tổ chức hố hay vơi hố Hình 2.1 U ngun bào thần kinh đệm nhuộm HE phóng đại 400 lần Nhận xét: tiêu thấy mật độ u dày đặc, đa hình dạng, có dị nhân, nhân qi, nhân chia Tế bào biệt hóa theo hướng khác nhau, hoại tử hình đồ, tăng sinh nội mạch dạng cuộn U nguyên bào thần kinh đệm thể hỗn hợp với sacome xơ: Mô não lành liền kề xen kẽ với tổn thương sát bề mặt u gồm dày đặc tế bào đa hình thái, chủ yếu tế bào dạng thoi, nhánh thần kinh đệm Vùng não lành xung quang thấy có số tế bào u lan tràn, khơng có phản ứng mạch máu U ngun bào thần kinh đệm thể tế bào khổng lồ: U gồm dày đặc tế bào đa hình thái, kích thước to nhỏ khác nhau, phần lớn tế bào tròn nhỏ hay hình van với nhân bắt màu kiềm đậm, thơ, hay gặp hình nhân chia, lác đác số tế bào khổng lồ, kích thước lớn gấp nhiều lần tế bào nhỏ, nhân bắt màu thơ đậm dạng hình tháp đa diện góc tù với hạt nhân rõ, nhiều hình ảnh phân bào Cả loại tế bào tơ thần kinh Trong tổ chức u có nhiều điểm hoại tử thâm nhập vi bào đệm thần kinh, số vùng xuất huyết nhỏ rải rác Quan sát siêu cấu trỳc tế bào glioblast dới kính hiển vi điện tử cho thấy rõ tính chất đa hình (dị hình tế bào nhân) Màng tế bào nhiều nếp gấp khúc, ty thể tăng, nhiều gặp tế bào u có sợi thần kinh đậm bào tơng biểu loạn sản Giảm biệt hoá rõ bào tơng tế bào u thấy mét sè Ýt bµo quan nh líi néi bµo cã hạt, ribosome tự ty thể, đặc biệt nhân lớn, hình dạng kỳ dị, chia nhiều thuỳ tỷ lệ nhân/bào tơng lớn Thờng gặp hình ảnh phân bào tế bào u, phần nhiều nhân chia không điển hình biểu vùng trung tâm nhiễm sắc thĨ dµi ra, kÌm theo teo nhá trung thĨ [1,3] Thể u tế bào khổng lồ hay đa nhân thờng gặp u nguyên bào thần kinh đệm số tác giả lại phân nhiều nhóm, nhóm tế bào u khổng lồ tăng sản mạnh thờng đợc coi ung th ác tính, bào tơng gian bào tế bào u thể thờng gặp thể vùi Hình ảnh siêu cấu trúc cho thấy vùi nhân Nghiên cứu siêu cấu trúc tế bào u cho biết tổn thơng mức siêu vi, hệ thống nội bào đặc biệt mẫn cảm màng tế bào, máy hô hấp tế bào ty thể, hệ thống sinh tổng hợp protein gen nhân tế bào Mạch máu u nguyên bào thần kinh đệm thay đổi liên quan đến phát triển u vùng lân cận rõ kéo dài Biến đổi hình thái quan trọng tăng sản nội mô mạch máu nhỏ nuôi u, đặc biệt gặp búi tế bào nội mô xếp cụm lại Nhân tế bào nội mô trải rộng hay gặp hình phân chia Đôi thấy số biến đổi nh điểm mao mạch thành dày lòng mạch giãn tạo hình ¶nh m¹ch 2.1.3.Tỷ lệ mắc u não NhiỊu thèng kê cho thấy tỷ lệ mắc u não dao động từ 1020/100.000 dân năm Theo nhiều tác giả, tỷ lệ mắc u não đợc phát tăng lên hai thập niên vừa qua nhờ có phơng pháp chẩn đoán sớm, đại nh chụp ct lớp vi tính, chụp cộng hưởng từ Tại Hoa Kỳ, 16.800 ca u não đợc chẩn đoán năm 1999, năm có 13.100 ngời chết u não nguyên phát 100.000 ngời chết u di vào hộp sọ từ ung th quan khác Phân loại theo giới tính lứa ti cho thÊy nam giíi thêng m¾c u n·o nhiỊu n gii, ngoại trừ u màng não thờng gặp nữ nhiều nam Tỷ lệ mắc u não tăng theo tuổi, nhiều từ 65 đến 74 tuổi U não nguyên phát trẻ em chiếm khoảng 10%, hay gặp trớc tuổi, riêng mô học nhóm u thờng gặp u tế bào hình thể lông u nguyên tuỷ bào (Médulloblastome) Tần suất mắc u não theo phân loại hình thái mô học gồm loại nguyên phát thứ phát U thứ phát có nguồn gốc từ quan khác thể di vào não nh từ phổi, vú, đờng tiêu hoá, biểu bì khối u ác tính U nguyên phát có nguồn gốc từ não, màng não tuyến sọ Theo P.Muller St.Michael u tế bào thần kinh đệm thờng gặp chiếm khoảng 50%, u màng não 20%, u tuyến yên 10%, lại khối u khác Trong số khối u ác tính có khoảng 8/10 u tế bào thần kinh đệm [1,3] 2.1.4 Nguyên tắc điều trị phòng bệnh 10 Điều trị chủ yếu phẫu thuật cắt khối u, tia xạ, hoá chất điều trị triệu chứng Tuy nhiên can thiệp đem lại kết hạn chế Phẫu thuật: Mục tiêu việc phẫu thuật loại bỏ u không gây tổn thương đến tổ chức não lành Tuy nhiên mục tiêu đạt hay khơng phụ thuộc vào vị trí u nơng hay sâu, u có giới hạn rõ hay khơng Liên quan với u, khối lượng u trình độ chuyên khoa phẫu thuật viên Nhờ chụp cắt lớp vi tính kính hiển vi phẫu thuật người ta lấy bỏ u cách triệt để Tuy nhiên loại u lấy bỏ triệt để được, u màng não có giới hạn rõ lấy phần U não sâu, hành não, thân não, mạch máu lớn, sọ việc lấy bỏ u khó khăn gần trung khu hơ hấp, tim mạch khó cầm máu Điều trị tia xạ: Tia phóng xạ trước hết dùng để diệt tế bào ác tính lại sau cắt bỏ u ác tính sâu mà người ta phẫu thuật tối thiểu Stereotaxy với kết giải phẫu bệnh kèm theo Người ta dùng để ngăn khơng cho u lành tính tương đối lành tính tái phát Adenoma tuyến n Craniopharynoma Nói chung năm qua điều trị u não tia phóng xạ có bước tiến đáng kể tiến trang thiết bị máy móc Hiện nay, người ta dùng dao gamma điều trị u não, phẫu thuật an toàn, hiệu cao Điều trị hoá chất: Hiện kết điều trị u ác tính hố chất đáng khích lệ, u mô não chưa thay đổi rõ rệt tiên lượng Người ta khuyên nên dùng hố chất trường hợp u ác tính phát triển nhanh, cụ thể loại Glioblastoma, Astrocytoma độ III độ IV Nhiều tác giả cho hoá chất làm cho kết điều trị tốt Các hoá chất dùng điều trị u não kể vài loại sau: Cyclophosphamide (Endoxan), Fluoro-Uracyle (5FU), Methotrexate 28 Hình 4.3 Kết giải trình tự gen mẫu bệnh nhân mã GB20 - Chúng phát đột biến gene mẫu GB16,GB17,GB18 với kết sau + Kết giải trình tự exon gen p53 bệnh nhân GB16 Hình 4.4 Đột biến exon gen p53 bệnh nhân GB16 Nhận xét: Bệnh nhân GB16 xác định đột biến điểm, đột biến vị trí Nucleotid 18,722 codon264 Đột biến T > G, biến đổi A;T > C:G, thay đổi acid amin Leucin (CTA) > Agrinin (CGA), loại đột biến sai nghĩa + Kết giải trình tự exon gen p53 bệnh nhân GB17 29 Hình 4.5 Hình ảnh đột biến exon gen p53 bệnh nhân GB17 Nhận xét: Bệnh nhân GB17 xác định đột biến dị hợp tử, đột biến vị trí Nucleotid 18,778 codon283 Đột biến C > G,biến đổi C:G>G:C biến đổi acid amin Agrinin (CGC) > Glycin (GGC), đột biến sai nghĩa + Kết giải trình tự exon gen p53 bệnh nhân GB18 Hình 4.6 Hình ảnh đột biến exon gen p53 bệnh nhân GB18 Nhận xét: Bệnh nhân GB18 xác định đột biến dị hợp tử, đột biến vị trí Nucleotid 18,763 codon278 Đột biến C > G, biến đổi C:G>G:C,biến đổi acid amin Proline(CCT) > Alanin(GCT), đột biến sai nghĩa V BÀN LUẬN 30 5.1 Một số đặc điểm nhóm bệnh nhân - Về tuổi: Trong nghiên cứu này, tiến hành thu thập 20 mẫu bệnh nhân ung thư nguyên bào thần kinh đệm (Glioblastoma) theo tiêu chuẩn lựa chọn, Trong có 9/20 bệnh nhân nghiên cứu có độ tuổi 50 tuổi Tuổi trung bình nhóm bệnh 51,6 tuổi Theo nghiên cứu Nagpal cs (2006) 11 bệnh nhân, tuổi trung bình chẩn đốn ung thư ngun bào thần kinh đệm (Gliblastoma) 51 tuổi (dao động từ 27-70 tuổi) [21] Nghiên cứu Shiraishi cs (2001) đưa độ tuổi trung bình bệnh nhân ung thư nguyên bào thần kinh đệm 54,9 tuổi ± 2,3 [25] Như nhóm bệnh nhân nghiên cứu chúng tơi có độ tuổi tương tự với kết nghiên cứu Gulie Nagpal Shoji Shiraishi - Về đặc điểm mô bệnh học: 20 bệnh nhân nghiên cứu chúng tơi có kết giải phẫu bệnh ung nguyên bào thần kinh đệm, theo thang độ IV WHO Kết phù hợp với nghiên cứu giới nghiên cứu Gulie Nagpal (2006) Shoji Shiraishi (2001) [21,25] 5.2 Xây dựng quy trình xác định đột biến gen exon gen p53 U nguyên bào thần kinh đệm (Glioblastoma) chiếm 75% u nguyên bào thần kinh đệm bậc cao não Đây u ác tính nguyên phát thần kinh trung ương, lâm sàng hay gặp bệnh có tính chất xâm lấn lan toả vào nhu mơ não Tiên lượng bệnh xấu, yếu tố tiên lượng bao gồm tuổi, thể trạng bệnh nhân, mức độ phẫu thuật điều trị bổ trợ, Thời gian gần khoa học bước đầu có đột phá việc tiên lượng, dự đoán bệnh xét nghiệm xác định đột biến gen giúp bác sĩ lâm sàng chẩn đoán, tiên lượng bệnh sớm giúp kéo dài tuổi thọ cho bệnh nhân [14,16,24] Nguy mắc GB tăng cao chứng minh có liên quan đến đột biến gen TP53 [12,21] 5.2.1.Tách chiết DNA 31 Để áp dụng kỹ thuật vào chẩn đốn bệnh lý di truyền tách chiết DNA khâu quan trọng Nếu phân tử DNA tách chiết tốt, không bị đứt gãy, khơng bị nhiễm phản ứng có độ xác cao Trong nghiên cứu này, sử dụng phương pháp tách chiết DNA mơ theo quy trình phenol/chloroform tương tự quy trình tách chiết DNA từ máu Theo Adelli K, quy trình phenol/chloroform nhiều thời gian công sức phân tử DNA thu có số lượng chất lượng tốt [5,7] Điều khẳng định kiểm tra kết tách chiết DNA máy quang phổ nồng độ DNA thu cao: 146,8 ng/µl, cao 2137,6 ng/µl Độ tinh thể qua giá trị A260/A280 nằm giá trị 1,8-2,0 Sự không đồng nồng độ DNA lấy q nhiều mẫu mơ ung thư, lấy q mơ q trình tách chiết DNA Tuy nhiên tất mẫu đạt nồng độ 50ng/μl Như vậy, mẫu DNA tách chiết tinh sạch, có nồng độ đạt yêu cầu cho phản ứng PCR diễn tối ưu 5.2.2 Kĩ thuật PCR lồng Khi tách chiết DNA đạt yêu cầu, chúng tơi tiến hành chuẩn hóa quy trình PCR nhằm khuếch đại exon gen TP53 Mồi exon gen p53 lấy theo nghiên cứu Eung Bae Lee cộng (2010) kiểm nghiệm qua kết giải trình tự gen [11] Do để có sản phẩm PCR mong muốn, chu trình nhiệt phản ứng cần chuẩn hóa Trong nhiệt độ gắn mồi (Tm) thời gian gắn mồi nhân tố định, đặc biệt quan trọng, ảnh hưởng tới kết cuối phản ứng PCR Tm nhiệt độ nửa số lượng mồi gắn với gen đích vị trí đặc hiệu [5,7] Giá trị Tm xác định dựa số lượng bốn loại nucleotid A, T, G, C đoạn mồi xi mồi ngược Do có nhiều phương pháp tính Tm nên để chuẩn hóa quy trình phản ứng, ta cần chọn giá trị Tm tốt Chúng tơi tiến hành dò nhiệt độ gắn mồi 57oC 30 giây theo khuyến cáo nhà sản xuất Kết điện di sản phầm PCR lần xuất băng điện di mờ có kích thước khoảng 546 bp khơng có sản phẩm Ngun nhân nhiệt độ gắn mồi chưa tối 32 ưu, yếu tố nhiễu làm ức chế phản ứng PCR Bước thực thay đổi nhiệt độ gắn mồi ± oC kết không thu sản phẩm PCR Chứng tỏ nhiệt độ gắn mồi 57oC nhiệt độ gắn mồi tối ưu Chúng tơi thấy nồng độ DNA thu sau tách chiết chưa loại bỏ hết paraffin nguyên nhân ức chế phản ứng PCR Vì chúng tơi tiếp tục tiến hành PCR lần nhằm mục đích làm giảm yếu tố nhiễu Kết PCR lần thu có nhât băng điện di sáng, gọn phù hợp với kích thước PCR lần rõ nét Điều chứng tỏ cặp mồi lựa chọn đặc hiệu, phản ứng PCR lồng tối ưu hóa 5.3 Xác định đột biến exon gen P53 5.3.1 Tổng quan nghiên cứu gen TP53 bệnh nhân Glioblastoma Theo thống kê L Hjortsberg cs (2008) có 90 nghiên cứu gen TP53 liên quan đến bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm (Glioblastoma), 645 mẫu mô nghiên cứu, phát 720 đột biến, đột biến mẫu mơ có tỉ lệ cao 545/546 Đề tài chúng tơi có đột biến mẫu mơ khác nhau, cho thấy phù hợp đột biến chung giới [15] Bảng 5.1 Nghiên cứu gen p53 bệnh nhân Glioblastoma giới Tổng quan nghiên cứu gen p53 bệnh nhân Glioblastoma giới Tổng số nghiên cứu 90 Số mẫu mô nghiên cứu 645 Số đột biến phát 720 Số mẫu mô có đột biến 545 Số mẫu mơ có đột biến 50 Số mẫu mơ có đột biến 10 5.3.2 Tần suất đột biến exon 33 Trong nghiên cứu chúng tơi có bệnh nhân đột biến exon 8, tỷ lệ 3/20 bệnh nhân Theo nghiên cứu Shiraishi S cộng (2002) số bệnh nhân đột biến 55 tổng số 131 bệnh nhân [25] Theo thống kê IARC (2013) tỷ lệ đột biến exon bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm chiếm khoảng 28% Có khác biệt nghiên cứu với nghiên cứu khác giới cỡ mẫu chúng tơi chưa đủ lớn Hình 5.1.Tỷ lệ đột biến exon gen p53 bệnh nhân GB - Các loại đột biến gen gen p53 Theo thống kê L Hjortsberg cs (2008) bảng 5.2 đột chiếm tỷ lệ cao đột biến sai nghĩa 89%, đột biến vô nghĩa với tỉ lệ thấp 3% Nghiên cứu phát đột biến gồm: đột biến vô nghĩa, đột biến sai nghĩa, phù hợp với nghiên cứu giới [15] Bảng 5.2 Các loại đột biến gen TP53 bệnh nhân GB giới Các loại đột biến gen TP53 nghiên cứu giới Đột biến Số lượng Tỷ lệ Sai nghĩa 602 89% Vô nghĩa 22 3% Dịch khung 50 7% Đa hình 1% Tổng 675 100% - Vị trí codon bị đột biến Theo thống kê L Hjortsberg cs (2008) [15] codon hay phát đột biến condon 273, codon 175, codon 248, codon 282 34 Bảng 5.3 Đột biến codon thường gặp gen p53 Codon Condon Condon acid amin bình thường Sau đột biến bình thường Acid amin sau đột biến 273 CGT TGT Arg Cys 175 CGC CAC Arg His 248 CGG CAG Arg Gln 273 CGT CAT Arg His 248 CGG TGG Arg Trp 282 CGG TGG Arg Trp 245 GGC AGC Gly Ser 220 TAT TGT Tyr Cys 237 ATG ATA Met Ile 158 CGC CAC Arg His Hình 5.2 Mơ tả tổng quan đột biến codon giới Theo thống kê IARC đến tháng 11 năm 2013 850 đột biến phát hiện, chưa phát đột biến codon 264, codon 278 khoảng (1,8%), codon 283 khoảng (0,25%) Các codon có tần suất đột biến cao codon 245 35 (3,75%), codon 282 (4,25%) , codon 175 (7%), codon 248 (8,75%), codon 273 (12,5%) [13] Trong nghiên cứu xác định đột biến codon 264, codon 278, codon 283 - Các loại đột biến nucleotid Nghiên cứu chúng tơi có đột biến nucleotdid, đột biến :T:A> C:G đột biến C:G >G:C IARC (2013) thống kê đột biến G:C > A:T CpG – 340 với tỷ lệ cao 38,9%, đột biến A:T>G:C – 93 với tỷ lệ thứ cao thứ (10,64%) [13] Hình 5.3 Các loại đột biến nucleotid theo IARC (2013) VI KẾT LUẬN 36 Xác định đột biến sai nghĩa, vị trí codon 264, codon 278, codon 283 Trong đột biến codon 264 chưa mô tả IARC (2013) VII KIẾN NGHỊ 37 Đề tài cần tiến quy mô rộng để xác định tỉ lệ đột biến gen TP53 bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm (Glioblastoma) Đề tài tiếp tục nghiên cứu để đánh giá mối liên quan đột biến gen TP53 với biểu lâm sàng LỜI CAM ĐOAN Chúng tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu khoa học tiến hành cách trung thực khách quan Số liệu luận văn chưa công bố nghiên cứu khác Chúng tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm với lời cam đoan Hà Nội, 19 tháng năm 2015 Chủ nhiệm đề tài Trần Văn Khôi MỤC LỤC I ĐẶT VẤN ĐỀ II TỔNG QUAN .4 2.1 Tổng quan u não 2.1.1.Triệu chứng lâm sàng 2.1.2.Triệu chứng cận lâm sàng 2.1.3.Tỷ lệ mắc u não 2.1.4 Nguyên tắc điều trị phòng bệnh .9 2.2 Cơ chế bệnh sinh u não 11 2.2.1 Các yếu tố liên quan đến bệnh sinh u não 11 2.2.2 Cơ chế bệnh sinh .12 2.2.3 Gen TP53 12 2.3 Kỹ thuật phân tích gen chẩn đốn Glioblastoma .13 2.3.1 Kỹ thuật khuếch đại gen - polymerase chain reaction (PCR) 13 2.3.2 PCR lồng 14 2.3.3 Phương pháp giải trình tự gen máy tự động .17 III ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 3.1 Đối tượng nghiên cứu 18 3.2 Thời gian địa điểm nghiên cứu .18 3.3 Phương pháp nghiên cứu: 18 3.4 Vấn đề đạo đức đề tài 24 IV KẾT QUẢ 24 4.1 Một số đặc điểm bệnh nhân nghiên cứu 24 4.1.1 Đặc điểm tuổi .24 4.2 Áp dụng qui trình xác định đột biến gen 25 4.2.1 Kết tách chiết DNA 25 4.2.2.Kết PCR lồng 26 4.2.3 Kết giải trình tự gen 27 V BÀN LUẬN 29 5.1 Một số đặc điểm nhóm bệnh nhân 30 5.2 Xây dựng quy trình xác định đột biến gen exon gen p53 .30 5.2.1.Tách chiết DNA 30 5.2.2 Kĩ thuật PCR lồng .31 5.3 Xác định đột biến exon gen P53 32 5.3.1 Tổng quan nghiên cứu gen TP53 bệnh nhân Glioblastoma .32 5.3.2 Tần suất đột biến exon 32 VI KẾT LUẬN 35 VII KIẾN NGHỊ .36 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC BẢNG 2.1 Tổng quan u não 2.2 Cơ chế bệnh sinh u não 11 2.3 Kỹ thuật phân tích gen chẩn đốn Glioblastoma 13 3.1 Đối tượng nghiên cứu .18 3.2 Thời gian địa điểm nghiên cứu 18 3.3 Phương pháp nghiên cứu: 18 Thiết kế nghiên cứu 18 Đo mật độ quang học 21 Khuếch đại đoạn gen Tp53 kỹ thuật PCR lồng 21 Bảng 2.1.Thành phần phản ứng 22 - Nguyên lý: Điện di tượng phân tử mang điện dịch chuyển điện trường tác dụng dòng điện, phân tử tích điện âm di chuyển cực (+) phân tử tích điện dương dịch chuyển cực (-) 22 3.4 Vấn đề đạo đức đề tài 24 4.1 Một số đặc điểm bệnh nhân nghiên cứu .24 Bảng 4.1 Đặc điểm nhóm tuổi bệnh nhân 24 4.2 Áp dụng qui trình xác định đột biến gen 25 Bảng 4.2 Kết chiết tách DNA 25 Nhận xét: Băng điện di rõ nét, kích thước, khơng có sản phẩm phụ Phản ứng PCR khuyếch đại đoạn DNA đích 27 5.1 Một số đặc điểm nhóm bệnh nhân .30 5.2 Xây dựng quy trình xác định đột biến gen exon gen p53 30 5.3 Xác định đột biến exon gen P53 32 Bảng 5.1 Nghiên cứu gen p53 bệnh nhân Glioblastoma giới .32 Bảng 5.2 Các loại đột biến gen TP53 bệnh nhân GB giới .33 Bảng 5.3 Đột biến codon thường gặp gen p53 .34 DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 U ngun bào thần kinh đệm nhuộm HE phóng đại 400 lần Nhận xét: tiêu thấy mật độ u dày đặc, đa hình dạng, có dị nhân, nhân quái, nhân chia Tế bào biệt hóa theo hướng khác nhau, hoại tử hình đồ, tăng sinh nội mạch dạng cuộn Hình 2.2 Sơ đồ PCR lồng 16 Hình 4.1 Kết đo quang nồng độ DNA bệnh nhân GB17 .26 Hình 4.2 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR gel agarose 1,5% 27 Hình 4.3 Kết giải trình tự gen mẫu bệnh nhân mã GB20 28 Hình 4.4 Đột biến exon gen p53 bệnh nhân GB16 28 Hình 4.5 Hình ảnh đột biến exon gen p53 bệnh nhân GB17 29 Hình 4.6 Hình ảnh đột biến exon gen p53 bệnh nhân GB18 29 Hình 5.1.Tỷ lệ đột biến exon gen p53 bệnh nhân GB 33 Hình 5.2 Mơ tả tổng quan đột biến codon giới .34 Hình 5.3 Các loại đột biến nucleotid theo IARC (2013) 35 ... gặp u nguyên bào thần kinh đệm đột biến điểm từ exon đến Hiện Việt Nam chưa có nghiên c u gen TP53 bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm Chúng tiến hành nghiên c u gen bệnh nhân u nguyên bào thần. .. biệt u nguyên bào thần kinh đệm Trên giới, nhi u nghiên c u chứng minh u nguyên bào thần kinh đệm có liên quan đến nhi u gen khác nhau, có TP53 Tỷ lệ đột biến TP53 GB khoảng 30% đến 35% Các đột biến. .. hi u đi u trị tiên lượng , tiến triển bệnh bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm Xuất phát từ lý trên, thực nghiên c u trạng thái gen biến đổi GB với mục ti u: Xác định đột biến gen TP53 u nguyên