Nghiên cứu đột biến gen trên bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm

1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI BỘ Y TẾ NGUYỄN THỊ THƠM NGHIÊN CỨU ĐỘT BIẾN GEN TRÊN BỆNH NHÂN U NGUYÊN BÀO THẦN KINH ĐỆM LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC HÀ NỘI - 2019 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI BỘ Y TẾ NGUYỄN THỊ THƠM NGHIÊN CỨU ĐỘT BIẾN GEN TRÊN BỆNH NHÂN U NGUYÊN BÀO THẦN KINH ĐỆM Chuyên ngành : Hóa sinh Mã số : 62720112 LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS ĐẶNG THỊ NGỌC DUNG HÀ NỘI - 2019 LỜI CAM ĐOAN Tơi Nguyễn Thị Thơm, nghiên cứu sinh khố 34 Trường Đại học Y Hà Nội, Chuyên ngành Hoá sinh Y học, xin cam đoan: Đây luận án thân trực tiếp thực hướng dẫn Cô Đặng Thị Ngọc Dung Cơng trình khơng trùng lặp với nghiên cứu khác công bố Việt Nam Các số liệu thông tin nghiên cứu hồn tồn xác, trung thực khách quan, xác nhận chấp thuận sở nơi nghiên cứu Tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm trước pháp luật cam kết Hà Nội, ngày 10 tháng 12 năm 2019 Người viết cam đoan Nguyễn Thị Thơm DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Bp CBTRUS DNA dNTP EGFR Base pair Central Brain Tumor Registry of Cặp base nitơ Trung tâm quản lý u não Hoa the United States Kỳ Deoxyribonucleic Acid Axit Deoxyribonucleic Deoxynucleoside triphosphate Nucleotid tự Epidermal Growth Factor Receptor Thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu bì FGFR Fibroblast Growth Factor Receptor Thụ thể yếu tố tăng trưởng nguyên bào sợi IDH Isocitrate dehydrogenase Enzym Isocitrate dehydrogenase MGMT Methylguanine DNA Enzym Methylguanine DNA methyltransferase methyltransferase Multiplex Ligation - dependent Khuếch đại DNA đầu dò đa Probe Amplifcation mồi RNA messenger Polymerase Chain Reaction Transforming, Acidic Coiled-Coil RNA thông tin Chuỗi phản ứng enzym Gen mã hoá Protein Acidic Containing Protein Coiled-Coil Containing TP53 Tumor protein 53 Gen ức chế khối u TP53 RNA Ribonucleic Acid Axit Ribonucleic RTK Receptor tyrosin kinase Thụ thể nội bào MLPA mRNA PCR TACC UNBTK U nguyên bào thần kinh đệm Đ MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ Tế bào thần kinh đệm xem mô liên kết hệ thần kinh trung ương người, với số lượng nhiều gấp 10 đến 50 lần so với số lượng neuron thần kinh Các tế bào thần kinh đệm công nhận vai trò thơng tin liên lạc hệ thần kinh trung ương hợp tác với neuron [1] U nguyên bào thần kinh đệm (UNBTKĐ) phát triển từ tế bào thần kinh đệm chưa biệt hóa biệt hóa thấp não [2], 100% ác tính WHO xếp vào nhóm u ác tính độ IV [3]; tỷ lệ mắc hàng năm khoảng 3,2/100000 dân, chiếm tỷ lệ cao loại u não ác tính nguyên phát (46,6%), bệnh tiến triển nhanh, người bệnh UNBTKĐ có thời gian sống trung bình tháng đến năm điều trị tích cực, tỷ lệ sống sau năm thấp khoảng 5,5% [4] Cơ chế sinh bệnh UNBTKĐ biết đến đa phần đột biến gen, gây rối loạn thông tin di truyền tế bào, tế bào tăng sinh, không ngừng phân chia phát sinh khối u, ung thư [5],[6],[7] Một tế bào bình thường để chuyển dạng sang tế bào ung thư phải trải qua vài đột biến số gen định Quá trình liên quan đến hệ thống gen sinh ung thư gen kháng ung thư Bình thường gen sinh ung thư kiểm soát hoạt động tế bào theo hướng tích cực, mã hóa protein truyền tín hiệu phân bào, gen bị đột biến truyền tín hiệu phân bào sai lạc mà thể khơng kiểm sốt dẫn đến sinh ung thư, ví dụ gen EGFR, FGFR, IDH Các gen kháng ung thư trái lại mã hóa cho protein kiểm soát phân bào theo hướng ức chế, làm chu kỳ phân bào dừng pha, thường pha G1; gen kháng ung thư có chức làm biệt hóa tế bào, mã hóa tế bào chết theo chương trình Khi gen kháng ung thư bị bất hoạt đột biến làm biến đổi tế bào lành thành ác tính, ví dụ gen TP53, PTEN… [5] Các nghiên cứu sinh bệnh UNBTKĐ có liên quan đến nhiều gen: gen kháng ung thư gen TP53, PTEN, gen sinh ung thư như: EGFR, FGFR, IDH, MGMT, ATRX, xóa 1p/19q… [8] tập trung nghiên cứu đột biến số gen gen TP53, EGFR, FGFR, đột biến gen TP53, EGFR, FGFR ngồi có tỷ lệ đột biến cao chứng minh đóng vai trò quan trọng chế sinh bệnh phân tử định hướng điều trị bệnh u nguyên bào thần kinh đệm [4],[9],[10],[11] Gen TP53 có vai trò kiểm sốt hoạt động sống chết tế bào theo chu trình Đột biến TP53 liên quan chặt chẽ với tiên lượng xấu cho sống tổng thể bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm, đột biến TP53 làm tăng nhạy cảm với hóa chất temozolomide điều trị bệnh, làm tăng tỉ lệ sống so với điều trị semustine bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm [12],[13] Gen EGFR gen FGFR mã hóa tổng hợp thụ thể màng tế bào có tên gọi protein tyrosin kinase, thụ thể có vai trò tiếp nhận truyền tín hiệu nội bào theo chế phosphoryl hóa, sản phẩm chúng điều hòa tăng sinh, sống còn, biệt hóa vận động tế bào Hoạt động thụ thể kiểm soát điều hòa chặt chẽ Sự rối loạn hoạt động tyrosin kinase đột biến hay biến đổi di truyền khác gây điều hòa hoạt động enzym hậu tế bào trở nên ác tính [5],[6] Một số chất ức chế hoạt động bất thường tyrosin kinase thử nghiệm thành công số ung thư đột biến gen EGFR, FGFR như: ung thư phổi không tế bào nhỏ, ung thư vú, đại tràng [14],[15],[16],[17] Và chất ức chế EGFR, FGFR thử nghiệm bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm, để thử nghiệm thành công định cần phải xác định thay đổi cấu trúc phân tử gen EGFR, FGFR Đây hướng điều trị đích triển vọng điều trị ung thư [18] Nghiên cứu đột biến gen TP53, EGFR, FGFR… sở cho nghiên cứu điều trị đích bệnh UNBTKĐ, cần thiết với thầy thuốc lâm sàng để đưa tiên lượng hướng điều trị tốt cho người bệnh u nguyên bào thần kinh đệm Tại Việt nam chưa thấy có nghiên cứu vấn đề Xuất phát từ lý trên, thực đề tài: "Nghiên cứu đột biến gen bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm", với mục tiêu: Xác định đột biến gen TP53, EGFR, FGFR bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm Phân tích số đặc điểm người bệnh u nguyên bào thần kinh đệm phát thấy đột biến gen CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Đại cương u nguyên bào thần kinh đệm 1.1.1 Tình hình mắc u nguyên bào thần kinh đệm nước giới Tổng thể điều tra mắc UNBTKĐ giới chưa đồng đều, ví dụ Mỹ năm có nghiên cứu báo cáo tình hình mắc bệnh, hay Anh, Phần lan, Đan mạch thường năm báo cáo lần…, song châu lục khác, châu Á hay châu Phi, thống kê bệnh lẻ tẻ Qua báo cáo cho thấy tỷ lệ mắc UNBTKĐ không giống châu lục, nước Châu Âu Mỹ có tỷ lệ mắc cao nước châu Á, Mỹ tỉ lệ mắc hàng năm 3,2/100000 dân [4], tỷ lệ mắc cao Anh (4,64/100.000 dân/năm) [19], nước Bắc Âu số người mắc bệnh giao động từ 3,3 - 5,1/100.000 nam giới 2,1-3,5/100.000 phụ nữ, tỷ lệ mắc bệnh gia tăng hàng năm, tăng trung bình hàng năm nam giới: 9,2% phụ nữ: 8,8%, gia tăng cao nhóm tuổi già nhất, nam 12,4%, nữ 10,5% [20], tỷ lệ mắc thấp Phần Lan 2,0/100.000 người/năm [21] Tại Ấn độ hàng năm có từ 5-10/100,000 dân mắc u não thần kinh trung ương, tỷ lệ mắc UNBTKĐ chiếm 22,8% [22] Tỷ lệ mắc bệnh thấp Hàn quốc 0,66/100000 dân/năm [23] Nam giới thường mắc UNBTKĐ nhiều nữ giới, người da trắng có tỷ lệ mắc bệnh cao người da màu [4] Tại Việt Nam chưa thấy có báo cáo tỷ lệ mắc u nguyên bào thần kinh đệm nước, số nghiên cứu đưa kết cho thấy tỉ lệ bệnh cao: theo thống kê Lê Xuân Trung Nguyễn Như Bằng năm 1975, u nguyên bào thần kinh đệm chiếm 18% 408 ca mổ u não bệnh 10 viện Việt Đức [24] Nghiên cứu Kiều Đình Hùng (2006), loại u thần kinh đệm ác tính UNBTKĐ chiểm tỷ lệ cao 62,7% [25] Nghiên cứu Trần Chiến (2011) tỉ lệ mắc u nguyên bào thần kinh đệm 39,3% số u thần kinh đệm hình sao, nam mắc bệnh cao nữ, tuổi trung bình 43,03 ± 3,37, tuổi hay gặp từ 51-60 tuổi, thấp 13 tuổi, cao 71 tuổi [26] Theo Dương Đại Hà Hà Kim Trung (2014), u nguyên bào thần kinh đệm chiếm 33,3%, có độ tuổi trung bình cao loại u thần kinh đệm [27] Tất nghiên cứu kết luận nam giới mắc bệnh UNBTKĐ cao nữ giới, tỷ lệ mắc tăng theo lứa tuổi [4],[19],[20],[25] Về độ tuổi mắc Việt nam trẻ so với nước: tuổi trung bình mắc UNBTKĐ 43 ± 3,71, tuổi hay gặp từ 51-60 tuổi (28,8%) [26], Mỹ tỷ lệ mắc bệnh cao nhóm 75 tuổi chiếm 24,43% [4] Nhìn chung bệnh u nguyên bào thần kinh đệm ngày gia tăng, gặp nhiều tuổi trung niên trở lên, nam mắc bệnh cao nữ, ác tính tỉ lệ sống thường thấp, khoảng 5,5% sống qua năm [4],[19],[21],[26]… 1.1.2 Phân loại u nguyên bào thần kinh đệm Tổ chức não thần kinh trung ương đa dạng, bao gồm nhiều tuyến, nhiều loại tế bào; tổn thương đa dạng, tùy vị trí, chức mà tế bào đảm nhiệm gây bệnh lý khác nhau, gọi u não song với loại tế bào bị bệnh có biểu dạng hình thái tổn thương Dựa vào vị trí tổn thương định hướng bệnh, dựa vào tổn thương mơ bệnh học xác định xác tổn thương loại tế bào thuộc thể bệnh Từ thực tế lâm sàng bệnh nhà khoa học tổng kết phân loại khối u não thần kinh trung ương theo cách: phân loại theo vị trí khối u phân loại theo tổn thương mô bệnh học 10 33 Wesseling P, Vanden Bent M, Perry A (2015) Oligodendroglioma: pathology, molecular mechanisms and markers Acta Neuropathol, 34 129(6) 809-27 Zhenqiang He, MDa,b, Richard Alan Mitteer Jr, Msa, Yonggao Mou, MDb, Yi Fan, MD, PhDa,c* (2017) Multimodality targeting of glioma 35 cell Glioblastoma, 55-72 Chinot OL, Wick W, Mason W, et al (2014) Bevacizumab plus radiotherapy-temozolomide for newly diognosed glioblastoma N Engl J 36 Med, 370, 709-22 Cloughesy TF, Cavenee WK, Mischel PS (2014) Glioblastoma: from molecular pathology to targeted treatment Annual review of pathology, 37 9,1-25 Wdward W Jung, Mda, John Choi, Medb, Samuel T Chao, Eron S Murphy, John H.Suh, MDc* (2017) Principles and tenets of radiation 38 treatment in glioblastoma Glioblastoma, 105-131 Elena Fomchenko and veronica L.S Chiang (2017) The role of lazerInduced thermal therapy in the management of malignant Malignant 39 Brain Toumors, Springer International Publishing, 103-119 Stewart LA (2002) Chemotherapy in adult high-grade glioma: a systematic review and meta-analysis of individual patient data from 12 40 randomised trial Lancet, 359(9311), 1011-8 Weis Ms, Cheresh DA (2011) Tumor angiogenesis: molecular pathways 41 and therapeutic targets Nat Med, 17,1359-70 Lathia JD, Mack SC, Mulkearns-Hubert EE, et al (2015) Cancer stem 42 cell in glioblastoma Genes Dev, 29, 1203-17 Zheng Q, Han L, Dong Y, et al (2014) JAK2?STAT3 targeted therapy suppresses tumor invasion via disruption of the EGFRvIII/STAT3 axis and asociated focal adhesion in EGFRvIII-expressing glioblastoma Neuro Oncol, 16, 1229-43 147 43 Grossman SA1, Ye X, Piantadosi S et al (2010) Survival of patients with newly diagnosed glioblastoma treated with radiation and temozolomid in 44 research studies in the United States Clin Cancer Res, 16(8), 2443-9 MayA Babu, MD, MBA (2017) Socioeconomics and Survival 45 Glioblastoma, 265-269 McNamara MG, Sahebram S, Mason WP (2013) Emerging biomarkers 46 in glioblastoma Cancers (Basel), 51103-9 Ceccarelli M, barthel FP, Malta TM, et al (2016) Molecular profiling reveals biologically discrete subsets and pathways of progession in 47 diffuse glioma Cell, 164(3), 550-63 McBride OW, Merry D and Givol D (1986) The gene for human p53 cellular tumor antigen is located on chromosome 17 sht arm (17p13) 48 Proc Natl acad Sci USA, 83(1) 130-134 Ken SE et al (1991) Identification of p53 as a sequence-specific DNA- 49 binding protein Sience, 252(5013), 1708-1711 Vogelstein B and Kinzler KW (1992) p53 function and dysfunction 50 Cell, 70, 523-526 Toshinori Ozaki and Akira Nakagawara (2011) Role of p53 in cell Death 51 and human Cancers Cancer, 3, 994-1013 Kalil G Abdullah, MDa, Corey Adamson, MD, PhD, MPHb, Steven Brem, MDa* (2017) The molecular pathogenesis of glioblastoma 52 Glioblastoma, 21-31 Sung T, Miller DC, Hayes RL, Alonso M, Yee H, Newcomb EW (2000) Preferential inactivation of the TP53 tumor suppressor pathway and lack of EGFR amplification distinguish de novo high grade pediatric astrocytomas 53 from de novo adult astrocytomas Brain Pathol, 10, 249-259 Van Meir EG, Kikuchi T et al (1994) Analysis of the p53 Gene and Its 54 Expression in Human Glioblastoma Cells Cancer Research, 54, 649-652 Shoji Shiraishi M.D, Kenji Tada M.D, Yukitaka Ushio M.D et al (2002) Influence of p53 mutations on prognosis of patients with glioblastoma Cancer J, 95(2), 249-257 148 55 Bernard Leroy, Jean Louis Fournier, Thierry Soussi et al (2013) The TP53 website: an integrative resource centre for the TP53 mutation database and TP53 mutant analysis Nucleic Acids Res, 41(Database 56 issue), D962-D969 Linn Hjortsberg and Thierry Soussi (2008) MUT-TP53 2.0: A novel versatile matrix for statistical analysis of TP53 mutations in human 57 cancer Journal: Human Mutation , Manuscript ID 2010-0129 Carpenter G, King Jr, and Cohen S (1978) Epidemal growth factor atimulates phosphoryllation in membrane preparations in vitro 58 Nature, 276, 409-410 Petri E.T, Halmos B, Boggon T.J kuma A (2008) Structure and clinical relevance of the epidermal growth factor receptor in human cancer J 59 clin Oncol, 26(10), 1742-1751 Sliwkowski MX, Yarden Y (2001) Untangling the ErbB signaling 60 network Nat Rev Nol cell biol, 2, 137-2001 Marmor M.D, Skaria K.B and Yarden Y (2004) Signal trandution and oncogennesis by ErbB/HER receptors J Radiat, Oncol, Biol, Phy, 58, 61 903-913 Thorpe LM, Yuzugullu H, Zhao JJ (2015) PI3K in cancer: divergent roles of isoforms, modes of activation and therapeutic targeting Nature 62 reviews Cancer, 15, 7-24 Jeffrey C Lee et al (2006) Epidermal Growth Factor Receptor Activation in Glioblastoma through Novel Missense Mutations in the Extracellular 63 Domain Journal pmed, 3(12), e485 Frederick L, Wang XY, Eley G, James CD (2000) Diversity and frequency of epidermal growth factor receptor mutations in human glioblastomas Cancer Res, 60, 1383-1387 64 Nicola Montano, Tonia Cenci, Roberto Pallini et all (2011) Expression of EGFRvIII in Glioblastoma: Prognostic Significance Revisited Neoplasia, 13(12), 1113-1121 149 65 Shinojima Naoki, Tada K, et al (2003) Prognostic value of epidermal growth factor receptor in patients with glioblastoma multi1forme 66 Cancer Res, 63(20), 6962-6970 Youngmin Choi, Young-Jin Song, Hyung-Sik Lee et al (2013) Epidermal Growth Factor Receptor Is Related to Poor Survival in Glioblastomas: Single-Institution Experience Journal List Yonsei Med, 67 54(1), 101-107 Eskilsson E, Rosland GV, Talasila KM, Knappskog S, Keunen O, Sottoriva A, et al (2016) EGFRvIII mutations can emerge as late and heterogenous events in glioblastoma development and promote 68 angiogenesis through Src activation Neuro-oncology, 18, 1644-1655 Huang PH, Mukasa A et al (2007) Quantitative analysis of EGFRvIII cellular signaling networks reveals a combinatorial therapeutic strategy 69 for glioblastoma Proc Natl Acad Sci, USA, 104(31), 12867-12872 Tuner N and Grose R (2010) Fibroblast growth factor signaling: from 70 development to cancer Nature Rev Cancer, 10, 116-129 Dienstmann R, Rodon J, Prat A et al (2014) Genomic aberrations in the FGFR pathway: opportunities for targeted therapies in solid tumors Ann 71 oncol, 25(3), 552-563 Haugsten E.M, Wiedlocha A, Olsnes S Ellen et al (2010) Roles of Fibroblast Growth Factor Receptors in Carcinogenesis Mol Cancer Res, 72 10, 1158-1541 Agarwala S.S, Kirkwood J.M (2000) Temozolomide, a novel alkylating agent with activity in the central nervous system, may improve the treatment of advanced metastatic melanoma Oncologist, 5(2), 144-151 73 Carrie Marquette, Lisle Nabell (2012) Chemotherapy-Resistant Metastatic 74 Breast Cancer, 13(2), 263-275 Brittany C Parker et al (2013) The tumorigenic FGFR3-TACC3 gene fusion escapes miR-99a regulation in glioblastoma J Clin Invest, 123(2), 855-865 150 75 Devendra Singh, Joseph Minhow Chan, Pietro Zoppoli (2012) Transforming Fusions of FGFR and TACC Genes in Human 76 Glioblastoma National Institutes of Health, US, 1231-1235 Anna Luisa Di Stefano, Alessandra Fucci, Veronique Frattini et al (2015) Detection, characterization and inhibition of FGFR-TACC fusions in IDH wild type glioma Clin Cancer Res, 21(14), 3307-3317 77 Gan HK, Kaye AH, Luwor RB (2009) The EGFRvIII variant in 78 glioblastoma multiforme J Clin Neurosci, 16(6), 748-754 Wantanabe K, Tachibana O, Sata K, et al (1996) Overexpression of the EGF and p53 mutations are mutually exclusive in the evolution of 79 primary and secondary glioblastomas Brain pathol, 6(3), 217-23 Quin T Ostrom, MPH, MA, Peter Liao, BS, MD, Lindsay C.Stetson, Jill S.Barnholtz-Sloan, PhD (2017) Epidemiology of Glioblastoma and 80 trend in Glioblastoma survivoship Glioblastoma, Elsevier, 11-19 Molenaar RJ, Verbaan D, Lamba S, et al (2014) The combination of IDH1 mutations and MGMT methylation status predicts survival in glioblastoma better than either IDH1 or MGMT alone Neuro Oncol, 81 16(9), 1263-73 Brannan CW, Verhaak RG, McKenna A, et al (2013) The somatic 82 genomic landscape of glioblastoma Cell, 155(2),462-77 Suvi V, Jha P, Sharma MC, et al (2011) 06-methylguanine DNA methyltransferase gene promoter methylation in hight grade gliomas: a 83 review of curent status Neurol India, 59(2),229-35 Beiko J, Suki D, HessKR, et al (2014) IDH1 mutant maligant astrocytoma are more amenable to surgical resection and have a survival benefit 84 associated with maximal surgical resection Neuro Oncol, 16, 81-91 Auffinger B, Spencer D, Pytel P, et al (2015) The role of glioma stem cell in chemotherapy resistance and glioblastoma multiforme recurence Expert rev neurother, 15, 741-52 151 85 Eckel-Passow JE, Lachance DH, Molinaro AM, et al (2015) Glioma groups based on 1p/19q, IDH, and TERT promoter mutations in tumors 86 N Engl J Med, 372(26), 2499-508 Tạ Thành Văn (2010) PCR số kỹ thuật sinh học phân tử, Nhà 87 xuất Y học, Hà Nội Mullis K.B and Faloona FA (1987) Specific synthesis of DNA in vitro via a 88 polymerase-catalyzed chain reation Methods Enzymod, 155, 335-50 Judith Jeuken (2009) Robust Detection of EGFR Copy Number Changes and EGFR Variant III: Technical Aspects and Relevance for Glioma 89 Diagnostics Brain Pathol, 19(4), 661-671 Sanger F, Nicklen S, Coulson AR (1977) DNA sequencing with chain- 90 terminating inhibitors Proc Natl Acad Sci USA, 74, 5463-7 Zascavage RR, Shewale SJ, Planz JV (2013) Deep-sequencing technologies 91 and potential applications in forensic DNA testing Forensic Sci Rev, 25, 79-105 Switzeny OJ, Christmann M, Renovanz M, Giese A, Sommer C, Kaina B (2016) MGMT promoter methylation determined by HRM in comparison to MSP and pyrosequencing for predicting high-grade 92 glioma response Clin Epigenetics, 8, 49 Cykowski MD, Allen RA, Fung KM, Harmon MA, Dunn ST (2016) Pyrosequencing of IDH1 and IDH2 mutations in brain tumors and non- 93 neoplastic conditions Diagn Mol Pathol, 21, 214-20 Quillien V, Lavenu A, Ducray F et al (2016) Validation of the highperformance of pyrosequencing for clinical MGMT testing on a cohort of glioblastoma patients from a prospective dedicated multicentric 94 trial Oncotarget, 7, 61916-29 Roger H Frankel, William Bayona, Maxim Koslow, and Elizabeth W (1992) p53 Mutations in Human Malignant Gliomas: Comparison of Loss of Heterozygosity with Mutation Frequency Cancer research, 52, 1427-1433 152 95 Turner KM, Deshpande V, Beyter D, Koga T, Rusert J, Lee C, et al (2017) Extrachromosomal oncogene amplification drives tumour 96 evolution and genetic heterogeneity Nature, 543, 122-125 Congdon KL, Gedeon PC, Suryadevara CM, Caruso HG, Cooper LJ, Heimberger AB, et al (2014) Epidermal growth factor receptor and 97 variant III targeted immunotherapy Neuro-oncology, 16(8), 20-25 Ohgaki H, Dessen P, Kleihues P et al (2004).`Genetic pathways to 98 glioblastoma: a population-based study Cancer Res, 64(19), 6892-9 R.S Heymach, J.V Lipman, S.M Herbst (2008) Lung cancer N Engl J 99 Med, 354, 1367-1380 Ohgaki H, Kleihues P (2013) The definition of primary and secondary 100 glioblastoma Clin Cancer Res, 19(4), 764-72 Hou L.C, Veeravagu Anand, Hsu Andrew R (2006) Recurrent Glioblastoma multiforme: a revew of natural history and mannagement 101 options Neurosurg focus, 20(4): E3 Bergern M.S, Prados M.D (2007) Text book of Neuro-Oncology 102 Elsevier saunders, 111-165 Osborn Anne G, Blaser Susan I, Salzman Karen.L, Katzman Gregory L, 103 et al (2007) Diagnostic imaging brain Amyrsys, 16 (16), 16-41 Nguyễn Quang Hiển, Trương Văn Việt (2002) Chuyên đề ngoại thần 104 kinh, U bào Nhà xuất Y học Hà Nội, 279-290 Stupp Rmason, WPvan den, Bent MJ et al (2005) Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma N Engl J 105 Med, 352987- 996 Appelboom G, Detappe A, LoPresti M, Kunjachan S, Mitrasinovic S, Goldman S, et al (2016) Stereotactic modulation of blood-brain barrier 106 permeability to enhance drug delivery Neuro-oncology, 18, 1601-1609 Singh B, Coffey RJ (2014) Trafficking of epidermal growth factor receptor ligands in polarized epithelial cells Annual review of physiology 76, 275-300 153 PHỤ LỤC QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT DNA 1.1 Quy trình tách DNA từ mẫu mơ paraffin: - Cạo phần ung thư khoanh vùng từ mô đúc paraffin, (khoảng 20mg mô) - Thêm 1ml Toluen, Vortex, Li tâm 15000 vòng/3-5 phút, loại bỏ dịch - Thêm 1ml Ethanol 100%, Vortex, Li tâm 15000 vòng/ 3-5 phút - Loại bỏ dịch Để khô cặn 56 độ C - Thêm 650 µl Lysis buffer HD + 5µl Protein K - Ủ 56 độ C qua đêm - Thêm 500 µl PCI (25:24:1) - Vortex, ly tâm 15000 vòng/20 phút/4oC, sau thu lớp suốt - Thêm 500 µl CI (24:1) - Vortex, ly tâm 15000 vòng/10 phút/4oC, sau thu lớp suốt - Thêm: 1000 µl ethanol 100% 40 µl CH3COONa 3M, sau lắc để -20oC - Ly tâm 15000 vòng/20 phút/4oC thu tủa - Thêm 1ml cồn 70%, ly tâm 15000 vòng/20 phút/4oC - Thu tủa DNA để khơ, hòa tan 60 µl TE 1.2 Đo mật độ quang học DNA sau tách chiết máy Nanodrop - Trừ trắng dung dịch pha DNA (TE nước cất): hút 1,5 µl TE nhỏ vào điểm đo mật độ quang, nhấn nút đo - Hút 1,5 µl DNA tổng số tách nhỏ vào điểm đo máy, nhấn 154 nút đo 155 PHỤ LỤC QUY TRÌNH KỸ THUẬT PCR 2.1 Các bước quy trình - Chuẩn bị đầy đủ dụng cụ, hóa chất, mồi mẫu DNA - Thành phần ống chạy PCR bao gồm: + Nước cất: 3µl + Taq polymerase: µl + Mồi xi: 0,5 µl + Mồi ngược: 0,5 µl + DNA: µl Tổng ống 10 µl - Trộn thành phần, đưa vào máy chạy PCR - Chu trình nhiệt PCR: + Biến tính: 940C phút + Biến tính: 950C 30 giây + Gắn mồi: 570C 30 giây + Kéo dài: 720C phút + Kéo dài: 720C phút x 35 chu kỳ - Lấy kết sản phẩm DNA sau chạy PCR để kiểm tra kết 2.2 Kiểm tra kết PCR 156 Điện di DNA kiểm tra kết PCR + Tra mẫu marker vào giếng: - Tra µl marker loại 100 bp vào giếng - Với giếng lại, giếng tra µl sản phẩm DNA tương ứng + Chạy điện di: - Cài đặt máy tiến hành điện di với hiệu điện 120 V 30 phút + Nhuộm gel: - Ngâm gel dung dịch ethidium bromide µg/ml 5' - Sau rửa gel lần để loại bỏ phần ethidium bromide dư tiến hành chụp ảnh + Quan sát chụp ảnh: - Cho gel vào máy chụp ảnh tử ngoại tự động, quan sát băng sáng DNA xuất gel chụp hình lưu trữ kết 157 PHỤ LỤC QUY TRÌNH GIẢI TRÌNH TỰ GEN - Tinh mẫu: + Thêm 60µL cồn 100% + 5µL EDTA vào mẫu cần tinh + Lắc mạnh, để phòng tối 15 phút, nhiệt độ phòng + Lấy ly tâm 15.000 vòng/phút 20 phút + Loại bỏ dịch + Thêm 200µL cồn 70%, ly tâm 15.000 vòng/phút 10 phút + Loại bỏ dịch nổi, để khô + Thêm 20µL Hi-di, ủ 95°C phút + Cho vào tủ lạnh khoảng phút + Lấy mẫu DNA tinh sử dụng làm khn cho giải trình tự gen - Pha mẫu giải trình tự: Thành phần mẫu giải trình tự Thành phần H2O Buffer Big dye 5X Big dye Terminator v3.1 Mồi F R (10pmol/µL) DNA (đã tinh sạch) Tổng thể tích - Chu trình nhiệt: 96°C: phút 96°C: 10 giây 57°C: giây 60°C: phút x 25 chu kỳ Bảo quản 15°C - Đọc kết giải trình tự lưu máy 158 Thể tích (µL) 6,5 1,5 0,5 0,5 10 µL PHỤ LỤC QUY TRÌNH KỸ THUẬT NHÂN BẢN DNA DỊ (MLPA) (Sử dụng hóa chất kit SALSA MLPA P105-D2, hãng MRC- Hà Lan) - - Bước 1: Biến tính DNA Cho 5µl dung dịch DNA cần phân tích vào ống PCR 0,2ml Biến tính 980C/5 phút, Giữ 250C Bước 2: Gắn dầu dò vào gen đích + Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng: Thành phần Thể tích (µl) Đệm SALSA MLPA 1,5 Hỗn hợp mồi P105 1,5 Tổng + Cho µl hỗn hợp chuẩn bị vào mẫu DNA biến tính, nâng nhiệt độ 950C/1 phút để biến tính đầu dò, ủ 600C qua đêm (16h) để đầu dò gắn đặc hiệu với đoạn gen đích Bước 3: Nối hai đầu dò + Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng: Thành phần Thể tích (µl) Dung dịch đệm A Dung dịch đệm B Nước cất 25 Dung dịch gắn 65 Tổng 32 + Cho 32 µl dung dịch chuẩn bị vào hỗn hợp lai ủ qua đêm, tiếp tục chạy chu trình nhiệt: 540C/15 phút - 980C/5 phút - 40C (sản phẩm lai giữ tuần/ 40C lâu -200C) - Bước 4: Nhân sản phẩm lai (PCR) + Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng: Thành phần Mồi có gắn huỳnh quang Dung dịch đệm Enzyme 159 Thể tích (µl) 2 Nước cất DNA polymerase Tổng 5,5 0,5 10 µl Cho 10 µl dung dịch chuẩn bị vào hỗn hợp máy tiếp tục chạy chu trình nhiệt: + 95oC : 30 giây + 60oC : 30 giây x 30 chu kỳ o + 72 C : 60 giây + 72oC : 20 phút + 72oC : phút + Giữ 4oC - Điện di mao quản hệ thống phân tích đoạn máy Beckman Coulter GeXP + Tra mẫu marker vào giếng: Tra µl marker (mẫu kiểm tra chuẩn hóa điều kiện) vào giếng Với giếng lại, giếng tra µl sản phẩm DNA tương ứng + Chạy điện di: Cài đặt máy tiến hành điện di - Phân tích kết cơng cụ Coffalyser chuyên biệt (được cung cấp hãng MCR - Hà lan) PHỤ LỤC BỆNH ÁN NGHIÊN CỨU Hành Họ tên ……………………………………………………………….….……… Tuổi ………………………………………………Giới (nam/nữ)……………… Khoa/phòng……………………………………………………………….……… Điện thoại liên hệ………………………………………………………………… Mã vào viện………………………………………… ………………………… Tiền sử bệnh tật………………………………………………………………… Mổ u não: rồi/chưa; mổ với chẩn đoán: ………………….……; độ I /II /III /IV Ngày năm mổ………………… Điều trị sau mổ: + xạ trị: khơng/có - đợt ……………………………………… 160 + hóa chất: khơng/có (tên hố chất):……………… đợt … Kết chụp lại phim sau mổ: khơng/ có …………………………….…………… Phát tái phát: ngày tháng năm…………………………………….…………… Thời gian xuất bệnh đến lúc vào viện……………………………………… Chẩn đoán bệnh ………………………………………………………………… Ngày tháng năm mổ…………………………………………………………… Mã giải phẫu bệnh………………………………………………………………… Kết giải phẫu bệnh……………………………………………….…………… Kích thước khối u…………………………………………………….…………… 10 Thời gian sống sau mổ……………………………………………… ………… 11 Điều trị sau mổ: + xạ trị: khơng/có - đợt ……………………….………… + hóa chất: khơng/có (tên hố chất)…………… đợt …… 161 ... biến gen bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm" , với mục ti u: Xác định đột biến gen TP53, EGFR, FGFR bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm Phân tích số đặc điểm người bệnh u nguyên bào thần kinh đệm. .. tiên lượng đi u trị bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm Đột biến gen TP53 u nguyên bào thần kinh đệm h u hết đột biến điểm nằm rải rác toàn chi u dài gen TP53 tập trung chủ y u exon từ exon... 1.2 Nguyên nhân chế sinh bệnh u nguyên bào thần kinh đệm 1.2.1 Nguyên nhân gây bệnh Ngày người ta biết rõ, ung thư nguyên nhân sinh Tùy loại ung thư mà có nguyên nhân riêng biệt Một tác nhân