Xác định đột biến gen FGFR trênbệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm

1 ĐẶT VẤN ĐỀ U não khối u hình thành trình phân chia không kiểm soát tế bào thần kinh não Đây nguyên gây tử vong đứng thứ trẻ em (sau bệnh bạch cầu cấp) đứng thứ người trưởng thành U não ác tính nguyên phát chiếm tỷ lệ thấp loại u não có tỷ lệ tử vong cao U nguyên bào thần kinh đệm (glioblastoma) dạng thường gặp u não nguyên phát xếp vào loại ác tính (độ IV) với tỷ lệ mắc khoảng 3.19/100.000 người Hiện nay, với tiến khoa học kỹ thuật, phương tiện chẩn đoán đại cho phép xác định xác vị trí, kích thước khối u,mức độ xâm lấn, chèn ép não… giúp cho bác sỹ lâm sàng đưa phác đồ điều trị tối ưu cho bệnh nhân Các phương pháp điều trị glioblastoma phổ biến bao gồm phẫu thuật, hóa trị, xạ trị, miễn dịch… hiệu chưa cao, thời gian sống sau điều trị ngắn Với phát triển y học đại, phương pháp điều trị đời với mong muốn giúp kéo dài thời gian sống cho bệnh nhân, liệu pháp điều trị đích Liệu pháp điều trị đích có khả tác động đến thụ thể màng tế bào có hoạt tính tyrosin kinase gây ức chế đường tín hiệu nội bào, ngăn chặn trình tăng sinh, di xâm lấn tế bào ung thư Gen FGFR thụ thể yếu tố phát triển nguyên bào sợi mã hóa cho protein nằm màng tế bào có hoạt tính tyrosin kinase, protein tham gia vào hoạt hóa đường tín hiệu nội bào điều hòa nhờ bắt cặp phối tử đặc hiệu, kết tăng sinh, xâm lấn, di chết theo chương trình tế bào Đột biến gen liên quan đến chế bệnh sinh nhiều loại ung thư ung thư bàng quang, ung thư vú, tuyến tiền liệt… có glioblastoma Việc xác định đột biến gen FGFR đóng vai trò quan trọng định tính đáp ứng với thuốc điều trị đích Tại Việt Nam chưa có nghiên cứu xác định đột biến gen FGFR định tính đáp ứng thuốc điều trị đích bệnh glioblastoma Vì đề tài “Xác định đột biến gen FGFR trênbệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm” thực với mục tiêu chính: Hoàn thiện quy trình xác định đột biến N546K exon 12 R576W exon 13 gen FGFR mẫu bệnh phẩm đúc paraffin Bước đầu xác định số đột biến N546K exon 12 R576W exon gen FGFR bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Đại cương bệnh u nguyên bào thần kinh đệm U nguyên bào thần kinh đệm (glioblastoma) gọi u tế bào hình độ III- IV, tiên phát chuyển biến từ độ I, II Đó khối u ác tính, chỗ, không di xa, thường tái phát sau lấy toàn khối u [1] 1.1.1 Dịch tễ học Glioblastoma đại diện cho khối u não ác tính phổ biến giới (độ IV) chiếm 60-70% u thần kinh đệm ác tính, phổ biến độ tuổi từ 4670 trẻ em, chẩn đoán cho thấy nam gặp nhiều nữ [2] Theo báo cáo trung Tâm ung thư não Hoa Kỳ tỷ lệ mắc glioblastoma khoảng 3,19/100000 người [3] Mặc dù sử dụng phương thức điều trị chuyên sâu (phẫu thuật, hóa trị, xạ trị) tỷ lệ sống năm mức 5%, thời gian sống trung bình bệnh nhân glioblastoma khoảng 12-15 tháng [4] Theo nghiên cứu Baker cộng năm 1976, tỷ lệ mắc u nguyên bào thần kinh đệm Anh Thụy Điển 7,53/100000 dân 4,2/100000 dân Tại Việt Nam:Theo nghiên cứu Lê Xuân Trung Nguyễn Như Bằng năm 1975, tỷ lệglioblastoma chiếm 8% u não [5].Theo nghiên cứu Hoàng Minh Đỗ (2009), tỷ lệ glioblastoma chiếm 17,2% u thần kinh đệm [6] 1.1.2 Yếu tố nguy Theo Hội ung thư não Hoa Kì, nguyên nhân khối u não chưa biết rõ Các nhà khoa học cho thấyviệc tiếp xúc với số yếu tố làm tăng nguy mắc ung thư não như: Yếu tố môi trường, nghề nghiệp: Nghiên cứu cho thấy việc tiếp xúc với hóa chất làm tăng nguy ung thư não Các chất số nghề nghiệp sản xuất nhựa, chất dẻo formaldehyde, vinyl chloride, acrylonitrile nông nghiệp tiếp xúc với thuốc trừ sâu có nguy cao mắc bệnh ung thư não Ngoài việc tiếp xúc với tia phóng xạ ngành công nghiệp hạt nhân điều trị xạ trị có khả cao mắc ung thư não Yếu tố nhân học: - Tuổi: Thường gặp người trưởng thành từ 46-74 tuổi gặp trẻ em với tỷ lệ cao - Giới: Ở nam gặp nhiều nữ - Chủng tộc: nghiên cứu cho thấy người da trắng có tỷ lệ mắc glioblastoma cao người thuộc chủng tộc khác Yếu tố di truyền: số rối loạn di truyền làm tăng nguy mắc ung thư não như: bệnh Von Hippel-Lindau, xơ cứng củ, hội chứng Li-Fraumeni, hội chứng Turcot, hội chứng Klinefelter… Những nghiên cứu gần cho thấy số biến đổi gen đột biến gen áp chế khối u P53 gen sinh ung thư EGFR, PDGFR, FGFR… làm tăng nguy mắc glioblastoma so với người không mang đột biến [7] 1.1.3 Chẩn đoán lâm sàng cận lâm sàng 1.1.3.1 Chẩn đoán lâm sàng Vì u nguyên bào thần kinh đệm dạng u não nguyên phát, gặp vị trí não bộ, triệu chứng lâm sàng nằm bệnh cảnh chung u não Các u não nói chung có hai triệu chứng lâm sàng: - Hội chứng tăng áp lực nội sọ + Đau đầu: triệu chứng phổ biến u não chiếm 50-60%, đau đầu dai dẳng tăng dần, có ngắn, đặc biệt tăng ban đêm gần sáng, đau có đáp ứng với thuốc giảm đau giai đoạn đầu sau đáp ứng không đáp ứng Đau đầu khu trú toàn đầu Nguyên nhân đau đầu chèn ép u não với tổ chức vùng đáy sọ, xoang tĩnh mạch màng cứng [8] + Nôn buồn nôn: thường xuất muộn đau đầu, có xuất với đau đầu Nôn không liên quan đến yếu tố ăn uống hay sinh lý khác Do tăng áp lực nội sọ kích thích thụ cảm não thất IV Vì u thân não, tiểu não đè trực tiếp vào trung tâm nôn, biểu “nôn vọt” thường gặp trẻ em [8] + Phù gai thị: triệu chứng khách quan u não có tăng áp lực sọ Phù gai thị thường xuất sau đau dầu tùy theo vị trí u não 12 gây đè ép, xâm lấn ảnh hưởng đến lưu thông dịch não tủy mà phù gai thị có sớm hay có muộn Biểu mờ bờ gai, phù gai thị, xuất huyết gai thị cuối teo gai thị gây thị lực Phát phù gai thị soi đáy mắt [8] + Động kinh: gặp khoảng 30% u não, chủ yếu u lều tiểu não Những động kinh phần (cục bộ) toàn [8] Rối loạn tâm thần: thay đổi tính tình, hay cáu gắt, trầm cảm, chậm chạp giảm trí nhớ thường gặp u não [8] - Triệu chứng liên quan đến vị trí khối u + Vùng thái dương: rối loạn ngữ u tiếng nói (Broca, Wernicke) + Vùng trán: rối loạn tâm thần, thờ ơ, lãnh đạm,chậm chạp + Vùng chẩm: tượng bán manh + Rối loạn vận động rối loạn cảm giác nửa người khu trú mặt, cánh tay hay chân Khi có triệu chứng lâm sàng để khẳng định rõ giúp cho việc điều trị hiệu quả, chẩn đoán lâm sàng bước quan trọng định hướng trị liệu 1.1.3.2 Chẩn đoán cận lâm sàng a Chẩn đoán hình ảnh Chẩn đoán hình ảnh xác định u não đóng vai trò quan trọng hỗ trợ cho việc chẩn đoán điều trị khối u não, gồm số kỹ thuật: - Chụp động mạch não: Phương pháp cho hình ảnh tốt, làm sở cho việc chẩn đoán định thái độ xử trí Chụp mạch máu não cho thấy hình ảnh đặc biệt khối u choán chỗ, hình ảnh tăng sinh xô đẩy mạch mãu não - Chụp cắt lớp vi tính: kỹ thuật dùng nhiều tia X – quang quét lên khu vực thể theo lát cắt ngang phối hợp với xử lý máy vi tính để có hình ảnh chiều chiều phận cần chụp Đây phương pháp cho phép chụp hàng loạt hình rõ phát xác khối u - Chụp cộng hưởng từ (MRI): Phát tổn thương mà chụp cắt lớp vi tính không phát được, khối u có kích thước nhỏ vùng khó xác định vùng hố sau hay vùng tổn thương có tỷ trọng không rõ ràng khó xác định chụp cắt lớp vi tính Tổn thương u nguyên bào thần kinh đệm MRI thường lan rộng xâm lấn tổ chức xung quanh, bờ u không rõ, dấu hiệu choán chỗ mạnh hơn, tín hiệu có dạng tăng – giảm hỗn hợp T1 T2 Tính hỗn độn tín hiệu tăng lên ổ hoại tử u gây ra, gặp ổ kén u Trong u thấy ổ chảy máu với thời điểm khác cho tín hiệu khác ảnh T1 T2 [5] Hình 1.1: Hình ảnh chụp cộng hưởng từ glioblastoma (http://www.ungthubachmai.com.vn/) Giá trị chụp cắt lớp vi tính, đặc biệt cộng hưởng từ đóng vai trò định chẩn đoán u thần kinh đệm Với độ xác 98,5% chụp cắt lớp vi tính 100% cộng hưởng từ việc xác định vị trí, kích thước, ranh giới khối u trở nên dễ dàng Hình ảnh u thần kinh đệm phim chụp cắt lớp vi tính, cộng hưởng từ giúp bác sĩ lâm sàng định phẫu thuật tiên lượng mức độ ác tính bệnh - Chụp cắt lớp tán xạ (PET-CT): Phương pháp cho phép phát khối u theo dõi tái phát ung thư, đánh giá kết phương pháp điều trị Ghi hình khối u PET-CT có độ nhạy độ đặc hiệu cao nhiều so với phương pháp chẩn đoán hình ảnh khác, đặc biệt khả phát khối u giai đoạn sớm mà phương pháp chẩn đoán khác chưa phát thấy b Chẩn đoán mô bệnh học: Phương pháp chẩn đoán mô bệnh học tiêu chuẩn vàng phát diện khối u cung cấp thông tin chẩn đoán phẫu thuật vòng giờ, thường giới hạn số lượng mẫu xét nghiệm Nguyên lý phương pháp dựa vào thay đổi hình thái tế bào, diện mạch máu bất thường mô chẩn đoán Hình 1.2: Hình ảnh mô bệnh học glioblastoma (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4382761/) 1.1.4 Điều trị Điều trị khối u não dựa mục đích sau: - Chống phù não áp lực nội sọ - Dự phòng động kinh - Điều trị nguyên nhân, gồm giai đoạn: phẫu thuật, hóa trị, xạ trị Phẫu thuật cắt bỏ khối u tiêu chuẩn cho việc điều trị nhằm mục đích loại bỏ khối u để giảm triệu chứng lâm sàng [9] Hóa trị sử dụng thuốc chống ung thư để tiêu diệt tế bào ung thư ngăn chặn phân chia chúng Xạ trị phương pháp sử dụng xạ ion hóa tia X có tia lượng cao để diệt tế bào ung thư, làm cho tế bào ung thư không khả sinh sản Điều trị u não phẫu thuật đơn độc kết hợp xạ trị, hóa trị giúp kéo dài thời gian sống thêm cho bệnh nhân [10],[11] Ngày xạ trị sau phẫu thuật với kết hợp điều trị TMZlà tiêu chuẩn vàng cho điều trị glioblastoma [12],[13] Mặc dù tối ưu hóa phương thức điều trị thời gian sống năm bệnh nhân nhỏ 5% Trong năm gần đây, với phát triển y học đại nhiều phương pháp điều trị ung thư ứng dụng đem lại hiệu vượt trội Một số liệu pháp điều trị trúng đích, hệ thuốc có khả tác động đến đích phân tử có vai trò quan trọng chế bệnh sinh ung thư Phương pháp kỳ vọng kéo dài thời gian sống cho bệnh nhân Tuy nhiên để điều trị đích có hiệu quả, việc xác định đột biến gen liên quan đến tính đáp ứng thuốc đóng vai trò quan trọng định thành công phương pháp [14],[15] 1.1.5 Gen FGFR đột biến gen FGFR gây bệnh u nguyên bào thần kinh đệm 1.1.5.1 Vị trí cấu trúc gen FGFR Gen FGFR (Fibroblast Growth Factor Receptor)mã hóa cho protein có chức thụ thể màng tế bào có nguồn gốc biểu mô, trung mô Các protein đóng vai trò quan trọng suốt trình phát triển trưởng thành tế bào [16] [19] Họ gen FGFR gồm bốn thành viên FGFR1, FGFR2, FGFR3, FGFR4 Trong đó, gen FGFR1 nằm nhánh ngắn NST số 8, vị trí p11.22 p11.23, dài 57 kb bao gồm 24 exon mã hóa cho protein chứa 822 acid amin (Hình 1.2A) Gen FGFR3 nằm nhánh ngắn NST số 4, vị trí 4p16.3 dài 15kb bao gồm 19 exon, mã hóa cho protein chứa 806 acid amin (Hình 1.2B) Gen FGFR1 FGFR3 xếp vào nhóm gen tiền sinh ung thư (pro-oncogen) A B Hình 1.3: A Vị trí gen FGFR1 NST B Vị trí gen FGFR3 NST (Nguồn: http://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=FGFR) 10 Mỗi gen FGFR gồm vùng ngoại bào, vùng xuyên màng vùng nguyên sinh chất Vùng ngoại bào chứa immunoglobulin – Ig cụ thể IgI, IgII IgIII, IgI IgII chứa chiều dài tám hộp acidic liên tiếp nhau, vùng tận thụ thể chứa IgI hộp acid có chức ức chế thụ động, vùng IgII IgIII cần thiết cho bắt cặp phối tử Vùng nội bào chứa vùng tyrosine kinase đầu tận carboxy [16] (Hình 3A).Vùng ngoại bào chứa yếu tố phát triển nguyên bào sợi FGF, FGF tiết glycoprotein làm ổn định tương tác lẫn phối tử với thụ thể FGF nhờ protease [17] Hình 1.4: Cấu trúc gen FGFR (Nguồn: http://mcr.aacrjournals.org/content/8/11/1439/F1.large.jpg) - TACC3 (Transforming, Acidic Coiled-Coil Containing Protein 3) protein thuộc họ TACC TACC3 nằm nhánh ngắn NST số 4, dài 23 kb bao gồm 18 exon, mã hóa cho protein chứa 838 acid amin Hình 1.5: Vị trí TACC3 NST số (Nguồn: http://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=TACC3) 32 Nguyên lý phương pháp dựa vào hấp thụ mạnh ánh sáng tử ngoại Acid nucleic có phổ hấp thụ cực đại bước sóng 260nm có mặt base purin base pyrimidin Giá trị mật độ quang đo bước sóng 260nm (OD260nm) mẫu cho phép xác định nồng độ acid nucleic mẫu Ngoài bước sóng 280nm, protein có mức hấp thụ cao hấp thụ acid amin nhân thơm dị vòng, bao gồm: tyrosin, tryptophan phenylalanine Một mẫu DNA cho tỷ số OD260nm/OD280nm nằm khoảng 1,8-2 Các thông số nồng độ độ tinh mẫu DNA trình bày bảng 3.1, 3.2 Từ bảng số liệu, ta thấy: Tất mẫu DNA đạt nồng độ 50ng/µl đảm bảo đủ nồng độ để thực phản ứng PCR đạt hiệu tốt Tỷ số A260/A280 nằm khoảng 1,8-2,0 cho thấy mẫu DNA tách chiết tương đối sạch, hoàn toàn cho kết PCR tốt Ngoài để khẳng định kết tách chiết lần nữa, mẫu DNA kiểm tra độ tinh hình ảnh điện di gel agarose 0,8% Hình ảnh điện di cho thấy DNA không bị đứt gãy, đảm bảo độ nguyên vẹn đạt đủ nồn độ cho phản ứng PCR thành công (Hình 3.2) 4.2 Kết khuếch đại gen PCR Kết PCR phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: chất lượng nồng độ DNA mẫu, nồng độ thiết kế mồi, hệ thống đệm, chu trình nhiệt Bất kỳ yếu tố ảnh hưởng đến kết phản ứng PCR cuối Trong nghiên cứu này, sử dụng GoldTaq, thành phần bao gồm TaqDNA polymerase, hệ thống dung dịch đệm với pH thích hợp, chứa ion Mg2+ dNTP với nồng độ phù hợp Các yếu tố trước tiên ảnh hưởng đến kết phản ứng PCR nồng độ độ tinh DNA mẫu, chu tình nhiệt thiết kế mồi Chất lượng DNA tách 33 chiết đảm bảo nồng độ độ tinh cho phản ứng PCR (Bảng 3.1) Mồi thiết kế đạt yêu cầu chiều dài, số lượng tương đương nucleotide, trình tự nucleotide…và sử dụng thành công lần trươc Do vậy, để có sản phẩm PCR mong muốn, trước tiên phải chuẩn hóa chu trình nhiệt cho PCR Nhiệt độ biến tính DNA khuôn động khoảng 90-98ºC Nếu nhiệt độ cao ké dài làm giảm số lượng chất lượng Taq DNA polymerase thời gian bán hủy Taq không dài: 2h/92,5ºC, 40 phút/ 95ºC, phút/ 97,5ºC [23] Trong chuẩn hóa chu trình nhiệt việc chuẩn hóa nhiệt độ thời gian gắn mồi đặc biệt quan trọng ảnh hưởng đến hiệu độ đặc hiệu phản ứng PCR Nhiệt độ gắn mồi xác định dựa vào nhiệt độ nóng chảy mồi (Tm) Tm nhiệt độ mà nửa số lượng mồi gắn với gen đích vị trí đặc hiệu [24] Sau thử nghiệm thấy nhiệt độ gắn mồi 55ºC 30 giây cho kết cao Tất mẫu khuếch đại máy PCR với chu trình nhiệt: biến tính 95oC phút, sau thực 35 chu kỳ gồm: biến tính 95 oC 30 giây, gắn mồi 55 oC 30 giây, kéo dài 72oC phút, tiếp tục kéo dài 72 oC phút nữa, cuối giữ 15oC Chu trình nhiệt chứng minh hiệu tất mẫu khuếch đại Sau tối ưu hóa tất trình cho phản ứng PCR Sản phẩm DNA khuếch đại tiến hành kiểm tra điện di tren gel agarose 1,5% Kết sản phẩm PCR đạt hiệu quả, sản phẩm thu đặc hiệu, nhiên xuất mẫu G4, G5, G7 cho kết dương tính (+) mồi F12 âm tính (-) mồi F13 Để xác định nguyên nhân đột biến xảy đoạn gen khuếch đại hay xảy vị trí gắn mồi đột biến có liên quan 34 đến bệnh glioblastoma không, cần nghiên cứu sâu để xác định mối tương quan gen bệnh 4.3 Giải trình tự xác định đột biến gen FGFR Kỹ thuật giải trình tự gen giúp xác định trình tự nucleotide phân tử DNA, từ phát thay đổi có khả dẫn đến thay đổi bệnh lý Giải trình tự gen thực máy ABI-3100 Để có kết rõ đẹp nhằm xác định xác đột biến, cần thông qua nhiều giai đoạn: - Khuếch đại riêng biệt exon 12, exon 13 gen FGFR1, điện di gel agarose để kiểm tra sản phẩm PCR Sau phản ứng khuếch đại, chất lượng DNA không tốt, bị đứt gãy, tạp nhiễm băng điện di bị mờ, không xuất băng phụ [23],[25] Từ kết điện di hình 3.5 cho thấy kêt điện di gel agarose xuất băng sáng, bờ đều, sắc gọn, băng phụ Kết cho thấy sản phẩm khuếch đại gen FGFR đáng tin cậy để tiến hành quy trình giải trình tự gen Đồng thời kết giai đoạn góp phần khẳng định tối ưu hóa giai đoạn tách chiết tinh DNA trước - Giải trình gen FGFR Bigdye kit tinh sản phẩm sau phản ứng: Sau khuếch đại kiểm tra độ tinh gen FGFR exon 12 exon 13 đạt tiêu chuẩn tốt, tiến hành phản ứng giải trình tự gen theo Bigdye kit Để tiến hành phân tích kết máy đọc giải trình tự xác định đột biến sau chạy phản ứng giải trình tự, sản phẩm mong muốn cần tinh khỏi dNTP dư thừa Do dNTP có khả phát quang nên che lấp tín hiệu trình tự giai đoạn đầu trình đọc trình tự gây nhiễu tín hiệu Do đó, tinh sản phẩm sau sử dụng Bigdye kit công đoạn thiếu để tạo sản phẩm 35 trước tiến hành kỹ thuật giải trình tự gen Chúng sử dụng cồn 70º để tinh thu sản phẩm tinh khiết - Kết giải trình tự gen: Sử dụng máy giải trình tự gen tự động trình tự gen mẫu nghiên cứu đối chiếu với trình tự GenBank ngân hàng gen giới phân tích để xác định vùng điểm đột biến Nếu sản phẩm giải trình tự không tinh tốt tạo tín hiệu gây nhiễu, gây khó khăn việc xác định đột biến loại đột biến Các kết giải trình tự gen exon 12 exon 13 gen FGFR1 (hình 3.5) cho thấy hình ảnh đỉnh tín hiệu rõ ràng tín hiệu nhiễu, minh chứng cho tối ưu giai đoạn quy trình kỹ thuật trước Đọc kết giải trình tự cho thấy vị trí exon 12 exon 13 gen FGFR1 không xuất đột biến Trên giới có nghiên cứu sâu rộng đột biến FGFR ảnh hưởng đột biến bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm Vikki Rand, Jiaqi Hungang, Jim Stockwell cộng tiến hành thực nghiên cứu khuếch đại 161 exon 20 vùng tyrosine kinase 20 bệnh nhân glioblastoma Mỹ năm 2005 Phân tích biểu gen FGFR1 phát đột biến điểm exon 12 đột biến điểm exon 13 Đây nghiên cứu xác định đột biến gen vùng tyrosine kinase gen FGFR1 có liên quan đến ung thư [20] Do tỷ lệ bệnh glioblastoma gặp chủng tộc người da trắng nhiều chủng tộc khác nên tỷ lệ đột biến mỹ cao so với nưới ta Ngoài theo nghiên cứu Devendre Singh, Joseph Minhow Chan, Pietro Zoppoli cộng năm 2012 97 bệnh nhân glioblastoma, cho thấy đột biến dung hợp gen FGFRTACC chiếm tỷ lệ 3,1% Từ nghiên cứu cho thấy có mối tương quan chặt chẽ đột biến gen FGFR, dung hợp gen FGFR-TACC bệnh nhân 36 glioblastoma, mở phương pháp điều trị đích với hy vọng kéo dài thời gian sống cho bệnh nhân Do đột biến gen FGFR gặp với tỷ lệ thấp nghiên cứu cỡ mẫu nhỏ chưa phát đột biến gen FGFR nghiên cứu Cần có nghiên cứu sâu rộng với cỡ mẫu lớn để biết xác tỷ lệ đột biến so sánh với kết giới 37 KẾT LUẬN Đã hoàn thiện quy trình xác định đột biến exon 12, exon 13 gen FGFR trên mẫu bệnh phẩm đúc paraffin Chưa phát đột biến N546K exon 12, R576W exon 13 gen FGFR bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm cỡ mẫu nghiên cứu hạn chế TÀI LIỆU THAM KHẢO Nguyễn Tiến Quyết cộng (2013) Bài giảng bệnh học Ngoại khoa, Nhà xuất Y học,Hà Nội Wen P.Y., Kesari S (2008) Malignant gliomas in adults N Engl J Med, 359(5), 492-507 J Pathol (2014) Using the Molecular Classification of Glioblastoma to Inform Personalized Treatment.Author manuscript, 232(2), 165-177 Furnari F.B., Fenton T., Bachoo R.M et al (2007) Malignant astrocytic glioma: genetics, biology, and paths to treatment Genes Dev, 21(21), 2683–2710 Daniel D Trương, Lê Đức Hinh, Nguyễn Thi Hùng (2004) Thần kinh học lâm sàng, Nhà xuất y học, Hà Nội Hoàng Minh Đỗ (2009) Nghiên cứu chẩn đoán thái độ điều trị u não thể glioma bán cầu đại não Luận án Tiến sĩ Y học, Học viện Quân Y Wen P.Y, K S (2008) Malignant gliomas in adults N Engl J Med, 359(5),492-507 Roel G.W Verhaak, Katherine A., Elizabeth P (2010) An integrated genomic analysis identifies clinically relevant subtypes of glioblastoma characterized by abnormalities in PDGFRA, IDH1, EGFR and NF1 Cancer Cell, 17(1), 98 Silvani A., Gaviani P., Lamperti E.A et al (2009) Cisplatinum and BCNU chemotherapy in primary glioblastoma patients J Neurooncol, 94(1), 57-62 10 Walker M.D The contemporary role of chemotherapy in the treatment of malignant brain tumor (1978) Clin Neurosurg, 25, 388-396 11 Walker M.D., Green S.B., Byar D.P.et al (1980) Randomized comparisons of radiotherapy and nitrosoureas for the treatment of malignant glioma after surgery N Engl J Med, 303(23), 1323-1329 12 Agarwala S.S., Kirkwood J.M (2000) Temozolomide, a novel alkylating agent with activity in the central nervous system, may improve the treatment of advanced metastatic melanoma Oncologist, 5(2), 144-151 13 Stupp R., Mason W.P., van den Bent M.J.et al (2005) Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma N Engl J Med, 352(10), 987-996 14 Monzon F.A., Ogino S., Hammond E.H et al (2009) The role of KRAS mutation testing in the management of patients with metastatic colorectal cancer Arch Path Lab Med, 133, 1600-1606 15 O’Brien C., Wallin J.J., Sampath D et al (2010) Predictive biomarkers of sensitivity to the phosphatidylinositol 3' kinase inhibitor GDC-0941 in breast cancer preclinical models Clin Cancer Res, 16(14), 36703683 16 Dienstmann R., Rodon J., Prat A et al (2014) Genomic aberrations in the FGFR pathway: opportunities for targeted therapies in solid tumors Ann oncol, 25(3), 552-563 17 Tuner N and Grose R (2010) Fibroblast growth factor signaling: from development to cancer Nature Rev Cancer, 10, 116-129 18 Singh P., Thomas G.E., Gireesh K.K et al (2014) TACC3 Protein Regulates Microtubule Nucleation by Affecting γ-Tubulin Ring Complexes J Biol Chem, 289(46), 31719-31735 19 Haugsten E.M., Wiedlocha A., Olsnes S Ellen et al (2010) Roles of Fibroblast Growth Factor Receptors in Carcinogenesis Mol Cancer Res, 10, 1158-1541 20 Rand V., Huang J., Stockwell T.E et al (2005) Sequence survey of receptor tyrosine kinases reveals mutations in glioblastomas Proc Natl Acad Sci U S A, 102, 14344-9 21 Singh D., Chan J.M., Zoppoli et al (2012) Transforming Fusions of FGFR and TACC Genes in Human Glioblastoma Science, 337(6099), 1231-1235 22 Rasmussen H.B (2012) Restriction Fragment Length Polymorphin Analysis of PCR-RFLP and Gel Electrophoresis-Valuable Tool for Genotyping and Genetic Fingerprinting INTECH Open Access Publisher 23 Tạ Thành Văn (2010) PCR số kỹ thuật y sinh học phân tử Nhà xuất Y học, Hà Nội 24 Asano H., Toyooka S., Tokumo M et al (2006) Detection of EGFR gen mutation in Lung Cancer by mutant – Enrichid Polymerase Chain Reaction Assay Clin Cancer Res, 12, 43-48 25 Robertson J.M Walsh-Weller J (1998) An Introduction to PCR Primer Design and Optimization of Amplification Reactions Methods Mol Biol, 98, 121-154 26 Khuất Hữu Thanh (2006) Nguyên lý kỹ thuật gen Kỹ thuật gen – Nguyên lý ứng dụng, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, 102-53 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI *** BỘ Y TẾ PHẠM THỊ KIM HUYỀN XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN GEN FGFR TRÊN BỆNH NHÂN U NGUYÊN BÀO THẦN KINH ĐỆM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN Y KHOA KHÓA 2012 - 2016 HÀ NỘI – 2016 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI *** PHẠM THỊ KIM HUYỀN XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN GEN FGFR TRÊN BỆNH NHÂN U NGUYÊN BÀO THẦN KINH ĐỆM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN Y KHOA KHÓA 2012 - 2016 Hướng dẫn khoa học: PGS.TS TRẦN VÂN KHÁNH HÀ NỘI – 2016 LỜI CẢM ƠN Trong trình học tập, nghiên cứu để hoàn thành khóa luận, em nhận nhiều hỗ trợ, giúp đỡ nhiệt tình từ thầy cô, anh chị, gia đình bạn bè Trước hết em xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc tới PGS.TS.Trần Vân Khánh- Phó Giám đốc Trung tâm Nghiên cứu GenProtein, Trưởng môn Bệnh học phân tử, cô tận tình dìu dắt, hướng dẫn chi tiết em thực đề tài nghiên cứu đưa ý kiến góp ý, học quý báu, giúp em sửa chữa hoàn thiện khóa luận tốt nghiệp Em xin chân thành cảm ơn GS.TS Tạ Thành Văn - Giám đốc Trung tâm Nghiên cứu Gen-Protein, tạo cho em điều kiện, quan tâm, giúp đỡ em bạn suốt trình học tập làm khóa luận Em xin cảm ơn Ban giám hiệu, Phòng Đào tạo Trường Đại Học Y Hà Nội tạo điều kiện thuận lợi, giúp đỡ em hoàn thành khóa luận Em xin cảm ơn anh chị Trung tâm Nghiên cứu Gen-Protein, Trường Đại học Y Hà Nội giúp đỡ em nhiều để hoàn thành tốt khóa luận Đặc biệt, em xin cảm ơn CN Trần Quốc Đạt, Trung tâm nghiên cứu Gen-Protein, người trực tiếp hướng dẫn tận tình cho em kỹ thuật, chia sẻ cho em nhiều kinh nghiệm trình thực khóa luận Cuối em xin bày tỏ lòng biết ơn tới tất người thân gia đình, bạn bè quan tâm, động viên, chia sẻ khó khăn với em trình học tập nghiên cứu Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, tháng năm 2016 Sinh viên Phạm Thị Kim Huyền MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT A C ddNTP DNA dNTP EDTA EGFR FGF FGFR FRS2 G HPSGs Kb MAPK NST OD PCR PDGFR PI3K PLC-γ RFLP SDS T TACC3 TBE TE TMZ Adenine Cytosine Dideoxyribonucleotid-5-Triphosphat Deoxyribose nucleic acid Deoxyribonucleotid-5-Triphosphat Ethylen Diamin Tetra Acetic Epidermal Growth Factor Receptor Fibroblast Growth Factor Fibroblast Growth Factor Receptor FGFR substrate Guanosine Heparin Sulfate Proteoglycan Kilo base Mitogen Activated Protein Kinase Nhiễm sắc thể Optical Desity (Độ hấp thụ quang) Polymerase Chain Reaction Platelet-Derived Growth Factor Receptor Phosphoinositide-3-Kinase Phospholipase C-Gamma Restriction Fragment Length Polymorphism Sodium Derecyl Sylfat Thymine Transforming, Acidic Coiled-Coil Containing Protein Tris- Boric acid-EDTA Tris EDTA Temozolomide DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH 7-10,12,13,15,26-30,42 1-6,11,14,16-25,31-40,43-