Đang tải... (xem toàn văn)
Nội dung bài viết trình bày về ghép TBG tạo máu là một phương pháp điều trị mới có thể chữa khỏi nhiều bệnh máu lành tính và ác tính. Sự xuất hiện các tế bào người cho trong máu người nhận sau ghép đồng loài là một chỉ số quan trọng cho phép tiên lượng khả năng thải ghép, tái phát, hoặc bệnh ghép chống chủ. Do vậy mục tiêu của ghép TBG tạo máu đồng loài là mảnh ghép (tức tế bào người cho) mọc 100% trong máu người nhận.
TẠP CHÍ Y – DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ - 2013 BớC ầU NG DụNG KY THUậT GIảI TRìNH Tự GEN CáC LOCUS STR PHâN TíCH THể KHảM ADN áNH GIá TìNH TRạNG MọC GHéP SAU GHéP tế bào gốc ồNG LOàI TạI VIệN HUYếT HO C TRUYềN MáU Trung ơng Lờ Xuõn Hi* TóM TắT ADN t ngi cho người nhận trước ghép khuếch đại kít AmpF/STR Identifiler khuếch đại 15 dấu ấn STR dấu ấn giới tính Giải trình tự dấu ấn Căn vào đặc điểm khác biệt alen STR người cho người nhận, xác định alen mang thơng tin tốt để tính tốn mức độ khảm Để xác định xác mức độ khảm, trộn hỗn hợp ADN người cho người nhận trước ghép theo tỷ lệ xác định từ - 100%, sau phân tích tính tốn % ADN người cho cách tính % donor peak area (% diện tích đỉnh người cho) dựng đường cong chuẩn tương quan % ADN người cho thực tế % ADN người cho tính tốn Thơng qua đường cong chuẩn này, nội suy kết % khảm mẫu bệnh nhân (BN) sau ghép Kết quả: k thuật giải trình tự gen locus STR cho cặp ghép tế bào gốc (TBG) đồng loài, đ xác định trường hợp khảm hoàn toàn trường hợp khảm hỗn hợp vào ngày D30 sau ghép Kết luận: Lần Việt Nam, đ áp dụng thành cơng phương pháp giải trình tự gen để xét nghiệm phân tích tình trạng khảm Phương pháp có độ tin cậy, độ xác cao, cho phép đánh giá tình trạng mọc ghép/thải ghép BN sau ghép tủy/ghép TBG tạo máu đồng lồi * Từ khố: Tế bào gốc đång lồi; Giải trình tự gen; Thể khảm AND Applying sequence genetic loci STR technique in analysis of DNA chimerism to evaluate status of gemmation after hematopoietic stem cell transplantation at National Hospital of Hematology and Transfusion SUMMARY DNAs from pretransplant recipients and donors were amplified with the AmpF/STR Identifiler kit that contain 15 STR markers and sex marker The fluorescent PCR products were the fractionated on polyacrylmide gels in an ABI DNA sequencer Results were analyzed using Genemapper ID 3.2 softwear We selected the best markers as informative alens which can distinguish donor from recipient For quantitative analysis of the engraftment, we prepared a mixed chimeric sample by mixing pretransplant recipient and donor DNAs in different ratios to produce a standard curve * ViÖn HuyÕt häc Truyền máu TW Ng-ời phản hồi (Corresponding): Lê Xuân Hải (xuanhaile@gmail.com) Ngày nhận bài: 17/5/2013; Ngày phản biện đánh giá báo: 10/6/2013 70 TP CH Y DC HC QUN S S - 2013 Ngày báo đ-ợc đăng: 21/6/2013 After amplifying the posttransplant recipient DNA, we were able to detect the extent of engraftment by interpolating the percent peak area of the informative alens from this standard curve Results: We retrospectively analyzed patients who had received allogenic PSCT at D30 post-transplant At D30, 75% of patients had complete chimerism, 25% of patients only have mix chimerism Conclusion: It is the firt time such kind of engraftment analysis is established in Vietnam This method provides an useful tool in assessment of chimerism in posttransplant patients * Key words: Hematopoietic stem cell transplantation; Short tendem repeat; Chimerism ĐỈT VÊN ®Ị Ghép TBG tạo máu phương pháp điều trị chữa khỏi nhiều bệnh máu lành tính ác tính [6, 7] Sự xuất tế bào người cho máu người nhận sau ghép đồng loài số quan trọng cho phép tiên lượng khả thải ghép, tái phát, bệnh ghép chống chủ [2] Cho d c n tỷ lệ nhỏ tế bào máu, BN s phải đối mặt với nguy tái phát Do mục tiêu ghép TBG tạo máu đồng loài mảnh ghép (tức tế bào người cho) mọc 100% máu người nhận [3] Thể khảm ghép TBG tạo máu trạng thái đặc biệt miễn dịch di truyền, đặc trưng c ng tồn quần thể tế bào có nguồn gốc từ hai cá thể khác Các dạng thể khảm ghép TBG tạo máu gặp, bao gồm thể khảm hoàn toàn (mọc ghép hoàn toàn ghép TBG tạo máu) thể khảm hỗn hợp hay khảm phần (mọc ghép phần trường hợp thải ghép) [5] Có nhiều phương pháp khác sử dụng nhằm xác định dạng thể khảm Về nguyên lý, phương pháp phải dựa vào điểm khác biệt miễn dịch di truyền người cho người nhận Trong ghép TBG tạo máu, ghép từ người cho anh/chị em c ng huyết thống khác biệt hệ kháng nguyên HLA có giá trị phân tích thể khảm, khác biệt hệ kháng nguyên hồng cầu nhiễm s c thể giới tính sử dụng trường hợp người cho người nhận khác nhóm máu khác giới So với phương pháp khác, phương pháp phân tích thể khảm dựa vào khác biệt dấu ấn ADN đặc trưng cá thể người cho người nhận có ưu sử dụng cho tất trường hợp ghép TBG tạo máu đồng lồi Phương pháp xác phương pháp khác sử dụng làm phương pháp đánh giá đậu ghép thải ghép ghép tủy/TBG tạo máu đồng loài [4] Nếu thời điểm sau ghép, BN xét nghiệm máu mà khơng có ADN người bệnh BN dạng thể khảm hồn tồn (complete chimerism - CC) hay mọc ghép hồn tồn Tình trạng khảm hồn tồn cho có nguy tái phát thấp tiên lượng tốt Nếu xét nghiệm thấy có ADN người cho ADN người bệnh BN dạng khảm hỗn hợp (mixed chimerism - MC) Thể khảm hỗn hợp chứng tỏ có mặt tế bào người cho người nhận quần thể tế bào quan tâm Nếu sau ghép theo dõi thấy BN có MC mà khơng có CC, chứng tỏ kết ghép chưa đạt mọc ghép hoàn toàn, thấy bệnh nhân đạt CC, sau lại xuất MC, chứng tỏ có biểu thải ghép Như vậy, thực hành, xét nghiệm phân tích tình trạng thể 71 TẠP CHÍ Y – DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ - 2013 khảm có ngh a theo dõi tiên lượng sau ghộp TBG to mỏu ng loi [4] đối TNG Và PHNG PHáP NGHIêN CU Mu mỏu BN Phõn tớch 16 mẫu ADN trước ghép mẫu ADN sau ghép (ngày D30 sau ghép) từ cặp BN ghép TBG tạo máu đồng lồi từ anh/chị em ruột có ph hợp HLA, điều trị Khoa Ghép TBG, Viện Huyết học Truyền máu TW từ tháng - 2012 đến - 2013 Tiến hành phân tích Khoa Miễn dịch - Di truyền Sinh học phân tử, Viện Huyết học Truyền máu TW Labo phân tích di truyền, Công ty Gentis .P u * Chuẩn bị mẫu: Tách chiết ADN genome kít QuickgADN MiniPrep (ZymoResearh, USA) Phân tích, đánh giá nồng độ ADN chất lượng ADN sau tách chiết máy Nanodrop h ng Quiawel (Anh) * Chuẩn bị xây dựng đường chuẩn hỗn hợp khảm ADN: Trước định lượng tình trạng mọc mảnh ghép máu ngoại vi, xây dựng đường chuẩn cách phân tích mẫu hỗn hợp ADN người cho người nhận theo tỷ lệ đ xác định trước Để tạo mẫu chuẩn cho cặp ghép, trộn mẫu ADN (10 ng/ul) đ tách BN người hiến trước ghép theo tỷ lệ khác từ - 100% Các mẫu phân tính giải trình tự locus STR, vào đặc điểm khác biệt alen STR người cho người nhận, tính tốn xác định tình trạng khảm (% donor) Căn vào % donor tính tốn % donor thực tế (% ADN người cho hỗn hợp ADN đ chuẩn bị), d ng phần mềm Microsoft Excel để xây dựng đường cong 73 tương quan d ng cho tính tốn định lượng theo hàm nội suy * Khuếch đại đoạn STR (Short Tandem Repeat, đoạn lặp ngẫu nhiên): Sau tách chiết thu ADN từ mẫu, chạy phản ứng PCR khuếch đại ADN kít AmpF/STR® Identifiler® PCR Amplification Kit (Applied Biosystems, M ) Kít cho phép khuếch đại 15 locus STR locus gen giới tính Phản ứng chạy máy PCR 9700 (ABI, M ) với chu kỳ nhiệt sau: 950C: 11 phút, 940C: phút, 590C: phút x 28 chu kỳ, 720C: phút, 600C: 60 phút * Điện di mao quản phân tích: Xác định kiểu gen sản phẩm chạy phản ứng PCR mẫu nghiên cứu phương pháp điện di mao quản máy giải trình tự gen ABI 3100 (Applied Biosystem, M ) Sau điện di, xử l kết thu phần mềm Genemapper ID 3.2 để xác định alen locus * Tính toán hỗn hợp thể khảm: Tỷ lệ % ADN người cho tính tốn từ cặp locus STR mang thơng tin % diện tích đỉnh người cho (% peak area) tính tốn theo cơng thức sau: % peak area = [(AD1+AD2) x 100%]/(AD1+AD2+AR1+AR2), A k hiệu cho diện tích đỉnh, D k hiệu cho alen người cho, R k hiệu cho alen người nhận (hình 1) Trong trường hợp người cho người nhận c ng có chung số alen, alen mang thơng tin đưa vào tính tốn Bằng cách nội suy diện tích đỉnh alen mang thơng tin có sử dụng đường chuẩn đ xây dựng, tính tốn tình trạng mọc ghép thể % ADN người cho * Định nghĩa khảm hoàn toàn (CC) khảm hỗn hợp (MC): TẠP CHÍ Y – DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ - 2013 cho ADN người nhận theo tỷ lệ đ biết) d ng tỷ lệ % v đường cong chuẩn % ADN ng-êi cho thùc tÕ (MÉu t¹o dùng) Khảm hồn tồn (CC) xác định xuất > 95% tế bào tạo máu người cho sau ghép TBG tạo máu đồng loài Khảm hỗn hợp (MC) xác định có - 95% TBG tạo máu người cho sau ghép TBG tạo máu đồng loài [6] % ADN ng-êi cho tÝnh theo % diƯn tÝch ®Ønh (Peak area) Hình 2: Tương quan % ADN người cho tính theo % diện tích đỉnh locus mang thơng tin % ADN thực tế (y = -0,006x2 + 1,730x - 5,472; r2 = 0,995) Tìm alen STR mang thơng tin Hình 1: Cách tính tốn tình trạng khảm hỗn hợp R1 R2 tín hiệu alen người nhận; D1 D2 tín hiệu alen người cho; A diện tích đỉnh tín hiệu đặc hiệu (A) Cách tính alen người cho người nhận có đỉnh khác (B) Cách tính trường hợp có alen dị hợp tử có alen c ng có người cho người nhận KếT QUả NGHIêN CứU t tru u , độ í xá đ Vì alen ng n khuếch đại hiệu alen dài, cần phải kích hoạt dải hỗn hợp thể khảm tương ứng với mẫu sau ghép gặp lâm sàng Pha loãng mẫu ADN để đánh giá độ tương quan, khả lặp lại, độ tập trung độ nhạy STR-PCR đánh giá định lượng hỗn hợp thể khảm Tính tốn % diện tích đỉnh người cho alen mang thơng tin mẫu tạo dựng (mẫu trộn ADN người Có nhiều tổ hợp alen người cho người nhận, nhiên, có số tổ hợp có mang thông tin cần thiết để phát alen người cho Mặc d có số locus xét mặt k thuật có mang thơng tin, thực tế chúng không tốt để d ng xác định thể khảm hỗn hợp có xuất băng “bóng” tồn dạng băng phụ dọc theo đỉnh alen Nhìn chung, băng “bóng” băng lặp lại nhỏ đỉnh alen có diện tích nhỏ so với alen Các băng “bóng” gây ảnh hưởng đến việc lựa chọn locus mang thông tin .Đ t m đ m BN u t u tí Bảng cho biết số thông tin BN ghép TBG đồng loài Viện Huyết học Truyền máu TW từ tháng - 2012 đến - 2013 Trong số BN này, BN nam (12,5%) BN nữ (87,5%); BN ghép khác giới (25%), BN ghép c ng giới (75%); BN m c bệnh đái huyết s c tố kịch phát ban đêm (PNH), BN rối loạn sinh tủy 74 TẠP CHÍ Y – DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ - 2013 (MDS), BN bạch cầu cấp d ng tủy (AML) BN ghép có tuổi nhỏ 25, lớn 51 Bảng 1: Đặc điểm BN ghép TBG to mỏu ng loi CHẩN đOáN TUổI BN PHù HợP GIíI GIíI TINH TRANG KH¶M D30 PNH 38 Khơng Nữ MC (32%) AML 25 không Nữ CC 100% AML 37 Có Nữ CC 97% MDS 34 Có Nữ MC 67% MDS 45 Có Nữ CC 100% AML 36 Có Nam CC 100% AML 51 Có Nữ CC 98% AML 47 có Nữ CC 100% Vào thời điểm ngày 30 sau ghép, BN (75%) đạt tình trạng khảm hồn tồn, BN (25%) đạt khảm hỗn hợp, BN đạt thể khảm 32% BN đạt 67% Hình 3: Hình ảnh điện di mao quản phân tích mẫu BN số Các alen phân tích từ phải sang trái là: D3S1358, TH01, D13S317; D16S539; D2S1338 Hàng c ng mẫu ADN người cho trước ghép Hàng mẫu ADN BN trước ghép Hàng mẫu AND BN ngày 30 sau ghép (D30) Ngày D30 sau ghép, phân tích mẫu máu BN thấy 100% ADN người cho, 0% ADN BN 75 TẠP CHÍ Y – DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ - 2013 Các mẫu máu tách ADN khuếch đại marker STR Hình hình ảnh phân tích locus STR BN (BN số 2) trước ghép ngày 30 sau ghép Phân tích cho thấy BN này, locus D13S31, D16S539, D2S1338 locus mang thông tin thông tin Việc nhân đồng thời nhiều BµN LUËN locus ống phản ứng cho phép xác Ngày nay, ghép TBG tạo máu định locus mang thông tin Khi thực phương pháp điều trị cứu sống BN nghiệm pha lo ng mẫu người cho người m c bệnh máu ác tính BN suy tủy nhận để xây dựng đường chuẩn, xương Sau ghép TBG, biểu tái phát nhận thấy, mức 5% tái lập bệnh dấu hiệu thất bại ca ghép phương pháp thực nghiệm Thậm chí, mức Phát sớm tình trạng tái phát < 5% tìm thấy đỉnh khác biệt giúp sớm định biện pháp điều trị bổ Ngoài ra, việc phân tích nhiều alen làm tăng sung hiệu Do vậy, với BN ghép độ tin cậy kết quả, làm tăng hội TBG tạo máu đồng loài, cần thiết phải làm đánh giá đỉnh mang thơng tin Một số xét nghiệm phân tích đậu mảnh ghép sau locus mặc d mang ghép để khẳng định mảnh ghép đ mọc không tốt để xác định tình trạng để phát tình trạng mọc ghép hay tái khảm, có tồn dải lặp lại phát sau ghép [5] (hay “bóng đỉnh”), dải chủ yếu xuất ngh a mặt k thuật, Các đặc tính đa hình ADN dạng đỉnh phụ dọc theo đỉnh alen d ng để theo dõi mọc ghép sau ghép đồng Sự có mặt đỉnh lặp lại ảnh lồi, khơng d ng đánh giá tình trạng mọc hưởng đến việc lựa chọn locus mang thông ghép sau ghép tự thân [5] Trong trường tin d ng để phân tích mọc ghép Do đó, hợp người cho anh/chị em sinh đơi giống phân tích cần loại bỏ alen phụ di truyền, đặc tính đa hình ADN khơng có giá trị Tính đa hình có KÕT LN giá trị d ng cho mục đích biến Viện Huyết học Truyền máu TW đ tiến hành ghép TBG đồng loài cho số mặt bệnh rối loạn sinh tủy, bệnh bạch cầu cấp d ng tủy, đái huyết s c tố kịch phát ban đêm Tuổi BN ghép nhìn chung trẻ (< 55 tuổi) Kết sau ghép có đến 75% đạt tình trạng khảm hồn tồn, 25% đạt tình trạng khảm hỗn hợp Kết phản ánh chất lượng ghép Việt Nam mức độ khá, tương đương trình độ khu vực thể số trình tự lặp lại định, trình tự lặp lại gọi đoạn lặp ng n ngẫu nhiên (STR) [1] Locus STR mang thơng tin locus mà có alen người nhận có số lượng đoạn lặp lại khác với alen người cho Vì người cho người nhận thường có quan hệ họ hàng với nhau, nên người cho người nhận có nhiều alen giống Vì vậy, cần phân tích nhiều locus STR để xác định ≥ locus mang Với việc phân tích alen STR, lần Việt Nam, đ áp dụng thành cơng TẠP CHÍ Y – DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ - 2013 phương pháp sinh học phân tử đánh giá tình trạng khảm sau ghép TBG đồng loài với độ tin cậy, độ xác cao, loại trừ khó khăn xác định mọc ghép trường hợp ghép c ng nhúm mỏu, ghộp ng gii TàI LIệU THAM KHảO Butler JM Forensic ADN typing: Biology and technology behind STR marker Academic Press London 2001 Catalin Marian, Andrei Anghel, Simona Maria Bell, Beatrix Katalin Frencz, Sorin Ursoniu, Milan Dressler, Octavian Popescu, Bruce Budowle STR data for the 15 AmpF/STR Identifiler loci in the Western Romanian population Forensic Science International 2007, 170, pp.73-75 Chen DP, Tsao KC, Wang PN, Tseng CP, Sun CF Quantitative analysis of chimerism after allogeneic peripheral blood stem cell transplantation Chang Gung Med J 2002 Nov, 25 (11), pp.734-742 77 Lobashevsky AL, Senkbeil RW, Townsend JE, Mink CA, Thomas JM Quantitative analysis of chimerism using a short tandem repeat method on fluorescent automated ADN sequencer Clin Lab Haematol 2006, 28, pp.40-49 Ma X, Wu D, Sun A et al The value of monitoring minimal residual disease in the patients with donor lymphocyte infusion as intervention of relapse/refractory acute lymphoblastic leukemia after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation Am J Hematol 2010, 85, pp.141-142 Goh RY, Kim SH, Han JY Lineage-specific chimerism analysis in nucleated cells, T cells and natural killer cells after myeloablative allogeneic hematopoietic stem cell transplantation Korean J Hematol 2011 Mar, 46 (1), pp.18-23 Weng L, Dyson J, Dazzi F Low-intensity transplant regimens facilitate recruitment of donor-specific regulatory T cells that promote hematopoietic engraftment Proc Natl Acad Sci USA 2007, 104, pp.8415-8420 TẠP CHÍ Y – DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ - 2013 78 ... sử dụng cho tất trường hợp ghép TBG tạo máu đồng lồi Phương pháp xác phương pháp khác sử dụng làm phương pháp đánh giá đậu ghép thải ghép ghép tủy/TBG tạo máu đồng loài [4] Nếu thời điểm sau ghép, ... Thể khảm ghép TBG tạo máu trạng thái đặc biệt miễn dịch di truyền, đặc trưng c ng tồn quần thể tế bào có nguồn gốc từ hai cá thể khác Các dạng thể khảm ghép TBG tạo máu gặp, bao gồm thể khảm. .. tử, Viện Huyết học Truyền máu TW Labo phân tích di truyền, Cơng ty Gentis .P u * Chuẩn bị mẫu: Tách chiết ADN genome kít QuickgADN MiniPrep (ZymoResearh, USA) Phân tích, đánh giá nồng độ ADN