ỨNG DỤNG kỹ THUẬT GIẢI TRÌNH tự GEN để PHÂN TÍCH TRÌNH tự lặp CGG của GEN FMR1

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI LÊ HỮU TÀI øNG DôNG Kỹ THUậT GIảI TRìNH Tự GEN Để PHÂN TíCH TRìNH Tù LỈP CGG CđA GEN FMR1 ĐỀ CƯƠNG KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP BÁC SỸ Y KHOA KHÓA 2012-2018 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS LƯƠNG THỊ LAN ANH HÀ NỘI – 2018 MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ Chương 1: TỔNG QUAN .3 1.1 GEN FMR1 1.1.1 Khái niệm gen FMR1 1.1.2 Đặc điểm gen FMR1 .5 1.1.3 Cơ chế gây bệnh gen .7 1.1.4 Các kỹ thuật xác định đột biến gen FMR1 1.2 KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ GEN .10 1.2.1 Định nghĩa 10 1.2.2 Ứng dụng kỹ thuật PCR phân tích kích thước gen FMR1 .12 1.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU GEN FMR1 .13 1.3.1 Tại Việt Nam .13 1.3.2 Trên giới 14 Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 15 2.2 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 15 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.4 QUY TRÌNH NGHIÊN CỨU 16 2.4.1 Lấy mẫu chiết tách ADN từ máu ngoại vi chống đông EDTA 16 2.4.2 Kiểm tra độ tinh định lượng ADN quang phổ kế điện di 17 2.4.3 Nhân đoạn gen FMR1 (PCR) kit giàu nucleotide loại G C 17 2.4.4 Phân tích kích thước đoạn gen FMR1 (fragment size) .19 2.4.5 Tổng hợp kết PCR phân tích kích thước đoạn gen FMR1.21 2.4.6 Xác định số lặp ba nucleotid CGG 21 2.4.7 Bộ công cụ nghiên cứu 22 2.4.8 Phân tích xử lý số liệu 22 2.4.9 Đạo đức nghiên cứu 23 Chương 3: DỰ KIẾN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 24 3.1 KẾT QUẢ KHUẾCH ĐẠI VÀ PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ GEN FMR1 24 3.1.1 Hồn chỉnh quy trình kỹ thuật giải trình tự gen FMR1 24 3.1.2 Kết phân tích kích thước đoạn gen FMR1 thu sau thay đổi công thức hỗn hợp đệm .25 3.2 ĐẶC ĐIỂM TRÌNH TỰ LẶP CỦA CGG CỦA GEN FMR1 Ở SỐ TRƯỜNG HỢP CHẬM PHÁT TRIỂN TÂM THẦN CĨ TÍNH GIA ĐÌNH 26 Chương 4: DỰ KIẾN BÀN LUẬN .27 4.1 ỨNG DỤNG KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ GEN ĐỂ PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ LẶP CGG CỦA GEN FMR1 27 4.2 VỀ KẾT QUẢ PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ LẶP …… .27 DỰ KIẾN KẾT LUẬN 28 DỰ KIẾN KIẾN NGHỊ .29 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ADN ARN CPTTT Cs F FMR1 FMRP G C KT NCBI NST PCR R SP UTR Xq27.3 Acid deoxyribonucleic Acid ribonucleotid Chậm phát triển tâm thần Cộng Forward primer ( Mồi xuôi) Fragile X mental retardation Fragile X mental retardation protein Guanin Cytonin Kích thước National Center for Biotechnology Information Nhiễm sắc thể Polymerase Chain Reaction – Phản ứng chuỗi trùng hợp Reverse primer ( Mồi ngược) Sản phẩm Ultranslated Region (Vùng không dịch mã) Gen nằm NST X , vị trí nhánh dài vùng băng 7, băng phụ NST X DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1: Công thức hỗn hợp đệm theo hướng dẫn hãng Asuragen 18 Bảng 2.2: Công thức hỗn hợp đệm tiến hành trung tâm Y sinh học di truyền trường Đại học Y Hà Nội .18 Bảng 2.3: Quy trình luân nhiệt 19 Bảng 3.1: Kết số lần lặp ba CGG gen FMR1 25 Bảng 3.2: Tỷ lệ loại đột biến phát 25 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Sơ đồ băng đồ gen NST X Hình 1.2 Nhiễm sắc thể X dễ gãy Hình 1.3 Sơ đồ gen FMR1 exon .5 Hình 1.4 Mơ hình gen FMR1 người bình thường phân loại Hình 1.5 Khn mặt điển hình người mang hội chứng Fragile X .8 Hình 1.6 Minh họa quy trình xác định trình tự Nu phương pháp hóa học .10 Hình 1.7 Minh họa quy trình xác định trình tự Nu phương pháp enzym học .11 Hình 1.8 Minh họa kết giải trình tự gen phương pháp tự động 12 Hình 1.9 Sản phẩm PCR (A) phân tích kích thước đoạn gen (B) .13 Hình 2.1 Máy giải trình tự Genetic Analyzer 3500 – ABI 20 Hình 2.2 Đồ thị hàm tuyến tính để tính lặp ba CGG 21 Hình 3.1 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR sử dụng công thức hỗn hợp đệm cải tiến 23 Hình 3.2 Tỉ lệ đột biến gen FMR1 xác định quy trình cải tiến 25 ĐẶT VẤN ĐỀ FMR1 gen nằm NST X, vị trí nhánh dài, vùng 2, băng 7, băng phụ NST X (Xq27.3) Đột biến FMR1 gây hội chứng Fragile X (hội chứng Nhiễm sắc X dễ gẫy) Đây nguyên nhân thường gặp gây nên hội chứng chậm phát triển tâm thần (CPTTT) có tính chất gia đình, với tần suất cao dân cư, khoảng 1/4000 nam 1/8000 nữ [1] Gen FMR1 có đặc điểm lặp nhiều lần ba nucleootid CGG, nghĩa giàu nucleotid loại Guanine Cytozine (G C) Đối với gen có nhiều nucleotid loại G C gen dễ hình thành cấu trúc dạng kẹp tóc (hairpin) hay cấu trúc xoắn (tetrahelix) Đây cấu trúc phức tạp phải sử dụng hóa chất đặc hiệu bao gồm dung dịch đảm bảo cho việc nhân đoạn gen Cụ thể thành phần dung dịch đệm có nhiều base nito loại G C Cũng đặc điểm gen FMR1 mà việc phát đột biến liên quan đến gen FMR1 gặp nhiều khó khăn khơng thể sử dụng phương pháp nhân đoạn gen thông thường để phát Hiện nay, có nhiều phương pháp ứng dụng để phân tích gen FMR1 kĩ thuật lai phân tử -Southern blot, kỹ thuật PCR đặc hiệu methyl hóa Giải trình tự gen kỹ thuật ứng dụng hiệu để khuếch đại gen FMR1 nghiên cứu chẩn đoán hội chứng Fragile X.Gen FMR1 khuếch đại kỹ thuật PCR với kit giàu nucleotid loại G C, sau điện di mao quản máy giải trình tự giúp xác định xác số lặp CGG gen đồng thời xác định tình trạng methyl hóa gen Phương pháp tiện lợi hầu hết phịng di truyền phân tử sử dụng máy luân nhiệt PCR máy giải trình tự xác định xác kích thước đoạn gen FMR1 Phần lớn nghiên cứu ứng dụng phương pháp phân tích kích thước đoạn gen để kiểm chứng sau nhân đoạn gen FMR1 phương pháp PCR Việc nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật chưa ứng dụng nhiều Việt Nam.Vì vậy, chúng tơi định nghiên cứu đề tài: “Ứng dụng kỹ thuật giải trình tự gen để phân tích trình tự lặp CGG gen FMR1” Nghiên cứu nhằm hai mục tiêu sau: Khuyếch đại phân tích trình tự lặp CGG gen FMR1 kỹ thuật PCR đặc hiệu giải trình tự gen Mơ tả đặc điểm trình tự lặp CGG gen FMR1 số trường hợp chậm phát triển tâm thần có tính gia đình Chương TỔNG QUAN 1.1 GEN FMR1 1.1.1 Khái niệm gen FMR1 FMR1 gen nằm NST X, vị trí nhánh dài, vùng 2, băng 7, băng phụ NST X (Xq27.3) [2] FMR1 gen giàu nucleotid loại Guanine Cytozine (G C) Đối với gen có nhiều nucleotid loại GC gen dễ hình thành cấu trúc dạng kẹp tóc (hairpin) hay cấu trúc xoắn (tetrahelix) cấu trúc phức tạp phải sử dụng hóa chất đặc hiệu bao gồm dung dịch đảm bảo cho việc nhân đoạn gen Cụ thể thành phần dung dịch đệm có nhiều base nito loại G C Hình 1.1 Sơ đồ băng đồ gen NST X 16 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nghiên cứu mô tả 2.4 QUY TRÌNH NGHIÊN CỨU Thu thập thơng tin làm bệnh án di truyền Thu thập mẫu máu chiết tách ADN từ máu ngoại vi Nhân đoạn gen FMR1 (PCR) kit giàu nucleotid loại GC Phân tích kích thước đoạn gen FMR1 Xác định số lặp ba nucleotid CGG Thu thập xử lí số liệu 2.4.1 Lấy mẫu chiết tách ADN từ máu ngoại vi chống đông EDTA Các mẫu ADN chiết tách kit Invitrogen Nguyên lý chung: - Phá vỡ tế bào - Loại bỏ protein - Hấp phụ ADN chất Silica Quy trình: - Lấy 200 µl máu ngoại vi, bổ sung thêm 20µl Proteinase K ARNase trộn 17 - Thêm vào 200 µl Binding Buffer, trộn - Bổ xung 200 µl Ethanol 96-100 trộn - Chuyển toàn mẫu thực bước sang cột, ly tâm 1000 vòng phút, chuyển cột sang tuyp khác - Thêm 500 µl dung dịch rửa (Wash buffer 1) vào cột, ly tâm 1000 vòng phút, chuyển cột sang tuýp khác - Thêm 500 µl dung dịch rửa (Wash buffer 2) vào cột, ly tâm 14000 vòng phút - Đặt cột sang vơ trùng 1,5ml, thêm 100µl - 200µl TE (Elution buffer), để nhiệt độ phịng phút, ly tâm 14000 vòng 1,5 phút, thu ADN 2.4.2 Kiểm tra độ tinh định lượng ADN quang phổ kế điện di ADN kiểm tra độ tinh hàm lượng máy đo quang phổ Nano-Drop ADN gọi tinh tỷ số OD260nm/280nm= 1,8 – 2.4.3 Nhân đoạn gen FMR1 (PCR) kit giàu nucleotide loại G C FMR gen giàu nucleotid loại G C Đối với gen có nhiều nucleotid loại G C gen dễ hình thành cấu trúc kẹp tóc hay cấu trúc xoắn cấu trúc phức tạp phải sử dụng hóa chất đặc hiệu bao gồm dung dịch đảm bảo cho việc nhân đoạn gen Cụ thể thành phần dung dịch đệm có nhiều base nito loại G C Quy trình PCR để nhân đoạn gen FMR1 thực theo hướng dẫn hãng Asuragen Các bước tiến hành bao gồm : - Chuẩn bị hỗn hợp đệm Bảng 2.1: Công thức hỗn hợp đệm theo hướng dẫn hãng Asuragen Thành phần GC-Rich Amp Buffer FMR1 F,R FAM-Primers FMR1 CGG Primer Diluent GC-Rich Polymerase Mix Thể tích (µl) PCR gen đặc hiệu PCR CGG RP 11,45 11,45 0,5 0,5 N/A 0,5 0,5 0,5 0,05 0,05 18 AND mẫu Tổng thể tích 2,00 15,00 2,00 15,00 Bảng 2.2: Công thức hỗn hợp đệm tiến hành trung tâm Y sinh học di truyền trường Đại học Y Hà Nội Thành phần GC-Rich Amp Buffer FMR1 F,R FAM-Primers FMR1 CGG Primer Diluent GC-Rich Polymerase Mix AND mẫu Tổng thể tích Thể tích (µl) PCR gen đặc hiệu PCR CGG RP 5,725 5,725 0,25 0,25 N/A 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 2,00 2,00 8,5 8,5 Quy trình PCR thực máy luân nhiệt PCR C1000 Thermal Cycle –Biorad với chương trình sau: 19 Bảng 2.3: Quy trình ln nhiệt CGG RP PCR Mơ tả hold 10 chu trình 20 chu trình hold hold Thời gian 95 0C for phút 97 0C for 35 giây 68 0C for phút 68 0C for phút 97 0C for 35 giây 68 0C for phút 68 0C for phút + 20s/chu trình 72 0C for 10 phút 0C 2.4.4 Phân tích kích thước đoạn gen FMR1 (fragment size) Sản phẩm PCR mẫu nghiên cứu phân tích kích thước đoạn gen (fragment size) máy đọc trình tự ABI 3500 Genetic Analyser: sản phẩm PCR pha loãng nước cất, bổ sung Hi-Di Formamide marker Sau làm nóng tới 92 độ máy luân nhiệt Bio-Rad Giữ điều kiện lạnh đọc trình tự máy Quy trình thực sau : 2.4.4.1 Chuẩn bị - Lấy Hi-Di formamide and ROX1000 Size Ladder khỏi hộp bảo quản, để nhiệt độ phòng Ly tâm 15s trước sử dụng - Chuẩn bị hỗn hợp mix theo thành phần bảng sau: (cho giếng) 20 Hi-Di Formamide ROX 1000 Size Ladder Total Volume per well - 11µl µl 13µl - Trộn tất thuốc thử ly tâm 3-5 lần - Đưa vào giếng điện di mao quản 13.0 µl hỗn hợp Formamide/ROX - Sau thêm vào giếng điện di mao quản µl sản phẩm PCR Chú ý nên trộn nhiều lần Pipet trước lấy sản phẩm PCR - Đưa vào chu trình nhiệt để 95 0C phút sau giữ 0C đưa vào CE instrument Lưu ý: Trong trình trộn hút thuốc thử sản phẩm PCR tránh tạo bọt Sau xong bước biến tính bảo quản bệnh phẩm điều kiện 0C tránh ánh sáng mặt trời Hình 2.1: Máy giải trình tự Genetic Analyzer 3500 – ABI 21 2.4.5 Tổng hợp kết PCR phân tích kích thước đoạn gen FMR1 Do người nữ có nhiễm sắc thể X, kiểu gen đồng hợp tử kết phân tích kích thước đoạn gen cho đỉnh kích thước Nếu gen dị hợp tử kết phân tích kích thước đoạn gen cho đỉnh kích thước Ở người nam có nhiễm sắc thể X, kết phân tích kích thước đoạn gen cho đỉnh kích thước Đối với trường hợp, không thấy sản phẩm PCR không thấy đỉnh kích thước phân tích đoạn gen nghĩa gen FMR có số lặp ba nucleotid CGG> 200 lần 2.4.6 Xác định số lặp ba nucleotid CGG Dựa thuật toán Regression phần mềm SPSS V15 Excel, với kích thước đoạn gen số lặp ba nucleotid CGG chứng dương biết trước, tính mối tương quan với hàm số y = ax + b, từ kích thước đoạn gen mẫu bệnh phẩm tính số lặp lại ba nucleotid CGG Trong : x: Kích thước gen FMR1 y: Số lặp ba nucleotid CGG a,b Hình 2.2: Đồ thị hàm tuyến tính để tính lặp ba CGG 22 2.4.7 Bộ công cụ nghiên cứu - Bệnh án di truyền thu thập thông tin bệnh nhân - Hóa chất chiết tách DNA - Hóa chất làm xét nghiệm PCR - Hóa chất điện di tinh sản phẩm PCR để giải trình tự tham chiếu - Vật tư tiêu hao làm kỹ thuật 2.4.8 Phân tích xử lý số liệu Kết nghiên cứu gen FMR1 máy Realtime PCR phân tích phần mềm CFX Manager™Software Kết giải trình tự gen: thông số chất lượng đỉnh thu thập, kiểm định phần mềm ABI Data Collection v2.0 Sequencing Analysis Sotwave v5.3 Các số liệu tổng hợp tính tốn Word excel 2.4.9 Đạo đức nghiên cứu - Có cam kết, thỏa thuận với bệnh nhân người nhà bệnh nhân - Đối tượng nghiên cứu người nhà đối tượng nghiên cứu thơng báo rõ mục đích nghiên cứu - Đối tượng nghiên cứu giữ kín bí mật cung cấp thông tin - Đối tượng nghiên cứu phản hồi kết nghiên cứu - Khám, tham gia điều trị, tư vấn cho đối tượng nghiên cứu 23 Chương DỰ KIẾN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 KẾT QUẢ KHUẾCH ĐẠI VÀ PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ GEN FMR1 Gen FMR1 gen giàu G C phải sử dụng kit đặc hiệu bao gồm dung dịch đảm bảo cho việc nhân đoạn gen Quy trình PCR thực theo hướng dẫn hãng Asuragen Phản ứng PCR nhân đoạn gen có số lặp nucleotid CGG lên tới >200 lần 3.1.1 Hồn chỉnh quy trình kỹ thuật giải trình tự gen FMR1 3.1.1.1 Khuếch đại gen kỹ thuật PCR - Theo khuyến cáo hãng Kết điện di có sản phẩm gen - Hồn chỉnh kỹ thuật PCR phịng xét nghiệm Nhằm tìm cơng thức hỗn hợp đệm tối ưu cho phản ứng PCR nhân đoạn gen FMR1, thử nghiệm thay đổi tỷ lệ thành phần hóa chất hỗn hợp đệm, kết cho thấy với lượng hóa chất ½ so với hướng dẫn phản ứng PCR để khếch đại gen FMR1 Sau thực phản ứng PCR, kết giải trình tự gen cho thấy hình ảnh đặc hiệu rõ nét mẫu nghiên cứu (Hình 3.1) Hình 3.1.Hình ảnh điện di sản phẩm PCR sử dụng công thức hỗn hợp đệm cải tiến - So sánh sau hồn chỉnh 3.1.1.2 Phân tích trình tự lặp ba nucleotid CGG gen FMR1 kỹ thuật giải trình tự gen - Hình ảnh giải trình tự gen - Cơng thức để tính số lặp CGG xác định 3.1.2 Kết phân tích kích thước đoạn gen FMR1 thu sau thay đổi công thức hỗn hợp đệm 24 Tiến hành xác định trình tự lặp CGG gen FMR1 30 mẫu Kết thu trình bày bảng sau : Bảng 3.1: Kết số lần lặp ba CGG gen FMR1 Giới Mẫu Tuổi tính Kích thước Số ba đoạn gen nucleotid CGG Kiểu gen Phân loại F160 F160 … F171 F171 Nhận xét: Bảng 3.2: Tỷ lệ loại đột biến phát Chỉ số Giới Tổng số Số BN Tỷ lệ đột biến/ giới BN có đột biến gen (%) Nam Nữ Tổng Nhận xét: Số lần lặp Số bệnh nhân Tỷ lệ (%) 25 ba CGG Alen bình thường Alen trung gian Alen tiền đột biến Alen đột biến hoàn toàn Từ kết số lần lặp CGG gen FMR1 theo quy trình cải tiến thu đồ thị thể mức lặp CGG gen FMR1 đây: Hình 3.2: Tỉ lệ đột biến gen FMR1 xác định quy trình cải tiến Nhận xét: 3.2 ĐẶC ĐIỂM TRÌNH TỰ LẶP CỦA CGG CỦA GEN FMR1 Ở SỐ TRƯỜNG HỢP CHẬM PHÁT TRIỂN TÂM THẦN CÓ TÍNH GIA ĐÌNH 26 Chương DỰ KIẾN BÀN LUẬN 4.1 ỨNG DỤNG KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ GEN ĐỂ PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ LẶP CGG CỦA GEN FMR1 Hồn chỉnh quy trình kỹ thuật giải trình tự gen đến phân tích trình tự lặp CGG gen FMR1: vai trị trình tự lặp CGG lên đột biến gen FMR1 gây nên hội chứng Fragile X quan trọng Tuy nhiên Việt Nam vấn đề chưa có nhiều nghiên cứu ứng dụng để đưa vào thực hành lâm sàng Chính chúng tơi tiến hành đề tài để hồn chỉnh quy trình kỹ thuật giải trình tự gen đề phân tích trình tự lặp CGG gen FMR1 dựa quy trình theo kít AmplideX hãng Asuragen nhằm mục đích tiết kiệm chi phí phù hợp với điều kiện kinh tế người dân Việt Nam Chúng tơi xây dựng quy trình sau:      Bước 1: Bước 2: Bước 3: Bước 4: Bước 5: Đã phân tích trình tự lặp CGG gen FMR1, có giá trị khơng… 4.2 VỀ KẾT QUẢ PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ LẶP …… 27 DỰ KIẾN KẾT LUẬN Đã ứng dụng thành công kỹ thuật giải trình tự gen để phân tích trình tự lặp CGG gen FMR1 gồm bước sau: Mơ tả đặc điểm trình tự lặp CGG gen FMR1 số trường hợp chậm phát triển tâm thần có tính gia đình 28 DỰ KIẾN KIẾN NGHỊ TÀI LIỆU THAM KHẢO Lương Thị Lan Anh cs (2003), Nghiên cứu tần suất bất thường nhiễm sắc thể hội chứng Nhiễm sắc X dễ gãy số vùng dân cư, Luận văn thạc sỹ Y học, Trường Đại học Y Hà Nội Stephen T Warren (1997), Trinucleotid Repetition and fragile X Syndrome, Hospital Practice Mc Kusick V (1992), "Catalogs of autosomal dominant, autosomal recessive, and X - linked phenotype", Mendelian inheritance in man 2, pp 1902-1911 Ledbetter D Nussbaum R (1987), "The Fragile X syndrome", The matabolic Basic of Inherited Disease 1, pp 327 - 341 Jennifer A Jewell (2008), "Fragile X Syndrome", Medscape com hypertext transfer protocol://emedicine medscape com/article/943776 - overview Todd P Lynch E (2011), "Fragile X Reasearcher Honored By March of Dimes", March of Dimes Foudation Warren S Jin P (2000), "Understanding the molecular basis of fragile X syndrome", Human Molecular Genetics 9, 901-908 Esther Cohen Pnina Weisman- Shomer, and Michael Fry (2000), "Interruprion of the Fragile X syndrome expanded sequence d(CGG)n by interspersed d(AGG) trinucleotides diminishes the formation and stability of d(CGG)n tetrahelical structures", Nucleic Acids Research 28(7), pp 1535- 1541 Crawford D (2001), "FMR1 àn the Fragile X Syndrome", Genetics medicine, pp 3-5 10 Meguid N et al (2007), "Prevalance of fragile X syndrome among school-age Egyptian males", Word Journal of Pediatrics 3(4) 11 Simpson J (2008), "XX Glonadal Dysgenesis and Premature Ovarian Failure in 46, XX Individuals", The Global Library of Women's Medicine 12 Nolin S et al (1996), " Familial transmission of the FMR1 CGG repeat", American Journal of Human Genetics 59, pp 1252-1261 13 Kolialexi A Sofocleous C., Mavrou A (2009), "Modecular diagnosis of Fragile X syndrome", Expert review of molecular diagnostics 9(1), 23-30 14 Dolen G Bear M., Osterweil E., Nagarajan N (2008), "Fragile X: Translation in action", Neuropschyopharmacology 33(1), pp 84-87 15 Atha D O'Connell C., Jakupciak J., Amos J., Richie K (2002), "Standardization of PCR amplification for fragile X trinucleotide repeat measurements", Clinical Genetics 61(1), pp 13-20 16 Shan G Luo Y., Guo W., Richard D., Eric B (2010), "Fragile X Mental Retardation Protein Regulates Proliferation and Differentiation of Adult Neural Stem/Progenitor Cell", Public library of Science 4(6), pp.898903 17 Western Sydney Genetics Program, "Deparmant of Molecular Genetics - CHW, Authorising Officer: Dr Bruce Bennetts et al", Test Methods Manual: Mutation analysis for Fragile X syndrome, pp 65-73 18 Brusino A Saluto A., Tassone F., Aduino C., Cagnoli C., Pappi P., Hagerman P., Migone., Brusco A (2005), "An Enhanced Polymerase Chain Reaction Assay to Detect Pre- and Full Mutation Allleles of the the Fragile X Mental Retardation Gene", Molecular Diagnosis 7(5), pp 605-612 ... 4.1 ỨNG DỤNG KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ GEN ĐỂ PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ LẶP CGG CỦA GEN FMR1 Hồn chỉnh quy trình kỹ thuật giải trình tự gen đến phân tích trình tự lặp CGG gen FMR1: vai trị trình tự lặp CGG. .. tài: ? ?Ứng dụng kỹ thuật giải trình tự gen để phân tích trình tự lặp CGG gen FMR1? ?? Nghiên cứu nhằm hai mục tiêu sau: Khuyếch đại phân tích trình tự lặp CGG gen FMR1 kỹ thuật PCR đặc hiệu giải trình. .. 3.1.1.2 Phân tích trình tự lặp ba nucleotid CGG gen FMR1 kỹ thuật giải trình tự gen - Hình ảnh giải trình tự gen - Cơng thức để tính số lặp CGG xác định 3.1.2 Kết phân tích kích thước đoạn gen FMR1