ỨNG DỤNG kỹ THUẬT REAL TIME PCR TRONG PHÁT HIỆN một số đột BIẾN GEN ở BỆNH NHÂNTĂNG SINH tủy mạn ác TÍNH

TRẦN MAI HỒNGỨNG DỤNG KỸ THUẬT REAL-TIME PCR TRONG PHÁT HIỆN MỘT SỐ ĐỘT BIẾN GEN Ở BỆNH NHÂN TĂNG SINH TỦY MẠN ÁC TÍNH ĐỀ CƯƠNG LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC HÀ NỘI - 2018... TRẦN MAI HỒNGỨNG D

TRẦN MAI HỒNG

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT REAL-TIME PCR TRONG PHÁT HIỆN MỘT SỐ ĐỘT BIẾN GEN Ở BỆNH NHÂN TĂNG SINH TỦY MẠN ÁC TÍNH

ĐỀ CƯƠNG LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC

HÀ NỘI - 2018

TRẦN MAI HỒNG

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT REAL-TIME PCR TRONG PHÁT HIỆN MỘT SỐ ĐỘT BIẾN GEN Ở BỆNH NHÂN TĂNG SINH TỦY MẠN ÁC TÍNH

Chuyên ngành : Xét nghiệm y học

Mã số :

ĐỀ CƯƠNG LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

1 GS.TS Phạm Quang Vinh

2 TS Dương Quốc Chính

HÀ NỘI - 2018

AS-PCR : Allele specific PCR (Phản ứng khuếch đại chuỗi allen đặc hiệu)BCR : Breakpoint cluster region

FAM : 6-Carboxy Fluorescein

HEX : Hexacloro- Fluorescein

JAK2 : Janus kinase 2 (Gen JAK2)

MPN : Myeloproliferative neoplasm (Bệnh tăng sinh tủy mạn)

MPL : Myeloproliferative leukemia virus oncogene (Gen MPL)

NGS : Next Generation Sequencing (Giải trình tự gen thế hệ mới)NST : Nhiễm sắc thể

PCR : Polymerase chain reaction (Phản ứng khuếch đại chuỗi)

Ph : Philadelphia chromosome (Nhiễm sắc thể Philadelphia)

PMF : Primary myelofibrosis (Bệnh xơ tủy nguyên phát)

PV : Polycythaemia vera (Bệnh đa hồng cầu nguyên phát)

RNA : Ribunocleotid acid

STAT : Signal transducer and activator of transcription (Phân tử truyền

tín hiệu và hoạt hóa phiên mã)TET2 : Ten-Eleven translocation oncogene family member

TPO : Thrombopoietin

WHO : World Health Organization (Tổ chức Y tế thế giới)

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Bệnh lý tăng sinh tủy mạn ác tính 3

1.1.1 Vài nét lịch sử 3

1.1.2 Bệnh lý đa hồng cầu nguyên phát – Polycythemia vera 4

1.1.3 Bệnh lý tăng tiểu cầu tiên phát – Essential thrombocythemia 5

1.1.4 Bệnh lý xơ tủy nguyên phát – Primary myelofibrosis 6

1.1.5 Cập nhật tiêu chuẩn chẩn đoán tăng sinh tủy mạn của WHO năm 2016 7

1.2 Một số đột biến gen phổ biến gây bệnh tăng sinh tủy mạn ác tính 8

1.2.1 Đột biến gen JAK2V617F 9

1.2.2 Đột biến gen CALR 11

1.3 Một số phương pháp chẩn đoán sinh học phân tử 13

1.3.1 Polymerase chain reaction và AS – PCR 13

1.3.2 Real time PCR 14

1.3.3 Next Generation Sequencing – NGS 17

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.1 Đối tượng nghiên cứu 20

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu: 20

2.1.2 Tiêu chuẩn lựa chọn: 20

2.1.3 Tiêu chuẩn loại trừ 20

2.1.4 Phương pháp chọn mẫu: thuận tiện 21

2.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 21

2.2.1 Địa điểm nghiên cứu: 21

2.2.2 Thời gian nghiên cứu 21

2.3 Phương pháp nghiên cứu 21

2.3.1 Thiết kế nghiên cứu 21

2.3.5 Sai số và cách khống chế 24

2.3.6 Quản lý phân tích số liệu: 25

2.4 Vấn đề đạo đức nghiên cứu 25

CHƯƠNG 3 DỰ KIẾN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 26

3.1 Đặc điểm chung của đối tượng tham gia nghiên cứu 26

3.1.1 Đặc điểm về giới của nhóm nghiên cứu 26

3.1.2 Đặc điểm về tuổi của nhóm nghiên cứu 27

3.1.3 Đặc điểm thể bệnh của nhóm bệnh nghiên cứu 28

3.1.4 Đặc điểm gen đột biến được nghiên cứu ở nhóm bệnh 28

3.2 Xây dựng quy trình 28

3.2.1 Kết quả tách chiết RNA 28

3.2.2 Thiết kế mồi và đầu dò 28

3.2.3 Kết quả tối ưu quy trình Real-time PCR 28

3.3 Đánh giá kết quả ứng dụng quy trình 29

3.3.1 Kết quả ứng dụng quy trình 29

3.3.2 So sánh kết quả ứng dụng Real-time PCR và kết quả AS-PCR, NGS 29

CHƯƠNG 4 DỰ KIẾN BÀN LUẬN 30

DỰ KIẾN KẾT LUẬN 31

DỰ KIẾN ĐỀ XUẤT, KIẾN NGHỊ 32 TÀI LIỆU THAM KHẢO

KẾ HOẠCH THỰC HIỆN

DỰ TRÙ KINH PHÍ

PHỤ LỤC

Bảng 3.1: Phân bố về giới tính của nhóm nghiên cứu 26

Bảng 3.2 Phân bố giới tính theo từng nhóm bệnh nghiên cứu 26

Bảng 3.3 Phân bố độ tuổi của nhóm bệnh nghiên cứu 27

Bảng 3.4 Phân bố độ tuổi theo từng nhóm bệnh nghiên cứu 27

Bảng 3.5 Phân bố thể bệnh của nhóm bệnh nghiên cứu 28

Bảng 3.6: Phân bố tỷ lệ gen đột biến trong nghiên cứu 28

Bảng 3.7 Kết quả phát hiện đột biến theo phương pháp Real-time PCR 29

Bảng 3.8 Tỷ lệ phát hiện đột biến gen nghiên cứu theo một số phương pháp 29

Hình 1.2 Gen JAK2 đột biến trên exon 14 10

Hình 1.3 Cấu trúc phân tử protein Calreticulin 12

Hình 1.4 Gen CALR đột biến trên exon 9 13

Hình 1.5 Biểu đồ khuếch đại của phản ứng Realtime-PCR 16

ĐẶT VẤN ĐỀ

Tăng sinh tủy mạn tính (Myeloproliferative neoplasm – MPN) lànhóm bệnh lý đơn dòng của tế bào gốc vạn năng Bệnh gây nên do sựtăng sinh không kiểm soát của các tế bào gốc sinh máu trong tủyxương, tiến triển mạn tính do liên quan đến khả năng biệt hóa đến giaiđoạn trưởng thành của tế bào dẫn đến tăng sinh các tế bào trưởng thành

ở máu ngoại vi Những bệnh lý thuộc nhóm này thường có đặc điểmchung là gan, lách to (do sự sinh máu ngoài tủy, thâm nhiễm của các tếbào bệnh lý), tủy giàu tế bào, mẫu tiểu cầu tăng sinh và rối loạn hìnhthái [1, 2] Bệnh thường gặp ở người lớn ở độ tuổi 50 – 70, hiếm khigặp ở trẻ em với tỷ lệ mắc từ 6 – 9/ 100.000 người

Các bệnh lý thuộc nhóm tăng sinh tủy mạn tính thường gặp gồmcó: (1)Lơ-xê-mi kinh dòng hạt (Chronic Myelogenous Leukemia –CML), (2)Đa hồng cầu nguyên phát (Polycythaemia vera – PV), (3)Tăng tiểu cầu tiên phát (Essential thrombocythaemia – ET), (4)Xơ tủynguyên phát (Primary myelofibrosis – PMF) hay còn được gọi là lách

to sinh tủy nguyên phát [1] Trong quá trình tiến triển của bệnh, cácbệnh lý này có thể chuyển dạng lẫn nhau, và ở giai đoạn cuối của bệnh

10 – 30% bệnh nhân có thể chuyển dạng thành xơ tủy hoặc 10% bệnhnhân chuyển dạng thành Lơ-xê-mi cấp gây nên sự chồng chéo giữa cácthể bệnh về dấu hiệu lâm sàng cũng như cận lâm sàng [3] Riêng trongbệnh lý Lơ-xê-mi kinh dòng hạt (CML), các nhà khoa học đã chứngminh được vai trò quan trọng của tổ hợp gen lai BCR-ABL (được tạothành do kết quả chuyển đoạn t(9:22)(q34;ql l) hình thành nên nhiễmsắc thể Philadelphia) trong sinh bệnh học và quá trình điều trị [4, 5].Với các bệnh lý còn lại trong nhóm, chưa phát hiện các bất thường di

truyền đặc trưng riêng cho từng bệnh, vì vậy còn gây ít nhiều khó khăntrong việc chẩn đoán và xếp loại bệnh.

Nhờ vào thành tựu của y sinh học hiện đại ngày nay, các nhà khoahọc đã xác định được vai trò của vật chất di truyền trong cơ chế phátsinh bệnh, đó là các biến đổi gen, và bất thường nhiễm sắc thể Vì vậy,hiện nay đã có nhiều phương pháp sinh học phân tử được áp dụng đểphát hiện các gen bất thường trong các bệnh máu như: Lơ-xê-mi, rốiloạn sinh tủy, u lympho hay tăng sinh tủy mạn tính…

Tại Việt Nam đã có các công trình nghiên cứu về các bất thườngnhiễm sắc thể hay các gen đột biến để phát hiện và chẩn đoán bệnh lýtăng sinh tủy mạn như phản ứng khuếch đại allen đặc hiệu (Allelespecific PCR – AS-PCR) hay kỹ thuật giải trình tự gen thế hệ mới(Next Generation Sequencing - NGS) Kỹ thuật NGS có độ chính xáccao tuy nhiên chi phí cũng rất cao và đòi hỏi nhiều phương tiện kỹthuật hiện đại, chuyên sâu mà không phải cơ sở xét nghiệm nào cũngthực hiện được Các kỹ thuật truyền thống như AS-PCR hay Multiplex-PCR đều có độ nhạy không cao và thời gian trả kết quả kéo dài Do đó

chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Ứng dụng kỹ thuật Real-time

PCR trong phát hiện một số đột biến gen ở bệnh nhân tăng sinh tủy mạn ác tính” ở nhóm bệnh MPN có nhiễm sắc thể Ph âm tính với 2

mục tiêu:

1 Ứng dụng kỹ thuật Real-time PCR để phát hiện đột biến gen phổ biến gồm JAK2V617F và CALR (type 1 & type 2) trong bệnh tăng sinh tủy mạn ác tính.

2 Bước đầu đánh giá kết quả phát hiện đột biến gen JAK2V617F và CALR (type 1 & type 2) ở một số bệnh lý tăng sinh tủy mạn ác tính, không có

nhiễm sắc thể Ph, bằng kỹ thuật Real-time PCR tại viện Huyết học – Truyền máu Trung ương từ 1/ 2016 đến 8/2018.

Năm 1960, việc phát hiện bất thường trên NST số 22 ở bệnh nhânCML và sau đó được đặt tên NST (Philadelphia) theo thành phố màNowell và Hungerford đã phát hiện Đến năm 1973, bằng các phươngpháp sinh học tế bào, các nhà khoa học đã chứng minh được NST Ph làkết quả của chuyển đoạn trên nhánh dài NST số 9 và 22 t(9;22)(q34;q11) và vai trò quan trọng của gen BCR-ABL trong cơ chế sinhbệnh học ở bệnh nhân CML, cùng với đó phân chia thành 2 nhóm bệnh:Nhóm bệnh có Ph (+) ở bệnh nhân CML và nhóm bệnh có Ph (-) ở cácbệnh nhân PV, ET, PMF [6]

Từ năm 2005, cùng với việc phát hiện các bất thường di truyền ởcấp độ phân tử, WHO đã có những điều chỉnh và cập nhật tiêu chuẩnchẩn đoán của nhóm “rối loạn tăng sinh tủy” gồm các marker di truyềnnhư đột biến JAK2V617F và đột biến JAK2 trên exon 12 Với cách tiếpcận đơn giản này đã đơn giản hóa và làm tăng độ chính xác trong việcchẩn đoán bệnh, và thuật ngữ “rối loạn tăng sinh tủy” khi đó cũng đượcchuyển thành “tăng sinh tủy mạn tính” để có những phản ánh tốt hơn vềbản chất của nhóm bệnh lý rối loạn này [7].

1.1.2 Bệnh lý đa hồng cầu nguyên phát – Polycythemia vera (PV).

Đa hồng cầu nguyên phát là một bệnh thuộc nhóm tăng sinh tủymạn ác tính, được mô tả lần đầu năm 1892 bởi bác sỹ Vasquez ngườiPháp Bệnh có đặc trưng bởi tình trạng tăng sinh quá mức của tế bàogốc tạo máu nghiêng về dòng hồng cầu, làm gia tăng số lượng hồngcầu, nồng độ hemoglobin, hematocrit và độ nhớt máu làm tốc độ tuầnhoàn chậm lại, dễ gây biến chứng tắc mạch Sự tăng sinh tế bào gốccũng làm ảnh hưởng đến chất lượng và số lượng của tiểu cầu và cácdòng bạch cầu hạt khác [1, 8] Bằng các nghiên cứu, các nhà khoa học

đã phát hiện thấy các tế bào tiền thân dòng hồng cầu của các bệnh nhânnày có thể tạo hồng cầu mà không cần có sự kích thích củaerythropoietin (EPO) và bệnh do tổn thương tế bào gốc tạo máu tiếntriển có tính dòng Đây là bệnh lý ác tính khác với đa hồng cầu ditruyền do bất thường EPO – R (receptor của EPO).[9]

Theo báo cáo hàng năm, tỷ lệ bệnh nhân đa hồng cầu nguyên phátngày càng gia tăng theo độ tuổi từ 0.7 – 2.6/ 100.000 người ở Châu Âu[10] và 22/ 100.000 người ở bang Connecticut [11] Độ tuổi trung bìnhcủa các bệnh nhân đa hồng cầu nguyên phát từ 55 – 60 tuổi, hiếm khigặp các bệnh nhân có tuổi dưới 20 [10]

Chẩn đoán PV, thường đánh giá trên những tiêu chuẩn của cả lâmsàng và chẩn đoán phòng thí nghiệm Bệnh nhân PV có thể gặp cáctriệu chứng lâm sàng như đỏ mặt, đau tức ngực, gan lách to, đổ mồ hôi

về đêm, bị ngứa sau khi tắm nước nóng, mờ mắt, mệt mỏi sút cân, cócác triệu chứng thần kinh hoặc chóng mặt, đau đầu Bệnh thường tiếntriển qua hàng chục năm, điều trị chủ yếu bằng rút máu và hóa chất.Theo các nghiên cứu thì bệnh nhân PV thường có nguy cơ tắc mạch, dovậy cần phân biệt với các bệnh lý khác trong nhóm tăng sinh tủy mạn.[1, 9]

Ở các bệnh nhân PV thường có Hemoglobin, hematocrit tăng cùng vớihình ảnh tủy giàu tế bào và mang gen đột biến JAK2 [1, 3] Khi nghi ngờbệnh nhân mắc PV, cần được làm các xét nghiệm về đột biến gen JAK2 vànồng độ EPO huyết thanh

1.1.3 Bệnh lý tăng tiểu cầu tiên phát – Essential thrombocythemia (ET).

Tăng tiểu cầu tiên phát là bệnh lý thuộc nhóm bệnh tăng sinh tủy mạn áctính, được mô tả lần đầu vào năm 1934 tại nước Áo [6] Bệnh đặc trưng bởi

sự rối loạn, tăng sinh quá mức của tế bào gốc tạo máu nghiêng về dòng mẫutiểu cầu làm tăng số lượng tiểu cầu ở máu ngoại vi Các mẫu tiểu cầu tăngsinh trong tủy xương có rối loạn về biệt hóa dẫn đến tiểu cầu trưởng thành ởmáu ngoại vi có rối loạn về hình thái và chức năng khiến cho tiểu cầu có xuhướng tăng kết dính tự nhiên gây tắc mạch, huyết khối hoặc giảm kết dínhgây chảy máu trên lâm sàng [1, 2, 6]

Tỷ lệ bệnh nhân ET hàng năm dao động từ 0.6 – 2.53 trường hợp/100.000 người dân Độ tuổi trung bình của nhóm bệnh nhân này từ 50 – 55tuổi và chiếm ưu thế ở bệnh nhân nữ (tỷ lệ 2:1) [12, 13]

Hầu hết các bệnh nhân tăng tiểu cầu tiên phát được phát hiện bệnh mộtcách tình cờ khi làm xét nghiệm kiểm tra sức khỏe hoặc vào viện vì các biến

chứng hoặc chảy máu Các bệnh nhân này thường gặp lách to (> 50% cáctrường hợp), có các biểu biện của tắc vi động mạch (cơn đau buốt, hoại tử đầuchi, loét cẳng chân, tắc tĩnh mạch chi dưới, mạch lách, võng mạch, cơ tim…)hoặc gặp các biểu hiện chảy máu dưới da, niêm mạc tự nhiên hoặc sau sangchấn Trên tiêu bản máu ngoại vi thấy tiểu cầu tập trung thành đám lớn, cókích thước to nhỏ không đều, tiểu cầu khổng lồ, kèm theo hình ảnh tủy giàu tếbào, tăng sinh dòng mẫu tiểu cầu với nhiều hình thái [1].

Đột biến gen JAK2V617F được tìm thấy khoảng 50% ở bệnh nhân ET, với

tỷ lệ đồng hợp từ 2 – 4% Đột biến MPL trên exon 10 cũng được mô tả từ 2 – 5%bệnh nhân ET Đột biến có liên quan đến gen CALR được tìm thấy từ 15 – 25%bệnh nhân ET và PMF (không chứa gen đột biến JAK2 hoặc MPL) [14]

Bệnh nhân ET thường có khuynh hướng huyết khối hoặc chảy máu, cóthể chuyển dạng thành bệnh lý tăng hồng cầu nguyên phát, xơ tủy thứ pháthoặc hoặc bạch cầu cấp với tỷ lệ 2 – 10% các trường hợp [12, 13] Tăng tiểucầu có thể dẫn tới hội chứng von Willebrand gây nên chảy máu ở các bệnhnhân này Ở phụ nữ có thai, tăng tiểu cầu tiên phát có thể có nguy cơ huyếtkhối nặng hơn và thường sảy thai ở giai đoạn muộn [15]

1.1.4 Bệnh lý xơ tủy nguyên phát – Primary myelofibrosis (PMF).

Xơ tủy nguyên phát (Hay còn gọi là lách to sinh tủy) là bệnh lýthuộc nhóm bệnh tăng sinh tủy mạn ác tính, được mô tả lần đầu vàonăm 1879 tại Đức [6] Bệnh có đặc điểm là tăng sinh quá trình sinhmáu kèm theo xơ tủy và dị sản tủy ở gan và lách (Do tình trạng xơ hóatủy gây giảm sinh máu, sinh máu không hiệu lực dẫn đến tình trạngsinh máu bù ở ngoài tủy) [1]

Xơ tủy nguyên phát thường gặp ở nguời lớn tuổi Độ tuổi trung bình củanhóm bệnh lý này khi được chẩn đoán là 50 – 65 tuổi (những người nhỏ hơn

50 tuổi thường được chẩn đoán với tỷ lệ < 20%) Tỷ lệ sống trung bình của

nhóm bệnh nhân này là 5 năm, mặc dù có một số bệnh nhân có thể kéo dài sựsống trên 20 năm [16].

Đột biến gây xơ tủy nguyên phát có liên quan đến gen JAK2, MPL,TET2, CALR và EZH2, nhưng gen kích hoạt khởi đầu gây nên bệnh lý PMFhiện vẫn chưa rõ Theo các nghiên cứu trước đó, cho thấy bệnh lý xơ tủynguyên phát có 50 – 60% bệnh nhân mang đột biến JAK2V617F, 5 – 10%bệnh nhân mang gen đột biến MPL, và 15 – 25% mang đột biến CALR [16].Chẩn đoán xơ tủy nguyên phát được đánh giá theo tiêu chuẩn chẩn đoáncủa WHO 2016, dựa trên nguyên tắc cơ bản về hình thái các tế bào tủyxương, sự xuất hiện tình trạng xơ hóa và kèm theo có mang các gen đột biếnJAK2V617F hoặc MPL, CALR [17] Việc đánh giá hình thái tế bào tủyxương là rất quan trọng, từ khi phát hiện các sợi xơ hóa lắng đọng trong môsong song với diễn biến của bệnh Ở giai đoạn sàng lọc, không thấy dấu hiệucủa sự gia tăng reticulin và sợi collagen trong khi giai đoạn xơ hóa tủy xươngcho thấy sự gia tăng đáng kể reticulin và các sợi collagen [1] Sự có mặt từ 10– 19% của các tế bào blast trong máu hoặc tủy xương có thể xác định đượcbệnh đang diễn biến nhanh, và trên 20% các tế bào blast trong máu hoặc tủyxương có thể xác định bệnh chuyển sang dạng bạch cầu cấp [10]

1.1.5 Cập nhật tiêu chuẩn chẩn đoán tăng sinh tủy mạn của WHO năm 2016

Dựa trên sự kết hợp các đặc điểm di truyền học, hình thái tế bào học và

cơ sở phân tử của các bệnh lý di truyền thuộc nhóm tăng sinh tủy mạn ác tínhđược WHO xác định và cập nhật lại như sau: [7, 17, 18]

Tiêu chuẩn Tiêu chuẩn WHO 2008 Tiêu chuẩn WHO 2016

Đa hồng cầu nguyên phát (PV) 2 tiêu chuẩn chính và tiêu chuẩn phụ

Tiêu chuẩn

chính

1 Hb >18.5 g/dL (nam), >16.5g/dL (nữ)

2 Mang đột biến JAK2V617F

1 Hb >16.5 g/dL (nam), >16.0g/dL (nữ) hoặc Hct > 0,49(nam), > 0.48 (nữ)

hoặc đột biến JAK2/ exon 12 2 Mang gen đột biến

JAK2V617F hoặc JAK2/ exon 12.Tiêu chuẩn

phụ

1 Tăng sinh 3 dòng tế bào tủy

2 EPO huyết thanh giảm EPO huyết thanh bất thường.

Tăng tiểu cầu tiên phát (ET) 3 tiểu chuẩn chính và tiêu chuẩn phụ

3 Có mang gen đột biếnJAK2V617F

1 SLTC ≥ 450 x109/L

2 Tăng sinh lượng mẫu tiểucầu, có hình thái lớn, trưởngthành Không áp ứng tiêu chuẩncủa WHO cho CML, PV, PMF,tăng sinh tủy thứ phát

3 Có mang gen đột biến JAK2,MPL, CALR,

3 Có mang đột biến JAK2V617F

1.Tăng sinh mẫu tiểu cầu có bấtthường hình thái, đi kèm xơ tủy2.Không đáp ứng các tiêu chuẩncủa WHO với Ph(+), CML, PV,

ET, rối loạn sinh tủy, các bệnh

3.LDH huyết thanh tăng4.Thiếu máu

1 SLBC ≥ 11 x 109/L

2 Thiếu máu

3 Lách to

4 LDH huyết thanh tăng

1.2 Một số đột biến gen phổ biến gây bệnh tăng sinh tủy mạn ác tính.

Năm 2005, hơn 20 kiểu đột biến đã được phát hiện và mô tả ở các bệnhnhân tăng sinh tủy mạn ác tính Các đột biến này có liên quan đến con đườngJAK-STAT, yếu tố đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển của tế bào vàsinh bệnh học của nhóm bệnh lý này [19] Các dạng đột biến trong nhómbệnh lý này thường xảy ra với tần suất lớn trên các gen JAK2 và CALR [20].Trong đó đột biến JAK2V617F trên exon 14 được tìm thấy đầu tiên ở nhữngbệnh nhân tăng sinh tủy mạn ở nhóm có NST Ph âm tính [3, 21].

1.2.1 Đột biến gen JAK2V617F [3, 9, 21–23].

Janus kinase 2 (JAK2) là một protein có hoạt tính tyrosine kinase trong

tế bào chất, là thành phần quan trọng, tham gia vào quá trình truyền tín hiệu

từ các receptor của các yếu tố kích thích tạo máu (growth factor) và đóng vaitrò chủ chốt trong con đường JAK-STAT (phân tử truyền tín hiệu và hoạthóa phiên mã) Protein JAK2 được hoạt hóa khi các receptor trên màng tếbào gắn với các yếu tố kích thích tạo máu Sau khi được dimer hoạt hóa,JAK2 gắn với các phân tử STAT, phosphoryl hóa để các phân tử này đi vàonhân tế bào, gắn lên DNA đặc hiệu và bắt đầu quá trình phiên mã làm tăngsinh và biệt hóa tế bào

Protein JAK2 có trọng lượng phân tử khoảng 130 kDa, gồm 1132 acidamin Cấu trúc phân tử của JAK2 gồm 2 vùng quan trọng: JH1 là vùng cóhoạt tính tyrosine kinase (chứa các tyrosine cần thiết để kích hoạt JAK2), JH2

là một miền pseudokinase có cấu trúc tương tự như vùng JH1 và là vùng cóhoạt tính enzyme Ở trạng thái bình thường, hoạt tính tyrosine kinase củavùng JH1 luôn bị ức chế bởi tác dụng của vùng JH2

Hình 1.1 Cấu trúc phân tử protein JAK2

Gen JAK2 nằm trên cánh ngắn của NST số 9, (9p24) gồm 15 exon, dàikhoảng 152kb, chứa các trình tự nucleotid mã hóa cho việc tổng hợp proteinJAK2 Năm 2005, bốn nhóm nghiên cứu độc lập bằng những phương phápnghiên cứu khác nhau đã phát hiện đột biến điểm G  T trên exon 14 của genJAK2 ở vị trí nucleotid 1849 Sự thay thế G  T trên gen JAK2 làm biến đổiacid amin valine ở codon 617 thành phenylalanine xảy ra ở vùng JH2 củaprotein JAK2

Hình 1.2 Gen JAK2 đột biến trên exon 14

Đột biến JAK2V617F này làm phá vỡ khả năng tự điều hòa của vùngJH2 gây tăng hoạt tính tyrosine kinase của protein này, thậm chí ngay cả khikhông có các yếu tố kích thích tạo máu và kết quả là tăng sinh không kiểmsoát được các tế bào tạo máu Dạng đột biến này thường gặp ở 96% bệnhnhân đa hồng cầu nguyên phát, 55% trường hợp tăng tiểu cầu tiên phát và65% các trường hợp xơ tủy nguyên phát Đây cũng là xét nghiệm giúp phânbiệt với bệnh lý đa hồng cầu di truyền do dột biến gen mang thông tin tổnghợp EPO – R Như vậy, có thể thấy đột biến JAK2V617F có vai trò quantrọng trong cơ chế sinh bệnh học ở nhóm bệnh nhân tăng sinh tủy mạn ác tínhvới NST Ph (-).

Người ta quan sát thấy đột biến JAK2V617F xảy ra từ tế bào gốc sinh máu

và trên cả những tế bào nguồn sinh máu đa tiềm năng Đột biến này được pháthiện trên tất cả các tất cả các dòng tế bào sinh máu, bao gồm cả lympho B vàlympho T Cho đến nay, người ta vẫn chưa phát hiện thấy đột biến JAK2V617F

ở những người khỏe mạnh hay những bệnh nhân có tình trạng tăng sinh tủy phảnứng Đây là một đặc điểm rất quan trọng giúp chẩn đoán phân biệt các bệnh tăngsinh tủy mạn tính với các bệnh tăng sinh tủy phản ứng

1.2.2 Đột biến gen CALR (type 1 và type 2) [20, 24–28].

Calreticulin là một gen mã hóa protein Calreticulin, một protein liên kết

Ca2+ với hoạt động đa chức năng, thường tập trung phần lớn ở lưới nội sinhchất trong tế bào, protein này còn có thể tìm thấy trên bề mặt tế bào hay trong

tế bào chất Tại lưới nội sinh chất, Calreticulin đóng vai trò quan trọng trong

sự hình thành các nếp gấp của các protein mới hình thành (việc gấp khúc củacác chuỗi polypeptid) Đồng thời liên kết với Ca2+ và duy trì nồng độ của Ca2+

trong tế bào giúp kiểm soát hoạt động gen, thúc đẩy sự phát triển và phân chia

tế bào, gắn kết, điều chỉnh tế bào và có liên quan đến chu trình apoptosis.Ngoài ra Calreticulin còn có chức năng ngoại bào khác liên quan đến điều hòađáp ứng miễn dịch

Protein Calreticulin có trọng lượng phân tử khảng 46 kDa, được hìnhthành bởi 3 vùng cấu trúc và có chức năng quan trọng: (1) Vùng N-domaintận liên kết lectin có vai trò quan trọng trong việc gắn Zn2+ và các hoạt độngchức năng liên quan đến nó (2) Vùng P-domain giàu proline liên kết với Ca2+

nồng độ thấp và (3) vùng C-domain có chứa nhiều vị trí để liên kết Ca2+ đểtạo nên các hoạt động đa chức năng Calreticulin ở lưới nội sinh chất đượcgắn một tín hiệu KDEL (KDEL là một trình tự gồm 4 acid amin: Lysin –Aspartate – Glutamat – Leucin, có tác dụng như một tín hiệu cho việc lưu giữprotein này tại lưới nội sinh chất đồng thời thu hồi protein này từ bộ Golgi trởlại lưới nội sinh chất để thực hiện các chức năng quan trọng của nó)

Hình 1.3 Cấu trúc phân tử protein Calreticulin

Gen Calreticulin nằm trên cánh ngắn của NST 19 (19p13) gồm 9 exon,dài khoảng 5.89 kb mã hóa cho việc tổng hợp protein Calreticulin Các đột biếnđược phát hiện trên exon 9 của gen CALR xảy ra do thêm đoạn hoặc mất đoạnhoặc kết hợp cả 2 dạng đột biến tạo nên một đột biến dịch khung, làm thay đổitrình tự chuỗi acid amin tại vùng C-domain cuối cùng tạo nên protein đột biến bịthiếu tín hiệu KDEL Ca2+ gắn với protein đột biến này gây phá huỷ bề mặt tếbào, từ đó gây phần chia 1 phần CALR với lưới nội sinh chất Đột biến genCALR phổ biến, được ứng dụng nhiều trong nghiên cứu gồm 2 type:

- Type 1: Đột biến mất đoạn 52 bp (p.L367fs*46) Dạng đột biến type 1thường chiếm tỷ lệ ≈ 50% các trường hợp đột biến CALR

- Type 2: Đột biến thêm đoạn 5bp TTGTC (p.K385fs*47) Dạng đột biếntype 2 thường gặp ≈ 30% các trường hợp đột biến CALR

Hình 1.4 Gen CALR đột biến trên exon 9

Với các tế bào gốc sinh máu và tế bào nguồn sinh máu đa tiềm năng, độtbiến CALR có thể không làm giảm quá nhiều lượng Ca2+ được gắn trênprotein Calreticulin ở lưới nội sinh chất làm tín hiệu con đường calcineurin –NFAT (Nuclear factor of activated T cell) hoạt động kém hiệu quả hơn gâykích thích các tế bào gốc sinh máu dòng tủy và tế bào nguồn dòng mẫu tiểucầu phát triển (Không bao gồm các tế bào nguồn dòng hồng cầu) Điều này cóthể giải thích cho chúng ta thấy trong nhóm bệnh MPN cổ điển, đột biến genCALR được tìm thấy ở nhóm bệnh nhân ET và PMF Tuy nhiên, cũng theo 2nhóm nghiên cứu khác nhau trong thời gian gần đây đã chứng minh đột biếngen CALR gây kích hoạt con đường JAK2 thông qua sự liên kết với gen MPL

và gây nên cơ chế tăng tiểu cầu

1.3 Một số phương pháp chẩn đoán sinh học phân tử.

1.3.1 Polymerase chain reaction (PCR) và AS – PCR [29, 30].

PCR là phản ứng hóa học tổng hợp DNA dựa trên khuôn mẫu ban đầunhờ hoạt động của enzyme DNA polymerase Phản ứng dựa trên sự thay đổinhiệt độ theo chu kỳ, trải qua 3 giai đoạn: (1) DNA khuôn được biến tính từsợi đôi thành sợi đơn ở nhiệt độ cao (92º đến 95º) (2) Nhiệt độ được hạ thấpxuống từ 55º đến 65º để tạo điều kiện cho mồi gắn vào DNA khuôn (3) Nhiệt

độ tăng lên khoảng 72º cho enzyme DNA polymerase hoạt động tổng hợp kéo

dài chuỗi DNA nhờ trình tự mồi Sau 3 bước nhiệt độ, chu trình phản ứngđược lặp lại liên tiếp từ 30 – 35 lần Lượng DNA tạo ra là A x 2n (trong đó A

là số khuôn DNA ban đầu, n là số chu kỳ nhiệt của phản ứng)

Allele specific PCR (AS – PCR): Là một kỹ thuật cải tiến của PCRthông thường, được ứng dụng trong sàng lọc và phát hiện các đột biến ditruyền Kỹ thuật này dựa trên nguyên tắc thiết kế một đoạn mồi có trình tự saikhác so với trình tự đặc hiệu một nucleotid ở đầu 3’ để ngăn cản quá trình kéodài chuỗi DNA của enzyme Tag polymerase trong phản ứng PCR Trongphương pháp này, 2 ống phản ứng PCR được thiết kế song song: ống thứ nhấtđược sử dụng cặp mồi primer đặc hiệu cho allele bình thường, ống thứ hai sửdụng cặp mồi để khuếch đại allele đột biến Vì vậy, trong phản ứng PCRthường có ít nhất một sản phẩm: Nếu trường hợp dị hợp tử thì 2 ống PCR đều

có 1 băng sản phẩm khi điện di, nếu trường hợp đồng hợp mang gen bệnh thìống thứ hai xuất hiện băng sản phẩm, ngược lại, nếu đồng hợp mang gen bìnhthường thì chỉ có ống thứ nhất xuất hiện băng đặc hiệu

1.3.2 Real time PCR [29, 31].

Real-time PCR là kỹ thuật PCR mà kết quả khuếch đại DNA được hiểnthị ngay sau mỗi chu kỳ nhiệt của phản ứng thông qua hệ thống nhận biết củamáy Các sản phẩm của quá trình PCR được gắn huỳnh quang và dựa vàongưỡng phát hiện huỳnh quang, từ đó sẽ biết được lượng DNA đích ban đầu cótrong ống phản ứng Sử dụng các chất huỳnh quang gắn vào sợi DNA kép nên

kỹ thuật PCR định lượng có độ nhạy và độ đặc hiệu cao hơn nhiều so với PCRtruyền thống Đặc biệt với real-time PCR, phản ứng được thực hiện trong hệthống kín, không cần thêm các thao tác phân tích kết quả sau phản ứng, do đó rútngắn được thời gian thực hiện và giảm thiểu nguy cơ lây nhiễm

Kết quả của Real-time PCR được thể hiện qua biểu đồ khuếch đại phảnứng và được biểu thị ngay trên máy sau mỗi chu kỳ nhiệt của phản ứng Biểu

đồ này biểu biện cường độ huỳnh quang phát ra từ các ống phản ứng khi nhậnnguồn ánh sáng kích thích (trục Y) tương ứng với sự gia tăng của các chu kỳnhiệt (trục X) của phản ứng Sự khuếch đại DNA trong phản ứng Realtime-PCR trải qua 3 giai đoạn chính như sau:

- Giai đoạn ủ: Xảy ra trong những chu kỳ đầu của phản ứng DNA đíchđược nhân lên và gắn huỳnh quang nhưng số lượng còn ít, cường độ huỳnhquang thấp chưa đủ phát ra ánh sáng để máy ghi nhận Giai đoạn này đượcbiểu thị bằng một đường nằm ngang trong biểu đồ khuếch đại phản ứng

- Giai đoạn lũy thừa: Khi số lượng bản sao DNA đích đạt đến mộtngưỡng nhất định, sản phẩm DNA có gắn huỳnh quang phát ra cường độhuỳnh quang đủ để máy ghi nhận được Trong giai đoạn này, số lượng bảnsao DNA và cường độ huỳnh quang đều tăng gấp đôi sau mỗi chu kỳ nhiệtcủa phản ứng Lúc này đường biểu diễn khuếch đại phản ứng trong đồ thị bắtđầu đi lên

- Giai đoạn bình nguyên: Là giai đoạn kết thúc của quá trình phản ứng,khi lượng dNTP cạn kiệt dần và enzyme Tag polymerase hoạt động khôngcòn hiệu quả Giai đoạn này số lượng bản sao DNA đích và cường độ huỳnhquang sẽ chậm dần và đạt đến bình nguyên bằng một đường nằm ngang trongbiểu đồ khuếch đại phản ứng

Hình 1.5 Biểu đồ khuếch đại của phản ứng Realtime-PCR

Chất phát huỳnh quang được sử dụng cho phản ứng Real-time PCRthường được chia thành 2 loại:

- Dùng chất phát huỳnh quang là một loại màu chèn vào sợi đôi DNA Khi

có sự xuất hiện của sản phẩm khuếch đại PCR thì chất màu huỳnh quang sẽ bịchèn vào và tập trung trên các sợi đôi DNA làm cho tube phản ứng phát huỳnhquang khi bị chiếu bởi nguồn sáng kích thích Trước đây Ethidium bromideđược sử dụng làm chất chèn nhưng sau này thường sử dụng nhất là SYBR I vìcác ưu điểm vượt trội như màu huỳnh quang nền thấp, khả năng chèn vào sợi đôicao nhưng không làm sợi đôi gắn chặt vào nhau khi bị biến tính

- Dùng chất phát huỳnh quang là các đoạn trình tự dò – probe: Là nhữngđoạn oligonucleotide sợ đơn có trình tự có khả năng bắt cặp bổ sung đặc hiệuvới DNA đích Khi có mặt của sản phẩm khuếch đại đặc hiệu trong ống phảnứng thì sẽ có sự bắt cặp của probe lên trình tự đặc hiệu của sản phảm khuếch

đại dẫn đến sự phát huỳnh quang khi nhận được nguồn sáng kích thích.Cường độ huỳnh quang phụ thuộc vào số lượng probe bắt cặp (phụ thuộc vào

số lượng bản sao DNA đặc hiệu hiện diện trong ống phản ứng)

1.3.3 Next Generation Sequencing – NGS

Giải trình tự gen (DNA sequencing) là phương pháp xác định trình tựsắp xếp của 4 loại nucleotid gồm: A (Adenine), T (Thymine), G (Guanine) và

C (Cytosine) trên phân tử DNA Trong những năm trước đây, việc đọc trình

tự DNA còn gặp nhiều khó khăn do máy móc có giá thành cao, mất thời gian

để đọc toàn bộ hệ gen do vậy chỉ phù hợp cho kiểm tra các gen riêng lẻ vàmột số xét nghiệm chẩn đoán phân tử sử dụng trong các phòng thí nghiệm yhọc như di truyền phân tử, di truyền dược học, bệnh về máu và vi sinh…Công nghệ giải trình tự gen được ứng dụng trong những năm gần đây vớinhững ưu điểm như: độ nhạy và độ chính xác cao, hiệu suất cao, đã phát triểnnhanh chóng và trở thành một công cụ phân tích quan trọng cho các nhà ditruyền học Ngày nay, các công ty thương mại đã cho ra đời các thế hệ máyđọc trình tự dựa trên nhiều công nghệ mới (Next Genration Sequencing -NGS) Các kỹ thuật đọc trình tự gen đã trở nên đơn giản và nhanh hơn nhờ sựứng dụng huỳnh quang phân tích tự động [32, 33] Các công nghệ đọc trình tựmới luôn có xu hướng làm tăng dung lượng (throughput), làm giảm thời gian

và hạn chế bớt chi phí xét nghiệm [34]

Sự phát triển mạnh mẽ của kỹ thuật NGS là một cuộc cách mạng trongcông nghệ đọc trình tự nói riêng và trong công nghệ sinh học phân tử nóichung Với các tiến bộ về thiết bị và hóa chất, hiện nay đọc trình tự bộ gencủa một cơ thể sống có thể được thực hiện tại các phòng thí nghiệm với thiết

bị đọc trình tự thế hệ mới như Illumina MiSeq, Ion-Torrent PGM,…trong thờigian ngắn (thậm chí chỉ trong 24 giờ) thay vì phải kéo dài hàng năm Trình tự

bộ gen có thể được đọc dễ dàng với các thiết bị có công suất nhỏ khoảng 6-10