Ứng dụng kỹ thuật real time PCR để phát hiện đa hình đơn nucleotid rs2856718 của gen HLA DQ trên bệnh nhân ung thư biểu mô tế bào gan

TKf V*: -u LÕI CÂM ƯN' Khóa luận tốt nghiệp lã nhùng cột mốc đãng nhớ nhất, đánh dấu cho trinh học tập nghiên cữu cua sinh viên trường dại hục Đê hồn thảnh khố luận nỗ lực cua ban thân, em dã nhặn dược rat nhiều giúp dờ từ phia thầy gia dính bạn bẽ Vởi lịng kinh trọng vã biết ơn sâu sắc em xin bày to lời cam ơn chân thành tới: Ban Giám Hiệu Phòng Quàn lý Dào tạo Dại học, Khoa Kỹ thuật Y học, Trung tám nghiên cứu Gene Protein - Trường Dai học Y Hà Nội, Bệnh viện K trung ương (cơ sờ 3) dà lạo điều kiện thuận lợi giúp em hồn thành khóa luận Em xin chân thành cám ơn GS TS Tạ Thành Vàn Giám đổc trung tám nghiên cứu Gene & Protein, người Thầy dà tọo diều kiện cho em thực khõa luận trung tàm Đặc biệt em xin giri lời cám ơn chân thành nhát tới TS Nguyền Trọng Tuệ người dà trực tiếp hướng đần tận tình dạy bao tạo diều kiện giủp dờ cho em suốt trinh thực khóa hiỳn Em xin cám ơn rs Nguyễn Thu Thúy, người dà hướng dẫn chia se cho em kỳ thuật kinh nghiệm hữu ích trinh thực khóa luận, cúng thầy cỏ vã anh chị trung tàm nghiên cửu Gen & Protein, cãc thầy cỏ khoa Kỳ thuật Y học Trưởng Dại học Y Hà Nội dà tạo diêu kiện thuận lợi cho em suốt trinh học tập hồn tìiành khóa luận nảy Cuối cũng, em xin giri lời cam ơn lới bố mẹ người thản, bạn bè dà quan tàm dộng viên em suốt quã trinh học tập nghiên cứu Há Nội ngày thũng nãm2021 Nguyễn Thị Thúy TM/ zfci V*: 4Ả 'V LỜI CAM ĐOAN Kinh gũi: Phòng Quán lý Dào tạo Dại hục - Trường Dại học Y Hà Nội Hội chấm khóa luận tốt nghiệp Em Nguyễn Thi Thúy, sinh xiên tô 31 lớp Y4K chuyên ngành Xét nghiệm Y học niên khóa 2017 2021 Trưởng Đại học Y Hà Nội Em xin cam đoan: Đây khóa luận ban thân em trực tiếp thực hướng dản cùa TS Nguyền Trọng Tuệ Nghiên cửu khòng trùng lặp với bat kỷ nghiên cứu khác đă công bố trước đày Cãc số liệu xà thõng tin nghiên cứu lả hỗn tồn chinh xãc trung thực X’ã khách quan Em xin hoàn toàn chịu trách nhiộm ve nhùng cam kết Hà Nội, ngày tháng nâm2()2l Sinh xiên Nguyễn Thị Thúy TM/ zfci V*: 4Ả 'V Mực LỤC LỜI CẢM ƠN’ LỜI CAM ĐOAN DANH MỤC CHỮ MÉT TÁT DANH MỤC BÁNG DANH MỤC HÌNH TÀI LIỆU THAM KHAO PHỤ Lực Chữ viết tất Nghía cùa chửviểt tát HCC Hepatocellular carcinoma HBV Hepatitis B virus HCV Hepatitis c virus HIV Human immunodeficiency \-irus HLA AFB1 Human Leukocyte Antigen Aflatoxin Bl PCR SNPs Polymerase Chain Reaction Single nucleotide polymorphisms DNA Deoxyribonucleic Acid WHO World Health Oiganization A Adenine T G Thymine Guanine c OD Cytosine Optical Density EDTA Ethylen Diamin Tetra Acetic TM/ V*: DANH MỤC BANG TM/ V*: DANH AIỤC HÌNH ĐẬT VÁN ĐÈ ơrtg thư nhõm bệnh liên quan đến việc tăng sinh tể bão cách kiêm soảt nhùng tế bảo có nàng xâm lấn mị khác bảng cách phát triển trực tiếp x mô lân cận di chuyên dền nhùng phận khác the (di căn) Không phai tất ca khối u ung thư cỏ số khối u thuộc X'ào nhóm lành tinh, tức lã khồi u khơng xâm lẩn phận khác cua thê Hiện cỏ khoáng 100 loại ung thư anh hương đến sống ngườiL Trong càc loại ung thư ung thư gan nguyên phải sảubệnh ung thư phố biến vã nguyên nhãn gảy tư vong lớn thử ba trài the giới (khoang 830.000 trường họp tương dương 8.3% tồng sổ ca tư vong ung thư), dặc biệt nước chưa phát triển Khoang 80% ung thư gan nguyền phát ung thư biêu mỏ tể bão gan (HCC) ’ Sự hinh thảnh khối u cùa HCC quã trinh phức tạp liên quan den nhiều yếu tố nguy Sự phó biến cua yểu tố nguy thay dối theo phán bố cua HCC ưẽn toàn the giởi.Nhicm virus xiêm gan B mãn tính (HBV) xà Aflatoxin Bl (AFB1) lã yếu tố nguy khu vực dang phát triển Trung Quốc vả Án Dộ Ớ khu vực dã phát trieiL HCC chu yếu phát triển từ xơ gan virus xiẻm gan c (HCV) bệnh gan nhiễm mờ không rượu (NAFLD) Ngoài nhiêu nghiên cứu dà chi da hỉnh gen liên quan den trinh gây ung thư khác Đo dó SNPs có thê dóng vai trỏ quan trọng để xác định tinh nhạy cám cùa người HCC tử dó giúp ích cho việc phịng ngừa điều trị HCC s Kháng nguyên bạch cầu người HLA (Human Leukocyte antigen system) dề nghiên cửu quan trọng dổi với di truyền cùa người Giừa chúng tộc có khác biệt lớn hệ thong HLA Dó CO the lí dản tới kliác biệt tiến triển bệnh chúng tộc khác I0 Cãc HLA-DỌ có tính đa hình cao đặc biệt exon mà hóa cho vị tri gắn kháng nguyên đỏng vai trò quan ưụng việc dưa kháng nguyên virus vào tế bão miễn dịch từ dó giúp thái tế bào bị nhicm virus hay tế bào u n SNP rs2856718 nằm khu vực gen HLA-DQA2 vã HLA-DQB1 Nghiên cửu cùa Hu cộng đà chi rang HLA-DQ rs2856718 làm giám dáng kê nguy HCC cùa vật chu Nghiên cúu cua người Liu cộng chi rõ kiêu gen GG cùa HLA-DQ rs2856718 cỏ the yếu tố bào vệ dổi với nhiẻm HB V ticn triển cua HCC liên quan den HBV 12 1J u Chân triệu đốn chứng ung thư lâm biêu sàng mị thường te bào xuầt gan sớm muộn ưong thách thức, trinh phát nguy trièn ung HLA-DQ thư, 132856718 nên việc điều nghiên cần cứu thiết nhùng đề yểu xác tố định tinh việc nhạy phòng cám ngừa cùa diều người trị dối HCC với Đà HCC có từ dó nghiên giúp ich cứu cho đảnh nhạy cam với HCC liên quan SNP rs2856718 den HBV cùa nhiên gen HLA-DQ kết qua vã côn tinh nhiều giá mối tranh liên cài quan ,này ,cho Ilơn người Việt chưa Nam có Do nghiên cứu de tài đánh nghiên hình đơn cứu: rs28567J8 "úng dụng cùa kỹ gen thuật HH-DỌ Real-time bệnh PCR nhân dế ung phát thư biển da Iitó tỳ lệ tế kicu bào gen gan" cua dược da hình thực thái đơn rs2856718 mục tiêu: Xác cua định gen HLA-DQ dược trẽn bộnh nhân ung thư biêu mô te bào gan CHƯƠNG TÔNG QUAN TÀI LIỆU 1.ỉ Tống quan ung thư biếu ntò tế bào gan l.lã Sư lược ung thư biếu mô tế bào gan Ưng thư gan gồm ung thư gan nguyên phát vả thử phát Ưng thư gan thử phát tế bảo ung thư cảc phận khác cua thê di vào gan gây khối u di cản Ưng thư gan nguycn phát bộnh lý ãc tinh cua gan xay tế bào bính thường cua gan trớ nên bất thường lùnh thái chức nàng Các tế bào ung thư phát triển gây anh hương den mó bính thường lien kề vã cỏ the lảy lan sang vùng khác cua gan quan ben gan Ưng thư gan nguyên phát gồm loại chính: ung thư biểu mỏ tế bão gan (phát triẽn từ tế bào gan), ung thư biêu mỏ dường mật (phát triển từ dường mật gan) u nguyên bào gan (Hepatoblastoma) Trong dó ung thư biếu mỏ tế bào gan (Hepatocellular cancer HCC) (Hình 1.1) lả hay gặp nhầt:í Hình ỉ I Vng thư biểu mị tế bào gan • Ung thư biếu mị tế bào gan ưong nhùng khối u ác tinh phỗ biến nhất, lả nguyên nhân hãng đầu gày tư vong liên quan đến ung thư toàn thể giới Theo thống kè cua Tơ chức ¥ tế The giới năm 2020 HCC xếp hạng thứ sáu tỳ lệ mắc vã thứ ba ty lộ tư vong, gảy khoang 906.000 ca mắc vã 830.000 ca tứ vong năm Tý lệ mắc HCC khác theo vùng địa lý hầu het trường hợp HCC xây cãc khu vực kẽm phát ưiên hạn Dông Á (chiếm 54.8% trường hợp) Dông Nam Á (chiếm 10.8% trường hợp) 2.16? Nam cỏ tý lộ măc I ICC' cao lum nừ (2 lần)2 Tuồi thường từ 40 50 l6 Việt Nam đày loại ung thư đứng hàng thử Ước tinh mồi nàm có 10.000 trưởng hợp mẩc mói tỳ lệ nam gầp khoang lần nữ tinh phía Nam cao lum phía Bắc Việt Nam nam sổ quốc gia cỏ tỳ lộ mắc ung thư gan cao giới1S 1.12 Các yểu tổ nguy chinh - Virus xiêm gan B (HBV): theo sỗ liộu cua Tố chức Y tế The giới (WHO) năm 2016 dựa trẽn số nghiên cứu từ 2003 đen 2014 tỳ lệ nhiễm HBV người lởn Việt Nam khoang 8.2 19% Nhiều nghiên cứu phàn tích gộp (meta - analysis) chứng tỏ nguy HCC ngưởi nhiễm IIBV cao lum 15-20 lần so với người không nhiễm Nguy bị HCC đời cua người nhiễm HBV mạn khoang 10 25% Có nhiều yếu tố làm tâng nguy HCC ngưởi nhiem HBV mạn bao gồm cãc yểu tố hình thãi (nam giới, tuổi lởn tiền sir gia dính cỏ người bị HCC) virus (mức độ nhãn ban HBV cao kiểu hình HBV thời gian nhiễm IIBV dồng nhiêm với HCV HIV) lâm sàng (có xơ gan) vả mói trưởng lối sổng (phơi nhiễm với Aflatoxin, nghiện rượu nặng, hút thuốc lá) 19 - Virus viêm gan c (HCV): theo số liệu cua Tố chức Y tế Thế giỏi (WHO) nám 2016 dựa trẽn số nghiên cửu từ 2003 đến 2014 ty lệ nhiễm HCV người lởn Việt Nam khoang - 3.3% Một phản lích gộp số nghiên cím bệnh chúng cho thấy người có kháng khàng HCV cỏ nguy cư bị HCC gắp 17 lần so với người khơng có kháng thè kháng HCV 19 - Đồng nhicm HBV vã HCV: làm táng nguy cư bị HCC Trong nghiên cứu 24091 trưởng hợp HCC tụi mien Trung vả miền Nam Việt Nam thời gian 2010 đến 2016 tý lệ đồng nhicm HBV HCV 2.7% 19 - Sir dụng đồ uống có cồn: phàn tich gộp 19 nglũẻn cứu tiến cứu ghi nhận nguy HCC tăng 16% người sư dụng từ đưn vị dồ uổng có cồn ưư lên ngày tảng 22% nhùng người sư dụng từ dim vị dồ uống có cồn trứ lèn mồi ngày, nguy cư tảng cá chi sư dụng lượng cồn thầp mồi ngây (25g mồi ngảy tương ứng với đơn vị dỗ uổng cỏ cồn ngày) Ớ Việt Nam chưa có sổ liệu thức VC mối liên quan giừa HCC vã việc sứ dụng đồ uống cỏ cồn Theo nghiên cứu trẽn 1617 bệnh nhân HCC miền Trung miền Nam Việt Nam có 68.6% bệnh nhân dã vã dang sư dụng uống cõ cồn với nhiều mức dộ khác 19 19 Ngoài nguy hiềm ung gặp thư biêu Aflatoxin mỏ tề bão Dioxin gan cỏ Do dó số nên yếucỏ sàng tố lục siéu phát ảm ô bụng, sớm xét ung nghiệm biêu định mỏ lượng tế Alpha feto bang protein cách làm yếu (AFP) tố nguy thư cư AFP 06 thư tháng lầnbảo chogan nhùng người 37 Nhộn xét: Từ bang 3.3 kết qua kiêu gen cua SNP rs285671S cùa gen HLA-DQ mầu DNA đà lách chiết, linh dược ti lệ phần trảm kiêu gen 30 mảu nghiên cứu sau: - Kiêu gen AA: có 09 mẫu ưong tống sổ 30 mầu nghiên cứu cỏ kiểu gen AA chi cm tý lộ 30% - Kiêu gen AG: cỏ 13 mầu tông sổ 30 mầu nghiên cúu cỏ kiêu gen AG chiếm tý lộ 43.3% - Kiêu gen GG: cỏ OS mầu ữong tông số 30 mầu nghiên cứu có kiêu gen GG chiếm tý lộ 26.7% Bang 3.4 Tỷlệkiểugen uờ alen SNP rs2856718 gen HLA-DỌ Kiểu gen Alen AA AG GG Tống A G Tông Số lượng 09 13 08 30 31 29 60 Tỷ lệ (0/o) 30 433 26.7 100 51.65 48.35 100 TC V*: 38 CHƯƠNG BÀN LUẬN 4.1 Đặc điếm cua nhỏm nghiên cứu Nghiên cứu cùa đà lựa chọn 30 bệnh nhãn ung thư biêu mỏ te bào gan phù hợp với tiêu chuản lựa chọn Độ tuổi cua bệnh nhãn ung thư biêu mỏ tế bão gan dao động từ 34 tuói đến 80 tuổi, với tuổi trung binh 57.6 ± 9.84 Ket qua tuỏi nung binh cao so với với tuôi trung binh cùa cảc bệnh nhân mắc ung thư biêu mỏ tế bão gan trèn giới (40 - 50 tuồi)w Trong nghiên cữu bệnh nhản nam chiếm 73.3% bệnh nhản nừ chiêm 26.7% Nam mảc ung thư biêu mô tế bão gan nhiều nữ với tý lộ nam : nữ 2.75 Kết qua phù hợp với nghiên cữu khác trẽn thể giới ty lệ mấc bệnh gi ùa nam vã nừ tý lộ bệnh nhãn nam cao nừ 4.2 lần Kct tách chiết DNA Trong vãi thập ky ươ lại với phát triên nhanh chóng cua khoa học kỳ thuật, ngành công nghệ sinh học có bước tiến nhanh chóng vượt bậc đặc biệt kỳ thuật sinh học phân tư ửng dụng y học đà đóng góp phẩn rầt lớn cơng chuẩn đốn sớm châm sỏc bao vệ sức khỏe người Một quy trinh chung cua xét nghiệm sinh học phản tử đcu bao gốm ba phần đõ lả: kỳ thuật tách chiết DNA RNA; kỹ thuật PCR Real-time PCR cuồi kỳ thuật SIIPT dùng đê phân tích giai trình tự gen sứ dụng enzyme cắt giới hạn Trong nghiên cứu dã sư dụng phương pháp sinh học phân tư bao gồm: tách DNA từ mẫu mỏ vã kỳ thuật Realtime PCR de xác định SNP rs2856718 cua gen HLA-DQ trẽn bệnh nhàn ung thư biêu mõ tế bào gan Đẽ dạt dược mục tiêu mà nghiên cứu đề trước tiên ta pỉiai tách dược mầu DNA đạt chất lượng từ mầu mô cùa bệnh nhãn Tách chiết DNA có thê dưực thực cãc loại bệnh phâm khác như: TM/ V*: 39 mầu mỏ máu ngoại VỆ dịch thê nghiên cứu chúng tơi chọn mầu mơ ví dây loại mầu dược lưu trừ sờ Giãi phầu bệnh, thuận tiện cho việc lầy mầu, dồng thời mầu mị đà đúc paraffin có thè bao qn lâu dải nhiệt độ phịng Mầu mơ đà dúc paraffin cua bệnh nhân tham gia nghiẻn cứu dược cắt thảnh lát móng có kích thước khống pin lầy - manh cắt báo quán ưong eppendorf nhiệt độ phơng Có rẩt nhiều phương pháp dê tách dược DNA từ mẫu mô nghiên cửu chúng tịi tách chict DNA từ mầu mơ dà đúc paraffin kít hỏa chất QIAamp FFPE Tissue cua hàng Qiagen bơi tiộn lọi tiết kiệm mà đạt dược chầt lượng dà đề Ưu diêm cùa phương pháp hỏa chắt dóng sần dam bao vò trũng dễ sư dụng tliao tãc thực kỳ thuật sư dụng không cần pha chế Quy trình tách chiết thực theo khuyến nghị nhà sán xuất toi ưu cua phông xẽt nghiệm dê thu dtrợc san phàm DNA cỏ nồng dộ độ tinh cao Bén cạnh nhùng ưu điềm, kít vần cỏ vãi nhược diem như: phụ thuộc vào nhà san xuầt vá giá thành cao so với phương pháp tách chiết bảng hóa chất thơng thường cổ điển Tách chiết DNA kỷ thuật vó quan trọng bơi SC anh hương xấu đến cãc kỳ thuật VC sau Real-time PCR chất lượng san phẩm tách chiết khơng tốt Do dó sau hỗn thành q trinh tách chiết DNA san phàm thu phai dược kiêm tra chắt lượng độ tinh sạch, cỏ phương pháp dè thực kiêm tra bao gồm: mật dộ quang học diện di DhỉA tông sổ sư dụng mồi nội chuẩn Trong nghiên cứu đà lựa chọn hai phương pháp dó sư dụng phương pháp đo mật độ quang học bảng máy Nano Drop 2000c bước sóng 260nm 280nm đẻ kiểm tra độ tinh vã đo nồng độ cua mầu DNA vã sư dụng phương pháp điện di DNA tông số de Idem tra chất lượng cua DNA sau tách chiết Đối với phương pháp mật độ quang học bảiig máy Nano Drop 2000c ini diem cua phương pháp dơn giãn, dẻ thực hiện, tiết kiệm chi phí khơng TM/ V*: 40 d Bèn cạnh dó yếu tồ nồng độ chiếm phần quan trọng anh hương dển phan ứng Real-time PCR vã sổ kỳ- thuật sau Dổi với phương pháp diện di DNA tòng số ban chất cua phương Khi pháp cỏ mặt sau: cua Trong dòng dung điện, dịch phản phàn từ ADN tử DNA di tích chuyên ảm(-) phia cựckhông tốc dương độ khác (+) Các đoạn gcl: DNA đoạn kích ngấn thước chạy khác nhanh, sè đoạn chạy dải với chạy nhuộm chậm ban gel Sư dụng với Ethidium bail gel bromide, agarose đề diện phân di tưdiện sau ethidium diện di bromide kill chụp sc chèn ảnh vào sáng giừa tư ngoại base sè nitơ cho cua hĩnh acid anh nucleic, bảng sáng chất lượng Dựa vào cùa ket DNA qua tách chiết báng Phương diện di pháp thu điện dược di mà DNA kiếm tông tra số cỏn đảnh chi giá kiếm tra cỏ mặt cua DNA sau tách chiềt mã cách tương đổi nồng độ DNA mầu phản tích bang cách so sảnh mức độ díìm nhạt cua vạch DNA cần phản tich vói thang marker chuàn Sau thu DMA hòa tan phán tu DNA sau tách chiết cần dam bao số lượng chất lượng đê đáp ứng phân tích sau dó Mục dích cuối cùa phương pháp tách chiết thu đirợc DNA trạng thái nguyên vẹn tồi da, không bị phản hủy tác nhân học hỏa học bới số enzyme nội bào ngoại bào khơng lần t 50 ng/pl) vã độ tinh cao giúp cho phan ứng Real-timePCR dạt hiệu suẩt cao sè giúp cho hình anh giai trinh tự rỏ nét khơng bị nhiêu từ dưa nhận đinh chinh xác hưn Theo kct qua dược tông hợp bảng 3.1 cho thầy: - Cãc màu tách chiết nghiên cứu đểu có tý sổ Vặộ/so năm khống 1.8 cỏ tíiê kết luận lâng mầu DNA tách chiết đạt yêu cầu độ tinh dam bao tốt cho phan ứng Real-time PCR - Nồng độ màu DNA tách chiết > 50 ng/ụl Tử kết qua dạt dược diều kiện trẽn cho thầy màu DNA tảch chiết hoàn toàn dáp ứng tốt cho phan úng TM/ V*: 41 Real-time PCR vã cho kết qua khuếch dại dạt chất lượng mà nghiên cứu mong muốn 4.3 Kốt Real-time PCR Trong nghiên cửu y sinh học tlũ tầm quan trọng cua PCR lả võ lớn vói phát triền thi kỹ thuật PCR gần có thê phân lụp khuếch đại gcn thê người Trong kỳ thuật PCR sau hồn tất khuếch đại đoạn DNA đích, người làm thí nghiệm phãi tiếp tục lâm số bước thi nghiệm đê đọc kết qua xác định có sản phàm khuếch đại mong muốn phân ứng hay không, vâ giai đoạn gọi lả giai đoạn thi nghiệm sau PCR Hiện việc tiểt kiệm thời gian, độ xác vã độ đặc hiệu lả quan trọng chuẩn đoản sỗ bệnh lý gen dó kỳ thuật PCR dược cải tiến xuẩt kỳ thuật Real-time PCR Real-time PCR kỳ thuật PCR mà kết qua khuếch dại DNA đích hiển thị sau mồi chu kỳ nhiệt cua phán ứng chinh liên dược gọi real-time; đặc diêm nén với Real-time PCR người làm thí nghiệm khơng cần thiết pluũ làm tiếp thí nghiệm dê đọc phán tích kết de xác định cõ san phàm khuếch dại đích hay khơng ví ket qua cuối củng cua phán ứng khuếch dại dược hiên thị sau hoàn tất phan ứng khuếch đại Vi cõ nỏi Real-time PCR lả kỳ thuật nhàn ban DNA đích nghiệm thành hàtẹ tý ban dựa vào chu kỳ nhiệt kết qua khuếch đại ống phan ứng hiên thị củng lúc với phan ứng khuếch dại xay dê người làm thi nghiệm có thè thấy dược Như quy trình thực kỹ thuật Real-time PCR theo nguyên tác thông thường cua phan ứng tông hợp chuồi Tuy nhiên, đặc diêm khác biệt đoạn DNA dược nhãn sè dược phá thời diêm diễn phan ửng (real-time) Real-time PCR gốm hai quà trinh diễn dồng thời: nhản ban DNA bang phàn ứng PCR độ phát huỳnh quang ty lộ thuận nghịch với số đoạn DNA tụo thành Chìa khố kỳ thuật chinh kỳ thuật Real-time PCR chinh lã chất phát huỳnh quang Nó sè pliảt huỳnh quang không phát quang TM/ V*: 42 có khơng cỏ diện cua sán phẩm khuếch đại từ DNA đích Cõ nhiều chất phãt huỳnh quang dược sư dụng phàn úng Realtime PCR nghiên cứu nảy chúng tòi sứ dụng đẩu dò phát huỳnh quang (Probe) Đây đoạn oligonucleotide sợi dơn có trinh lự thê bắt cặp bồ sung với trinh tự độc hiệu DNA đích Dầu dị oligonucleotide gắn cãc phân tư phát huỳnh quang Sự phát quang thông thường xuầt cỏ mật két cạp cua đầu dỏ vởi phàn từ DNA đích Ví cường độ phát quang sè thay đói sau mỏi chu kỳ cùa phan ứng Real-time PCR Kỳ thuật Real-time PCR kỳ thuật xác định SNPs có quy trình lảm \iộc dơn gian cỏ cho kết qua chỉnh xác vã nhanh chõng Thao tác chi cằn trộn Taqman Genotyping Master Mix Probe Primers mầu DNA Với kỳ thuật khơng cần tối ưu hóa nồng độ đầu dị mồi nống độ muồi hoậc nhiệt dộ bời vi thí nghiệm dược thực theo hướng dần quỵ trình cua hảng san xuất Kỳ thuật lãm giám kha nàng ngoại nhiễm, nhiêm chéo ntảu Trong nghiên cửu sứ dụng 2X TaqMan Genotyping Master Mix Probe - Primer HLA-DQ rs2S5671S (40x) mầu DNA dtrực pha loàng nồng dụ khoang 50 ng/pl Đe đạt kết chinh xác nhất, đà tuân thú chụt chè nguyên tắc kỹ thuật thao tác cua Real-time PCR Khi thực kỳ thuật cần tránh ánh sáng trục tiếp vi probe có chữa chất phát huỳnh quang, vả không dánh dấu mẫu trực tiểp phân ứng dê tránh làm ngăn chận tin hiệu từ óng phân ứng tới mây Khác với phân ứng PCR chu trinh nhiệt cua phương pháp Real-time PCR sư dụng mầu dô TaqMan chi cỏ hai giai đoạn lã: giai doạn biến tinh vã giai đoạn bắt cập gán mồi kéo dài Xay dầu tiên giai đoạn biền tinh, giai đoạn chuỗi xoắn kép DNA khn bi biến tính tách khoi tíìành hai chuồi dơn Đe làm biến tính DNA lúc nậy nhiệt độ cằn dạt dược phai từ 94 95 cc nghiên cửu lựa chọn 95°c vã kẽo dãi 15 giây Nhiệt dộ biến tinh DNA (94 TM/ V*: 43 95°C) khơng cõ biến dơi thỉ dovói Sừ khơng dụng mà phụ thưởng thuộc ờtheo kích củng thước, trinh độ tự giìra đoạn gcn phan vã đoạn ứng Real-time chung PCR loại khác DNA khác vỉ dây lãnhiệt Klù nhiệt DNA dộ tách gảy thành biến tinh mạch đơn giai đoạn tiếp bẩt cặp gản mồi vả kéo dãi sè xây củng thời diêm, lúc dó nhiệt độ dược hạ xuống nhiệt độ gắn mồi đặc hiệu cho phép đoạn mồi gấn xào sợi DNA khuôn xả kẽo dải chuồi phan úng Mỗi phan ửng Real-time PCR thường có nhiệt dộ nơng cháy khoang 55 60°C vả thấp mầu dò TaqMan khoảng 10°C dê dám bào mầu dị ln bắt cập trước Trinh tự đích lựa chọn khơng nên dài q 150bp đê phan ứng dicn tối ưu nhắt Trong giai đoạn dưa nhiệt độ 60°C phút Kết thúc phán ứng Real-time PCR sè thu dirực kết dường biêu diễn khuếch đại ghi nhận cường độ huỳnh quang phát từ ống phan ứng nhặn dược ánh sánh kích thích vào mói chu kỹ nhiệt (hình 1.4) Sau đà trộn thành phẩn phan ứng điểu kiện đạt chuẩn X'á thiết lập chu kỳ nhiệt cua phan ứng Real-time PCR tiền hành phan ứng ưẽn 30 mầu DNA cua 30 bệnh nhản nhóm nghiên cứu Kct thúc phàn ứng thu kểt kiêu gen SNP rs2856718 cùa gen HL.A-DQ cua 30 bệnh nhân ung thư biêu mị tể bào gan (bang 3.3) vói ba loại kiểu gen AA AG GG (minh họa hình 3.3 hinh 3.4 hĩnh 3.5) Trong 30 bệnh nhàn ung thư biêu mò tế bào gan tham gia nghiên cúu ty lệ bệnh nhản cỏ kiêu gen AG chiếm nhiều với 43.3% ty lệ kiêu gen AA thắp hon 30% X'ả thầp nhắt kiêu gen GG cht chiếm 26.7% Ti lệ tùng loại alen lư\n lả 51.65% A vã 48.35% G 4.4 So sánh VÓI nghiên cứu trẽn giói Ung thư gan nguycn phát lã sâu loại ung thư phô biến nhắt nguyên nhàn gãy tư xong lim thứ ba ưẻn thê giới - Khoáng 80% ung thư gan nguyên phát ung thư biếu mỏ tề bào gan (HCC) Người ta ước tính rang 75% 85% bệnh nhàn HCC nhicm virus xiêm gan B (HBV) tính, dặc biệt lã dán sổ châu Á vã đặc biệt Trung Quốc Ngoài yếu tổ di truyền yếu tồ quan trọng định nguy cùa ung thư5- Trên giới, đà có nhiều nghiên cửu mối liên quan giừa đa hình thãi TM/ V*: 44 đơn SNPs vởi ung thư biêu mó tế bão gan Nghiên cứu cua Hu cộng cho thây rang lính da hình cua HLA-DQ rs2856718 làm giam dáng kẽ nguy cư HCC liên quan den HBV người vũng Đỏng Nam Trung Quốc Nghiên cứu cùa Gao cộng cho da hình IILA-DQ (rs285671S vã rs9275572) yếu tổ nguy cư cua I ICC liên quan den HBV14 Nghiên cứu cua người khác cho thấy HLA-DQ rs2856718G rs9275572A có the yếu tổ bao vệ dối với nhiem HBV thai tự nhiên cua HBV tiến triền cùa HCC liên quan đen HBV 13 Nghiên cứu cua Jingzhu cộng trẽn bệnh nhãn HCC Trung Quốc chi rang kicu gen GG so với AA vả alen G so vói alen A cua HLA-DQ rs2856718 có liên quan đáng kê với nguy lice liên quan đển HBV Tuy nhiên, nghiên cứu trẽn bệnh nhàn HCC A Rập Jingzhu chi mối liên hộ giừa HLA-DQ rs2856718 tính nhay cam với IICC liên quan đen HBV 33 Nghiên cửu cùa Al-Qahtani cộng trẽn 1672 còng dán A Rập Xê ửt nhiễm HBV dã thống kẽ ty lộ loại kiêu gen cua SNP rs2856718 gen HLA- DQ 40% AA 30% AG vã 30% GG :1 Nghiên cúu cua Gao cộng 308 bệnh nhân người Hãn Trung Quốc mắc HCC cho kết qua loại kicu gen SNP rs2856718 47.4% AA 40.9% AG 11.9%GG » Ty lộ loại kiểu gen cua SNP rs2856718 nghiên cứu náy nghiên cửu cua chúng tịi khơng giống cỏ the khắng định SNP rs2856718 yếu tố nguy cư dối vứi I ICC liên quan đến HBV Từ nghiên cứu trẽn, cõ thê thấy mối liên quan giừa tỷ kiêu phản gen bồ cua SNP chủng rs2856718 phụ cua thuộc gen HLA-DQ vào với nhiều HCC yếu tổ: tính sống, dặc trưng nhạy cam cho cua chung tộc cá thể điều với kiện địa yểu lý tồ mòi nguy trường khác nghiệp chi tiến Tuy hành nhiên, cờ màu khuôn lả 30 khố khóa tinh luận chất tốt mầu tý không lộ khu kiêu trú alen nên chưa kiểu thè gen đánh SNP giá ĨS2856718 cưa cách gen chinh HLA-DQ xác rs2856718 Nam Do ưên nghiên bệnh nhân cửu ung cần thư dược biêu tiến mò hành tế bào gan cỡ mầu Việt khu trú sàng cua lớn bệnh nhân, với dầy đồng đù thời thõng tiến hãnh tin lâm nghiên sàng cứu trẽn cận lâm cà nhóm hình người thái rs2856718 khoe mạnh cùa dê đánh HLA-DQ giá dược với mối ung liên thư hệ biêu mô da té bào gan TM/ V*: KẾT LUẬN Qua nghiên cứu “ủng dụng kỳ thuật Real-time PCR đe pliát đa hình dơn r$2S56718 cua gen HLA-DQ bệnh nhân ung thư biéu mò tể bào gan" cho kết luận sau: Áp dụng thảnh cõng kỳ thuật Real-time PCR đê xác dinh kiểu gen đa hình thái dơn (SNP) rs2856718 cua gen HLA-DQ dối tưựng bệnh nhản ung thư biêu mỏ tề bảo gan vởi tỳ lệ alen A 51.65% G lã 48.35%, ty lộ kicu gen AA 30% AG lã 43.3% GG 26.7% TAI LIỆU THAM KHÁO Wang JJ Lei KF Han F Tumor microenvironment: recent advances in various cancer treatments Eur Rev Med Pharmacol Sei Jun 2018:22(12):3855-3864.doi:10.26355/eurrev_201806_15270 Sung H Ferlay J Siegel RL et al Global Cancer Statistics 2020: GLOBOCAN Estimates of Incidence and Mortality Worldwide for 36 Cancel’s in 185 Countries CA Cancer J Clin May 2021:71(3):209-249 doi:10.3322/caac.21660 McGlynn KA London WT The global epidemiology of hepatocellular carcinoma: present and future Clin Liver Dis May 2011;15(2):223-43 vii-x doi: 10.1016.j cld.2011.03.006 Schweitzer A Hom J Mikolajczyk RT Krause G Ott J J Estimations of worldwide prevalence of chronic hepatitis B virus infection: a systematic review of data published between 1965 and 2013 Lancet Oct 17 2015;3S6(10003):1546-55 doi:10.1016/S0140-6736(15)61412-X Cheng p Cheng Y Su MX et al Bicluster and pathway enrichment analysis of HCV-induced cirrhosis and hepatocellular cardnoma Asian Pac J Cancer Pre\\ 2012:13(8):3741-5 doi: 10.7314/apjcp.2012.13.8.3741 Younossi ZM Blissett D Blissett R et al The economic and clinical burden of nonalcoholic fatly liver disease in the United States and Europe Hepatology Nov 2016:64(5): 1577-1586 doi: 10.1002 hep.28785 Zheng YB Huang JW Zhan MX et al Genetic variants in the KDR gene is associated with the prognosis of transarterial chemoembolization treated hepatocellular carcinoma Tumour Biol Nov 2014:35(11):11473-81 doi:10.1007/s 13277-014-2478-8 s Ye K Chang s Li J Li X Zhou Y Wang z A functional and proteinprotein interaction analysis of neuroepithelial cell transforming gene in hepatocellular carcinoma Tumour Biol Nov 2014;35(Il):11219-27 doi:10.1007/s 13277-014-2454-3 Zhang Y Zhao F Lan L Qin z Jun L Correlation of HLA-DQB1 gene polymorphism of Xinjiang Uygur with outcome of HBV infection, ỉnt J Clin Exp Med 2015;8(4):6067-72 10.Singh R Kaul R Kaul A, Khan K A comparative review of HLA associations with hepatitis B and c viral infections across global populations World J Gastroenterol Mar 28 2007:13(12): 1770-8 doi: 10.3748/wjg.vl 3.i 12.1770 11 Al-Qahtani A A Al-Anazi MR Abdo A A et al Association between HLA variations and chronic hepatitis B virus infection in Saudi Arabian patients.PLoSOne 2014:9(1 ):e8044 doi:l0.1371/joumal.pone.0080445 12.Hu L Zhai X Liu J et al Genetic variants in human leukocyte antigen/DPDQ influence both hepatitis B virus clearance and hepatocellular carcinoma development Hepatology May 2012;55(5): 1426-31 doi:10.1002/hep.24799 13.Liu w Zhang X Gao X Yang L Li B Liu D [Association between HLADQ gene polymorphisms and different outcomes of hepatitis B virus infection], zhonghua Liu Xing Bing Xue Za Zlii Mar 2016:37(3):384-8 doi: 10.3760/c ma j iss n.0254-64 50.2016.03.019 14.Gao X Liu w Zhang X et al Genetic polymorphism of HLA-DQ confers susceptibility to hepatitis B \irus-related hepatocellular carcinoma: a casecontrol study in Han population in China Tumour Biol Sep 2016;37(9): 12103-12111 doi: 10.1007/sl3277-016-5077-z 15.Những điều cầu biết ung thư gan https.7/benh\ienk.vn/nhung-dieu- canbiet-ve-ung-thu-gan-nd83800.html 16.Nordenstedt H White DL El-Serag HB The changing pattern of epidemiology in ltepatocellular carcinoma Dig Liver Dis Jul 2010;42 Suppl 3:S206-14 doi: 10.1016'S 1590-8658(10)60507-5 17.Schlabe s Rocksiroh JK Advances in the treatment of HIV/HCV coinfection in adults Expert Opin Pharmacother Jan 2018; 19(1 ):49-64 doi:10.1080/14656566.2017.1419185 18.Ngô Quý Châu Bệnh học nội khoa tập NXB Y Học Dại học Y Hà Nội 2012 19.Bộ Y tể I lướng dần chân đoán diều trị ung thư bicu mò tế bão gan nguyên phát 2020 20.Phức hựp phù hc.Jp tơ chức Wikipedia tiếng Việt 21.Shiina T Hosomichi K Inoko H Kulski JK The HLA genomic loci map: expression, interaction, diversity and disease J Hum Genet Jan 2009:54(1): 15-39 doi:10.1038/jhg.2008.5 22.Phức help hòa họp mò chu yếu (MHC) thụ thể tế bảo T - vai ưò đãp ứng miễn dịch https://www.microbiologybook.org/Vietnamese%20Immuno/vietnameseimmchapterio.htm 23.Andrew J GT Disease usceptibilitỵ transplantation and the MHC Immunology Today 1995;5( 16):209-211 24.Mbarek H Ochi H Urabe Y et al A genome-wide association study of chronic hepatitis B identified novel risk locus in a Japanese population Hum Mol Genet Oct 201l:20(19):3884-92 doi:10.1093/hmg/ddr301 25.Study Finds Genetic Basis of Common Diseases May Span Tens of Thousands of SNPs GEN - Genetic Engineering and Biotechnology News https :/Avww.genengnews.comAopics/omics/study-fmds-genetic-basis-of- common-diseases-may-span-tens-of-thousands-of-snps/ 26.Nachman MW Single nucleotide polymorphisms and recombination rate in humans Trends Genet Sep 2001:17(9):481-5 doi: 10.1016/sOl 689525(01 )02409-x 27.Varela MA Amos w Heterogeneous distribution of SNPs in the human genome: microsatellites as predictors of nucleotide diversity and divergence Genomics Mar 2010;95(3):l 51-9 doi: 10.1016/j ygeno.2009.12.003 28.Kay Daries AW-B Timothy M Frayling and Eleftheria Zeggini Human Molecular Genetics The Oxford University Press 1992 29.Sawai H Nishida N Mbarek H et al No association for Chinese HBVrelated hepatocellular carcinoma susceptibility SNP in other East Asian populations BMC Med Genet Jun 19 2012:13:47 doi: 10.1186/1471-235013-47 30.Kỳ thuật Real-time PCR sứ dụng mẫu dô Taqman https://genesmart.vn/kythuat-iealtime-pcr-su-dung-mau-do-taqman 31.Bio-Rad Laboratories I Real-Time PCR Applications Guide 2006 32.Parkin DM Bray F Ferlay J Pisani p Global cancer statistics 2002 CA Cancer J Clin Mar-Apr 2005:55(2):74-108 doi:10.3322/canjclin.55.2.74 Lv J Xu T Qian Polymorphisms andz HBV-Related Wang2017;2017:7150386 H Association Hepatocellular between Carcinoma HLA-DQ Gene doi:10.1155/2017/7150386 Gasưoenterol Res Pract PHỤ LỤC STT DANH SÁCH BỆNH NHẢN Mà bệnh nhân Hụ tên Năm sinh KG-01 Đinh Ván T KG 02 Nguyen Thành c 1961 Nam KG 03 Nguyen Vãn T 1961 Nam KG 04 Dương Đình 11 KG-05 Hồng Vân T KG 06 Phan Minh L 1975 Nam KG-07 Dỏ Vàn c 1982 Nam KG-09 Nguyen Quang T 1961 Nam KG-09 Bùi Văn T 1957 Nam 10 KG- 10 Lẻ Thị D KG-11 Hà Công L 1986 Nam 12 KG - 12 Doãn Sỳ T 1954 Nam 13 KG 13 Nguyền Đức H 1946 Nam 14 KG- 14 Nguyền Thị N 1954 Nữ 15 KG 15 Hoảng Duy c 1972 Nam 16 KG- 16 Nguyen Vân T 1969 Nam 17 KG 17 Nguyen Thị T 1965 Nử 18 KG - 18 Hoàng Thị D 19 KG - 19 Phạm Vãn T 1956 Nam KG-20 TrẩnKhẳcC 1966 Nam 21 KG-21 Lê Vân T 22 KG - 22 Tạ Thị Hoa 11 20 TKf V*: TM/ 1969 Giới tinh 1958 1954 1956 1940 1955 -u 1956 Nam Nam Nam Nừ Nừ Nam Nừ 23 KG 23 Nguyen Vàn s 1976 Nam 24 KG 24 Trần Thị N 1962 NÙ 25 KG 25 Nguyen Thị Kim H 1972 NÙ 26 KG - 26 Đổ Vản Việt N 1967 Nam 27 KG-27 Hoàng Văn K 1960 Nam 28 KG -28 Phạm Van N 1954 Nam 29 KG-29 Nguyen Vãn T 1966 Nam 30 KG-30 Trần Thị D 1960 NÙ TKf V*: -u ... bộnh nhân ung thư biêu mơ te bào gan CHƯƠNG TƠNG QUAN TÀI LIỆU 1.ỉ Tống quan ung thư biếu ntò tế bào gan l.lã Sư lược ung thư biếu mô tế bào gan Ưng thư gan gồm ung thư gan nguyên phát vả thử phát. .. "úng dụng cùa kỹ gen thuật HH-DỌ Real- time bệnh PCR nhân dế ung phát thư biển da Iitó tỳ lệ tế kicu bào gen gan" cua dược da hình thực thái đơn rs2856718 mục tiêu: Xác cua định gen HLA- DQ dược... cua gen HLA- DQ bệnh nhân ung thư biéu mò tể bào gan" cho kết luận sau: Áp dụng thảnh cõng kỳ thuật Real- time PCR đê xác dinh kiểu gen đa hình thái dơn (SNP) rs2856718 cua gen HLA- DQ dối tưựng bệnh