áp dụng kỹ thuật real time pcr để phát hiện varicella zoster virus

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH Huỳnh Thị Mỹ Hiệp ÁP DỤNG KỸ THUẬT REAL-TIME PCR ĐỂ PHÁT HIỆN VARICELLA ZOSTER VIRUS LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh – 2012 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH Huỳnh Thị Mỹ Hiệp ÁP DỤNG KỸ THUẬT REAL-TIME PCR ĐỂ PHÁT HIỆN VARICELLA ZOSTER VIRUS Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60 42 40 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS CAO MINH NGA Thành phố Hồ Chí Minh – 2012 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận văn kết nghiên cứu thực hiện, không chép Nội dung luận văn có tham khảo sử dụng tài liệu, thông tin đăng tải tác phẩm, tạp chí trang web theo danh mục tài liệu luận văn LỜI CẢM ƠN Những lời cảm ơn chân thành sâu sắc xin gửi đến: Lãnh đạo trường Đại học Sư Phạm TP HCM, phòng Khoa học Công nghệ sau đại học chuyên ngành Vi sinh vật học tổ chức Đào tạo, quản lý tạo điều kiện thuận lợi cho hoàn tất khóa học luận văn Các Thầy, Cô giáo trường nhiệt tình giảng dạy cung cấp kiến thức quý báu suốt khóa học PGS.TS Cao Minh Nga truyền đạt kiến thức, tận tình hướng dẫn tạo điều kiện để em hoàn thành tốt khóa luận Các anh, chị bạn học viên lớp Cao học VSVH khóa 20; quan tâm, chia sẻ động viên suốt khóa học suốt thời gian thực khóa luận Các anh, chị em Công ty Việt Á nhiệt tình có trao đổi quý báu trình thực đề tài; phòng Dịch vụ, Công ty Việt Á cung cấp tài liệu tham khảo, số mẫu VZV để khảo sát thực nghiệm công ty Bác sĩ Siêu, bác sĩ Phong (khoa nhiễm bệnh viện Nhiệt đới) nhiệt tình giúp đỡ trình thu thập mẫu VZV Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn chân thành tới người thân gia đình quan tâm, động viên suốt trình học tập thực luận văn Thành phố Hồ Chí Minh, 2012 Tác giả Huỳnh Thị Mỹ Hiệp MỤC LỤC PHẦN I: MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Nhiệm vụ đề tài Nội dung nghiên cứu PHẦN II: NỘI DUNG ĐỀ TÀI CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU I Đại cương virus 1.1 Lịch sử phát bệnh 1.2 Dịch tễ học 1.3 Cấu trúc virus 1.4 Chu trình nhân lên virus 1.5 Đặc điểm sinh bệnh học biện pháp phòng ngừa – điều trị bệnh 1.5.1 Đặc điểm sinh bệnh học 1.5.1.1 Bệnh thủy đậu 1.5.1.2 Bệnh zona 13 1.5.2 Biện pháp phòng ngừa – điều trị bệnh 17 1.5.2.1 Biện pháp phòng ngừa 17 1.5.2.2 Điều trị bệnh 18 II Các phương pháp chẩn đoán bệnh 19 2.1 Chẩn đoán trực tiếp 19 2.2 Chẩn đoán huyết học 20 III Phương pháp PCR 20 3.1 Giới thiệu 20 3.2 Nguyên tắc hoạt động 21 3.3 Phương pháp Real-time PCR 22 3.3.1 Nguyên tắc hoạt động 23 3.3.2 Thiết bị 24 3.3.3 Các kiểu phản ứng Real-time PCR 24 CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31 I Vật liệu – Hóa chất 31 1.1 Vật liệu 31 1.2 Hóa chất (hãng Biobasic – Canada) 31 1.3 Dụng cụ -Thiết bị 32 II Phương pháp nghiên cứu 32 2.1 Phương pháp thiết kế mồi –mẫu dò 33 2.1.1.Nguyên tắc 33 2.1.2 Các phần mềm máy tính sử dụng 34 2.1.3 Cách tiến hành 34 2.2 Phương pháp xử lý mẫu bệnh phẩm 35 2.2.1 Lấy mẫu bảo quản 35 2.2.2 Phương pháp ly trích DNA 35 2.2.2.1 Nguyên tắc 35 2.2.2.2 Cách tiến hành 36 2.3 Thực phản ứng Real-time PCR 36 2.4 Phương pháp khảo sát độ nhạy quy trình 37 2.5 Phương pháp khảo sát độ đặc hiệu mồi – mẫu dò 38 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 39 3.1 Kết thiết kế mồi mẫu dò lý thuyết 39 3.1.1 Kết thiết kế hệ mồi mẫu dò 39 3.1.2 Kết khảo sát đặc tính hệ mồi – mẫu dò 42 3.1.3 Kết khảo sát độ đặc hiệu hệ mồi – mẫu dò 43 3.2 Kết khảo sát hệ mồi –mẫu dò thực nghiệm 43 3.2.1 Khảo sát khả khuếch đại hệ mồi –mẫu dò 43 3.2.2 Khảo sát nhiệt độ lai hệ mồi – mẫu dò 46 3.2.3 Khảo sát nồng độ mẫu dò 48 3.2.4 Khảo sát nồng độ Mg2+ 49 3.2.5 Khảo sát sát khả nhân chọn lọc hệ mồi mẫu dò 51 3.2.6 Khảo sát độ nhạy phản ứng 53 3.2.7 Khảo sát tính lặp lại phản ứng Real-time PCR 57 3.2.8 Ứng dụng quy trình số bệnh phẩm 61 PHẦN III: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 63 I Kết luận 63 II Kiến nghị 63 TÀI LIỆU THAM KHẢO 64 PHỤ LỤC 67 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VZV Varicella zoster virus BLAST Basic Local Alignment Search Tool ORF Open reading frame FRET Flourescent Resonance Energy Transfer cccDNA covalently closed circula DNA DNA Deoxyribonucleic acid dNTPs Deoxyribonucleotide triphotphates dATP Deoxyadenosine triphosphate dCTP Deoxycytidine triphosphate dGTP Deoxyguanosine triphosphate dTTP Deoxythymidine triphosphate EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid Ta Temperature annealing TP HCM Thành phố Hồ Chí Minh Ct Threshold cycle IDT Intergrated DNA Technology HIV Human immunodeficiency virus RNA Ribonucleotide acid NCBI National Center for Biotechnology Information PCR Polymerase chain reaction TB Trung bình Taq Thermus aquaticus TE Tris acid – EDTA Tm Temperature melting CMV Cytomegaovirus HSV Herpes simplex virus EBV Epsteinbarrvirus HBV Hepatitis B virus HPV Human papiloma virus MTB Mycobacterium tuberculosis BTLPU Biến thiên liên phản ứng BTNPU Biến thiên nội phản ứng STT Số thứ tự TD-NL Thủy đậu người lớn TD-TE Thủy đậu trẻ em nu nucleotide bp base pairs VSVH Vi sinh vật học DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH Trang Hình 1.1: Cấu trúc VZV Hình 1.2: Chu trình nhân lên virus Hình 1.3: VZV gây hai bệnh Hình 1.4: Nốt điển hình Hình 1.5: Viêm phổi thủy đậu 10 Hình 1.6: Viêm mô tế bào 11 Hình 1.7: Thủy đậu xuất huyết 11 Hình 1.8: Thủy đậu sơ sinh 13 Hình 1.9: Nguyên tắc hoạt động PCR 22 Hình 1.10: Nguyên tắc hoạt động Molecular beacon 25 Hình 1.11: Nguyên tắc hoạt động SYBR Green 25 Hình 1.12: Cơ chế phát tín hiệu huỳnh quang probe đôi 26 Hình 1.13: Nguyên tắc hoạt động Taqman probe 28 Hình 2.1: Quy trình khảo sát đặc tính mồi mẫu dò 32 Hình 2.2: Chương trình luân nhiệt phản ứng Real-time PCR 37 Hình 3.1: Kết gióng trình tự ORF28 BioEdit 39 Hình 3.2: Kết việc tìm độ tương đồng gene ORF28- VZV mồi xuôi chương trình clustal 40 Hình 3.3: Kết việc tìm độ tương đồng gene ORF28 mồi ngược chương trình clustal 40 Hình 3.4: Kết việc tìm độ tương đồng gene ORF28 mẫu dò chương trình clustal 41 Hình 3.5: Kết việc đánh giá mồi, mẫu dò annhyb 41 Hình 3.6: Kết khảo sát khả khuếch đại hệ mồi- mẫu dò (lần 2) 44 Hình 3.7: Kết khảo sát nhiệt độ lai (lần 1) 47 Hình 3.8: Kết khảo sát nồng độ mẫu dò (lần 2) 49 - 64 - TÀI LIỆU THAM KHẢO  Tài liệu tiếng Việt Cao Minh Nga (2008), Ứng dụng sinh học phân tử chẩn đoán bệnh nhiễm người, tài liệu tập huấn , Trường ĐHYD TP HCM Lê Đức Trình (2001) , Sinh học phân tử tế bào, NXB Khoa học Kỹ thuật Đang Le Nhu Nguyet , Đoan Thị Ngoc Diep (2010), Survey on characteristics of varicella in children at children’s hospital 1, Y hoc TP Ho Chi Minh, tr 367-371 Đặng Văn Giáp (1997), Phân tích liệu khoa học chương trình MS-EXCEL, NXB - Giáo dục Hồ Huỳnh Thùy Dương (1997), Sinh học phân tử, NXB Giáo Dục Kiều Hữu Ảnh (2008), Giáo trình vi sinh vật học, NXB Khoa Học – Kỹ Thuật Lê Huy Chính (2007), Vi sinh vật y học, NXB Y học Lê Huy Chính, Nguyễn Trung Vũ (2005), Cẩm nang vi sinh vật y học, NXB Y học Lê Duy Thành (chủ biên), Đỗ Lê Thăng, Đinh Đoàn Long, Trần Thị Hồng (2009), Cơ sở sinh học phân tử, NXB Giáo Dục Lê Đức Trình (2001) , Sinh học phân tử tế bào, NXB Khoa học Kỹ thuật 10 Lê Đình Roanh (2010), Bệnh học đại cương, NXB Giáo Dục Việt Nam 11 Le Thi Khanh Van (2008), Investigation the clinical laboratory features, diagnosis and treatment of post infectious encephal omyelitis (piem), Y hoc TP Ho Chi Minh, tr 8-13 12 Quyền Đình Thi, Nông Văn Hải (2008), Những kỹ thuật PCR ứng dụng phân tích DNA, tập 2, NXB Khoa Học Tự Nhiên Công Nghệ 13 Phạm Hùng Vân (2009), PCR real-time PCR Các vấn đề áp dụng thường gặp, NXB Y học - 65 -  Tài liệu tiếng Anh 14 Ann M Arvin, Varicelle zoster virus, Clinical microbiology Reviews, July 1996, pp 361- 381 15 Gloria N Mattiuzzi, Jorge E Cortes, Moshe Talpaz, James reuben, Mary Beth Rios, Jianjin Shan, Dimitritrios Kontoyiannis, Francis J Giles, Issam Raad, Srdan Verstovsek, Alessandra Ferrajoli and Hagop M Kantarjian (2003), Development of Varicella-Zoster Virus Infection in Patients with Clronic Myelogenous Leukemia Treated with Imatinib Mesylate, The University of Texas M.D Anderson Cancer Center, Houston, Texas 77030, pp 976 - 980 16 Manftred Weidmann, Ursula Meyer-Konig and Frank T Hufer (2003), Rapid Detection of Herpes Simplex Virus and Varicella-Zoster Virus Infection by Real-time PCR, Journal of Clinical Microbiology, pp 15651568 17 Mark J Espy, Rosaline Teo, Teri K Ross, Kathleen A Svien, Arlo D Wold, James R Uhl and Thomas F Smith (2000), Diagnosis of VaricellaZoster Virus Infections in the Clinical Laboratory by LightCycler PCR, Mayo Clinic and Foundation, Rochester, Minnesota 55905 18 Markus Rahaus, Nathalie Desloges, Manfred H Wolff (2006), Molecular Biology of Varicella – Zoster Virus, Monogr Virol, Basel, Karger, pp 1- 19 Jawetz, Melnick & Adelberg’s (2007), Medical Microbiology, Twenty fourth edition - Exclusive rights by the Mc Graw-Hill Companics, Inc., for manufacture and export 20 Johannes C.M Milikan, Robert W.A.M Kuijpers, G Seerp Baarsma, Albert D.M.E Osterhaus, Georges M.G.M.Verjans (2006), Characterization of the varicella zoster virus(VZV) – specific intra-ocular T-cell response in patient with VZV – induced uveitis, Experimental Eye Research 83, pp 69-75 - 66 - 21 Ella Mendelson, Yair Aboudy, Zahava Smetana, Michal Tepperberg, Zahava Grossman (2006), Laboratory assessment and diagnosis of congenital viral infections: Rubella, cytomegalovirus (CMV), varicellazoster virus (VZV), herpes simplex virus (HSV), parvovirus B19 and human immunodeficiency virus (HIV), Reproductive Toxicology 21, pp 350 - 382 22 Ravi Mahalingam, Mary Wellish, John Brucklier and Donald H Gilden (1995), Persistence of varicella-zoster virus DNA in elderly patients with postherprtic neuralgia, pp130-133  Internet 23 http://yhct.org/dd/viewtopic.php 24 http://www.dalieu.org/archive/index.php 25 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/bookshelf/br.fcgi?book=cell&part=A1387 26 http://www.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/ 27 http://jcm.asm.org/ 28 http://emedicine.medscape.com/article/231927-overview 29 http://tailieu.vn/xem-tai-lieu/benh-zona-herpes-zoster-.328564.html 30 http://suckhoe365.net/2010/04/benh-thuy-dau-nguyen-nhan-trieu-chungva-phuong-phap-dieu-tri/ 31 http:// www.pasteur-hcm.org.vn/dichvu/thuydau.htm 32 http:// http://vn.answers.yahoo.com/question/ 33 http:// phapluattp.vn/20110406123643307p1060c1104/ 34 http:// tin180.com/suckhoe/hoi-dap-suc-khoe/20110121/benh-thuy-dauanh-huong-tren-thai-ky-nhu-the-nao.html 35 http:// www.hopkinsmedicine.org/ 36 http:// virology-online.com/viruses/VZV.htm 37 http:// medinet.hochiminhcity.gov.vn/ttyh/bshkhkt/BenhZona.htm 38 http:// bsdongy.com/viewthread.php 39 http:// suckhoedinhduong.nld.com.vn// - 67 - PHỤ LỤC Phụ lục Các trình tự trình tự ORF28 VZV >gi|94482092| gb |DQ479957.1| >gi|94482314| gb |DQ479960.1| >gi|94481944| gb |DQ479955.1| >gi|94482018| gb |DQ479956.1| >gi|94482166| gb |DQ479958.1| >gi|94482240| gb |DQ479959.1| >gi|46981409| gb |AY548171.1| >gi|91980297| gb |DQ457052.1| >gi|94481870| gb |DQ479954.1| 10 >gi|46981482| gb |AY548170.1| 11 >gi|111184725| gb|DQ674250.1| 12 >gi|94481796| gb |DQ479953.1| 13 >gi|157965723| gb|EU154348.1| 14 >gi|66865971| gb| DQ008354.1| 15 >gi|66866043| gb| DQ008355.1| 16 >gi|90992797| gb| DQ452050.1| 17 >gi|83721806| gb| AJ871403.1| 18 >gi|9625875| gb |NC001348.1| - 68 - Phụ lục Kết BLAST trình tự mồi xuôi gene ORF28 NCBI Kết BLAST trình tự mẫu dò gene ORF28 NCBI - 69 - Kết BLAST trình tự mồi ngược gene ORF28 NCBI - 70 - Phụ lục Kết IDT đoạn mồi xuôi Kết IDT đoạn mẫu dò Kết IDT đoạn mồi ngược - 71 - Phụ lục Một số dạng cấu trúc hetero-dimer hệ mồi mẫu dò Các dạng cấu trúc self-dimer hệ mồi mẫu dò - 72 - Phụ lục Cấu trúc kẹp tóc hệ mồi – mẫu dò gene VZV theo thứ tự mồi xuôi – mẫu dò – mồi ngược - 73 - Phụ lục Kết giải trình tự VZV Kểm chứng kết giải trình tự với vùng thiết kế phần mềm ClustalX 1.81 - 74 - Kết BLAST tìm kiếm trình tự gene tương đồng với sản phẩm giải trình tự VZV - 75 - Phụ lục Bảng : Kết khảo sát mẫu quy trình Real-time PCR STT Tên bệnh nhân Mã số Ct (dR) bệnh Kết Real-time PCR Huỳnh Thiên C (2004) + 32,56 Nguyễn Thanh H (1989) + 31,59 Nguyễn Thanh G (1987) + 30,96 Trần Thị T (2006) + 32,68 Lê Phương T (1993) + 33,09 Nguyễn Thanh N (1986) + 27,54 Trần Bùi T (1988) 8559 No Ct Lê Thị Mỹ L 2495 No Ct Cao Thị N 2459 No Ct 10 Chu Quốc M 2463 No Ct 11 Hà Thị P 2522 No Ct 12 Trần Hoàng N 2462 13 Huỳnh Thị N 2517 No Ct No Ct 14 TRần Thị Anh T 2465 No Ct 15 Nguyễn Thị Kim A 2460 No Ct 16 17 Ngô Bé E Nguyễn Văn C (1967) 2475 No Ct 2463 No Ct 18 19 Thuận Đỗ Đại Hoàng T 2523 No Ct 2520 No Ct - 76 - 20 21 Nguyễn Văn Đ 2510 No Ct Lê Văn T No Ct 22 23 Trịnh Tuyết N Nguyễn Văn T 2509 No Ct 1798 No Ct 24 25 Trần T Đỗ Thị V 1814 No Ct 2537 No Ct 26 Phạm Thị T 1805 No Ct 27 Trần Cong Vong E 10414 No Ct 28 Trần Thị Cẩm N 1579 29 Võ Thị K 2500 No Ct 30 Phạm Văn S No Ct 1790 No Ct 31 Huỳnh Thị N 2517 No Ct 32 Nguyễn Thị B 2515 33 Thường (21 tuổi) 18.8 No Ct No Ct 34 Hải (1990) 19.27 No Ct 35 36 Dung (1982) Hương (1955) 14.21 No Ct 18.16 No Ct 37 Hằng (1986) 18.20 No Ct 38 Thắm (1986) 17.38 No Ct 39 Nga 18.12 No Ct 40 Nga (1983) 18.24 + 28,73 41 Thảo 18.19 42 Chín 18.10 + 30,45 No Ct - 77 - 43 44 Hà Thư 20.16 No Ct 15.21 No Ct 45 Nam 20.24 + 33,01 46 47 48 49 Thiển Dương Hường Dũng (1979) 18.11 No Ct 15.20 No Ct 18.5 No Ct 18.6 No Ct 50 Thuần 18.7 No Ct 51 Huyền 20.17 52 Thiềm 11.17 No Ct No Ct 53 Nam 724 No Ct 54 Trí 723 No Ct 55 Thùy 14.20 No Ct Phụ lục - 78 - [...]... Real- time So với PCR truyền thống, Real- time PCR có nhiều ưu điểm hơn như:  Độ đặc hiệu của Real- time PCR cao hơn rất nhiều so với PCR truyền thống do sử dụng các mẫu dò đặc hiệu để phát hiện sản phẩm khuếch đại  Real- time PCR cho phép định lượng sản phẩm khuếch đại nhờ sử dụng các chất phát quang đặc hiệu, lượng sản phẩm khuếch đại có thể định lượng ở từng chu kỳ phản ứng  Dữ liệu Real- time PCR. .. phẩm PCR sau cùng - 23 - Người ta đã có nhiều cải tiến nhằm làm cho phương pháp định lượng dựa trên kỹ thuật PCR trở nên chính xác và có độ tin cậy cao hơn Sự phát triển về kỹ thuật cũng góp phần đáng kể vào việc hình thành một phương pháp định lượng mới, đó là Real- time PCR Real- time PCR là kỹ thuật mà kết quả khuếch đại DNA đích hiển thị được ngay sau mỗi chu kỳ nhiệt của phản ứng nên được gọi là Real- time. .. trị ung thư,…thì virus hoạt động trở lại gây ra bệnh giời leo Việc xác định bệnh kịp thời sẽ giảm nguy cơ biến chứng và tử vong của bệnh Trong điều kiện ngày càng tiến bộ của Ngành Sinh học phân tử ở Việt Nam, chúng tôi mong muốn góp thêm một phương án vào việc chẩn đoán bệnh liên quan đến điều trị: sử dụng kỹ thuật Real- time PCR để phát hiện Varicella zoster virus Kỹ thuật Real- time PCR có nhiều ưu... các điều kiện phản ứng nhằm tối ưu hóa phản ứng Real- time PCR  Hoàn thiện quy trình phát hiện VZV trên bệnh nhân bệnh thủy đậu và zona bằng kỹ thuật Real- time PCR  Thử nghiệm quy trình trên mẫu bệnh phẩm -3- PHẦN II: NỘI DUNG ĐỀ TÀI CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU I Đại cương về virus 1.1 Lịch sử phát hiện bệnh Virus gây bệnh thủy đậu ở người đã phát hiện từ rất lâu (Aragao E.Paschen, 1911) nhưng với... ưu điểm trong việc xác định virus trên -2- Các kết quả xét nghiệm này được ứng dụng trong thực tiễn nhằm xác định chính xác bệnh để từ đó có phương án điều trị kịp thời 2 Nhiệm vụ đề tài Thiết kế thành công hệ mồi-mẫu dò phát hiện Varicella zoster virus bằng phương pháp Real- time PCR 3 Nội dung nghiên cứu  Thiết kế hệ mồi và mẫu dò đặc hiệu để định lượng Varicella zoster virus  Khảo sát độ đặc hiệu... động Nguyên tắc của PCR là khuếch đại đoạn DNA đích trong ống nghiệm phản ứng để sau đó phát hiện chúng Do vậy, PCR hiện nay đang trở thành một công cụ chẩn đoán nhạy nhất, cho đến nay chưa có thử nghiệm nào sánh kịp, để phát hiện các tác nhân vi sinh vật gây bệnh (ngay cả các vi sinh vật không thể phát hiện được bằng các xét nghiệm khác) trong các bệnh phẩm khác nhau Đây là một kỹ thuật tạo dòng in... Phương pháp PCR ngày càng được cải tiến đến ngày nay là Real- time PCR Phương pháp này hiệu quả, giúp chẩn đoán nhanh trên bệnh nhân Từ đó có những liệu pháp chữa trị sớm cho bệnh nhân, đặc biệt là ở những bệnh nhân suy giảm miễn dịch, ở người lớn tuổi hoặc ở phụ nữ mang thai, III Phương pháp PCR 3.1 Giới thiệu [1,4, 8, 9, 13] Năm 1985, Kary B.Mullis cùng các cộng sự đã phát minh ra phương pháp PCR (Polymerase... miễn dịch và đòi hỏi kỹ thuật cao - Phân lập virus: phương pháp này giúp phân biệt được VZV và HSV Nhưng VZV yếu ớt và tương đối khó hồi phục từ các mẫu bệnh phẩm của những tổn thương ở da Vì phương pháp này rất tốn thời gian (cho kết quả sau 2 tuần hoặc hơn) và độ nhạy thấp nên không có ý nghĩa lớn trong công tác chẩn đoán - Xác định phân tử DNA của virus bằng kỹ thuật PCR: là kỹ thuật phản ứng khuếch... Thông thường, một phản ứng PCR không được vượt quá 40 chu kỳ Chu kỳ 1 VZV 94oC Biến tính Chu kỳ 2 55oC-65oC Bắt cặp Chu kỳ 3 72oC Kéo dài Hình 1.9: Nguyên tắc hoạt động của PCR 3.3 Phương pháp Real- time PCR Khi sử dụng phương pháp PCR phải giải quyết hai vấn đề: đó là ảnh hưởng của pha bão hòa (plateau phase) trong phản ứng PCR và sự ức chế phản ứng do các chất kiềm hãm (PCR inhibitor) Càng về cuối,... số biến thiên nội phản ứng của Real- time PCR VZV 58 Bảng 3.13: Giá trị chu kỳ ngưỡng của các nồng độ của đường chuẩn 60 Bảng 3.14: Hệ số BTLPU của các nồng độ đường chuẩn 60 Bảng 3.15: Kết quả các hệ số BTNPU và BTLPU của Real- time PCR 61 Bảng 3.16: Kết quả so sánh độ lặp lại trong một số công trình .61 Bảng 3.17: Kết quả khảo sát mẫu bằng quy trình Real- time PCR 62 DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ ... sử dụng kỹ thuật Real-time PCR để phát Varicella zoster virus Kỹ thuật Real-time PCR có nhiều ưu điểm việc xác định virus -2- Các kết xét nghiệm ứng dụng thực tiễn nhằm xác định xác bệnh để. .. VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH Huỳnh Thị Mỹ Hiệp ÁP DỤNG KỸ THUẬT REAL-TIME PCR ĐỂ PHÁT HIỆN VARICELLA ZOSTER VIRUS Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60 42 40 LUẬN VĂN THẠC... kế thành công hệ mồi-mẫu dò phát Varicella zoster virus phương pháp Real-time PCR Nội dung nghiên cứu  Thiết kế hệ mồi mẫu dò đặc hiệu để định lượng Varicella zoster virus  Khảo sát độ đặc hiệu