II. Phương pháp nghiên cứu
3.2.7. Khảo sát tính lặp lại của phản ứng Real-time PCR
Độ tin cậy của thí nghiệm được thể hiện qua nhiều yếu tố trong đó tính lặp lại là một yếu tố quan trọng. Tính lặp lại của phản ứng Real-time PCR được biểu hiện qua hai hệ số biến thiên (variability coefficient) gồm biến thiên liên phản ứng và biến thiên nội phản ứng. Giá trị các hệ số biến thiên càng thấp thì tính lặp lại càng cao. Biến thiên liên phản ứng là độ biến thiên giữa các lần lặp lại phản ứng vào các thời điểm khác nhau. Biến thiên nội phản ứng là độ biến thiên giữa các phản ứng được thực hiện vào cùng một thời điểm. Chu kỳ ngưỡng là yếu tố để đánh giá độ biến thiên này.
Chúng tôi tiến hành khảo sát hệ số biến thiên nội phản ứng (HSBTNPU), và hệ số biến thiên liên phản ứng (HSBTLPU) trên mẫu chuẩn VZV với các nồng độ 102, 104, 106 copies /phản ứng và hai mẫu bệnh phẩm. Thí nghiệm được lặp lại ba lần.
Hệ số biến thiên nội phản ứng (intraassay variability coefficicent)
Bảng 3.11: Giá trị Ct của các nồng độ của đường chuẩn Nồng độ (copies /phản ứng) Phản ứng Giá trị trung bình Lần 1 Lần 2 Lần 3 102 34,50 33,85 34,10 34,15 104 27,52 28,18 27,57 27,76 106 20,76 21,09 20,37 20,74 Mẫu 1 24,13 23,63 25,20 24,32 Mẫu 2 28,73 29,49 29,78 29,33
Dựa vào kết quả bảng 3.11và theo thống kê mô tả trong MS-Excel [3], chúng tôi tiến hành tính toán hệ số biến thiên nội phản ứng của phản ứng Real-time PCR.
Bảng 3.12: Kết quả hệ số biến thiên nội phản ứng của Real-time PCR VZV
Nồng độ (copies /phản
ứng)
Ct trung bình Độ lệch chuẩn HSBTNPU
102 34,15 0,32787 0,96 104 27,76 0,36742 1,32 106 20,74 0,3604 1,74 Mẫu 1 24,32 0,802 3,29769 Mẫu 2 29,33 0,54226 1,84882
Hệ số biến thiên liên phản ứng (inter-assay variability coefficient)
Hình 3.14: Đồ thị giá trị Ct các lần lặp lại liên phản ứng
Ngày 1
Ngày 2
Bảng 3.13: Giá trị chu kỳ ngưỡng của các nồng độ của đường chuẩn
Nồng độ (copies /phản
ứng)
Chu kỳ ngưỡng Chu kỳ ngưỡng trung bình lần 1 lần 2 lần 3 102 33,99 33,88 33,12 33,66 104 27,66 28,19 27,37 27,74 106 20,96 20,60 20,27 20,61 Mẫu 1 25,64 27,59 25,55 26,26 Mẫu 2 24,94 26,30 23,77 25
Dựa vào kết quả bảng 3.13, chúng tôi tiến hành tính toán hệ số biến thiên liên phản ứng của phản ứng Real-time PCR theo thống kê mô tả trong MS-Excel [3].
Bảng 3.14: Hệ số BTLPU của các nồng độ đường chuẩn
Nồng độ (copies /phản
ứng)
Ct trung bình Độ lệch chuẩn HSBTLPU
102 33,66 0,47376 1,40748
104 27,74 0,4158 1,4989
106 20,61 0,3451 1,67443
Mẫu 1 26,26 1,15269 4,3895
Mẫu 2 25 1,2662 5,0648
Độ lặp lại của phản ứng Real-time PCR VZV thông qua các hệ số biến thiên nội phản ứng và liên phản ứng được tổng kết trong bảng 3.15:
Bảng 3.15: Kết quả các hệ số BTNPU và BTLPU của Real-time PCR
Hệ số Mẫu chuẩn (copies / phản ứng) Bệnh phẩm
102 104 106 Mẫu 1 Mẫu 2
BTNPU 0,96 1,32 1,74 3,29769 1,84882
BTLPU 1,40748 1,4989 1,67443 4,3895 5,0648
Bảng 3.16: Kết quả so sánh độ lặp lại trong một số công trình
Tác giả Độ lặp lại Độ nhạy
HSBTNPU HSBTLPU
Machida & cs (2000) 0,89 – 1,43 1,51 – 4,46 20 Piiparinen (2004) 5,12 – 13,1 4,5 – 19,6 10 Gault & cs (2001) 0,6 – 2,5 12 - 21 10 Thí nghiệm 0,96 – 3,29769 1,40748 - 5,0648 10
So sánh với các kết quả công bố của một số tác giả (bảng 3.16) cho thấy kết quả phản ứng Real-time PCR của chúng tôi phù hợp với các kết quả đã công bố, chứng tỏ quy trình của chúng tôi xây dựng hoạt động tốt.