II. Phương pháp nghiên cứu
3.2.6. Khảo sát độ nhạy của phản ứng
Bên cạnh độ đặc hiệu, độ nhạy cũng là một trong những tiêu chuẩn quan trọng
cần phải khảo sát khi thực hiện phản ứng Real-time PCR.
Chúng tôi tiến hành đặt các phản ứng Real-time PCR với những thành phần và chu trình nhiệt như đã trình bày ở trên. Nguồn DNA được lấy từ mẫu chứng dương VZV có nồng độ mẫu chuẩn từ 101 đến 108
copies/ml. Thí nghiệm được lặp lại ba lần.
Bảng 3.9: Kết quả khảo sát độ nhạy của hệ mồi – mẫu dò
Nồng độ mẫu chuẩn (copies/ml)
Chu kỳ ngưỡng (Ct) Chu kỳ ngưỡng trung bình Lần 1 Lần 2 Lần 3 Chứng âm (-) (-) (-) (-) 101 (-) (-) (-) (-) 102 38,21 37,67 37,99 37,96 103 34,62 34,77 34,27 34,55 104 32,14 32,27 32,47 32,29 105 27,80 28,37 27,89 28,02 106 24,32 24,07 24,60 24,33 107 20,73 20,83 20,20 20,59 108 17,30 17,86 17,58 17,58
Hình 3.11: Kết quả khảo sát độ nhạy của hệ mồi- mẫu dò (lần 1)
Nhận xét:
Kết quả cho thấy chứng âm không cho tín hiệu chứng tỏ quy trình hoạt động tốt. Các nồng độ từ 102
- 108 đều cho tín hiệu huỳnh quang và ở nồng độ 101
không thấy tín hiệu. Như vậy, quy trình của chúng tôi có thể phát hiện DNA
Varicella zoster virusở nồng độ 102
copies/ml.
Kết luận:Độ nhạy của quy trình là 102
copies/ml.
Khảo sát hệ số tuyến tính đường chuẩn (standard curve):
Đường chuẩn (standard curve) trong phản ứng Real-time PCR được xây dựng với các mẫu chuẩn có số lượng bản sao VZV đã biết. Với dung dịch DNA VZV có số lượng bản sao đã biết chúng tôi pha loãng bậc 10 thành nhiều dung dịch có số lượng bản sao giảm dần để xây dựng đường cong chuẩn cho phản ứng. Đường chuẩn được thực hiện cho mỗi lần chạy, từ đường chuẩn này có thể xác định được hàm lượng virus trong bệnh phẩm.
108 107 106 105 104 103 102 Chứng âm và 101
Hình 3.12: Hệ số tuyến tính của đường chuẩn của phản ứng Real-time PCR với các nồng độ DNA VZV từ 102 đến 106
copies/phản ứng
Qua ba lần khảo sát hệ số tuyến tính của đường chuẩn thể hiện ở bảng 3.10. Lần 3
Lần 2 Lần 1
Bảng 3.10: Kết quả khảo sát hệ số tuyến tính của đường chuẩn
Lần 1 Lần 2 Lần 3
PCR efficiency (hiệu quả khuếch đại) 96% 100,2% 100,9% Độ dốc (slope) -3,422 -3,318 -3,301 Hệ số tuyến tính của đường chuẩn (R2) 1,0 1,0 1,0
Có hai thông số được máy tính hiển thị trên một đường biểu diễn chuẩn. Thông số đầu tiên là hệ số tuyến tính (correlation coefficient) R2, đánh giá độ chính xác của thao tác pipetting lấy có đúng thể tích mong muốn không. Trị số R2 phải đạt trên 0,98 có nghĩa là đường biểu diễn chuẩn phải đạt tuyến tính cao. Kết quả thực nghiệm hệ số tuyến tính R2 đường chuẩn cả 3 lần đều bằng 1 (R2=1,0).
Thông số thứ hai đó là hiệu quả khuếch đại, được gọi là E% (PCR efficiency). Đối với bất kỳ đường biểu diễn chuẩn nào, đều có thể tính được hiệu quả khuếch đại theo công thức E% = (10-1/slope
-1) x100% với slope chính là độ dốc của đường biểu diễn chuẩn. Độ dốc chính là sự cách biệt nhau về chu kỳ ngưỡng giữa các ống chuẩn có số lượng giảm dần theo hệ số pha loãng 10. Theo kết quả bảng 3.10 độ dốc lần 1 là -3,422, lần 2 là -3,318 và lần 3 là -3,301. Độ dốc tối ưu của đường chuẩn là -3,32. Nhưng do ít khi được tối ưu nên có thể dao động trong khoảng -3,3 đến -3,6. Kết quả thực nghiệm cho thấy hiệu quả khuyếch đại từ 96% - 100,9% (qui định 90%-105%). Trên cơ sở đó cho thấy phản ứng Real- time PCR là hiệu quả và đạt mức độ khá tối ưu.
Trên biểu đồ chuẩn này, trục tung (Y) là Ct còn trục hoành (X) là số lượng DNA bản đích ban đầu có trong mẫu chuẩn. Do các mẫu chuẩn thường được pha cách nhau theo hệ số pha loãng 10. Các trị số 02, 03, 04, 05, 06, trên trục X được
biểu thị bằng cơ số logarit cơ số 10 (log10) tức là tương ứng với các số lượng bản đích là 102, 103, 104, 105, 106 , copies trong ống phản ứng. [2]