3.1. Giới thiệu [1,4, 8, 9, 13]
Năm 1985, Kary B.Mullis cùng các cộng sự đã phát minh ra phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction). Đây là phương pháp tạo dòng DNA rất đơn giản và hiệu quả. Thông qua PCR, hàng triệu đoạn DNA
đồng nhất có thể được thu thập một cách dễ dàng từ một hỗn hợp các phân tử bao gồm RNA, protein, polysaccharide, DNA không có chức năng và DNA có chức năng di truyền. Người ta còn gọi nó là kĩ thuật tạo dòng DNA in vitro. Ngày nay, PCR được dùng rất phổ biến trong lĩnh vực sinh học.
Kết quả của phản ứng PCR chịu ảnh hưởng của các yếu tố như: DNA khuôn, Taq polimerase, mồi và nhiệt độ nóng chảy của mồi, ion Mg2+, nguyên liệu là các dNTP, nước, dung dịch đệm,...
3.2. Nguyên tắc hoạt động
Nguyên tắc của PCR là khuếch đại đoạn DNA đích trong ống nghiệm phản ứng để sau đó phát hiện chúng. Do vậy, PCR hiện nay đang trở thành một công cụ chẩn đoán nhạy nhất, cho đến nay chưa có thử nghiệm nào sánh kịp, để phát hiện các tác nhân vi sinh vật gây bệnh (ngay cả các vi sinh vật không thể phát hiện được bằng các xét nghiệm khác) trong các bệnh phẩm khác nhau.
Đây là một kỹ thuật tạo dòng in vitro nhằm khuếch đại đặc trưng một đoạn DNA nằm giữa hai trình tự oligonucleotide đã biết trước. Hai trình tự oligonucleotide này được gọi là mồi xuôi (forward primer)bắt cặp với mạch âm DNA và mồi ngược (reverse primer) bắt cặp với mạch dương DNA. Một phản ứng PCR bao gồm nhiều chu kỳ giống nhau được lặp đi lặp lại nhiều lần. Một chu kỳ PCR bình thường gồm 3 giai đoạn nhiệt độ:
Bước 1: Nhiệt độ phản ứng là 940 - 950C, ở nhiệt độ này các liên kết hydro của mạch đôi DNA sẽ bị mất đi, nhờ vậy DNA đích bị biến tính thành các mạch đơn. Giai đoạn nhiệt độ này được gọi là giai đoạn biến tính (denaturation).
Bước 2: Kế đó nhiệt độ sẽ được hạ đến 550
C - 650C là nhiệt độ thích hợp để các đoạn mồi tìm đến bắt cặp bổ sung vào hai đầu của đoạn DNA đích, giai đoạn nhiệt độ này được gọi là giai đoạn bắt cặp (annealing).
Bước 3: Giai đoạn kéo dài hay tổng hợp (elongation): nhiệt độ được đưa lên 720C là nhiệt độ thích hợp cho hoạt tính của Taq polymerase để kéo các
dNTPs lại đầu 3’ của đoạn mồi đang bắt cặp trên đầu 5’ của sợi DNA đích để bắt nguồn cho sự tổng hợp nên mạch bổ sung.
Như vậy, qua một chu kỳ nhiệt, một DNA đích đã được nhân bản thành hai bản sao. Nếu chu kỳ này được lặp đi lặp lại liên tục 30 đến 40 lần thì từ một DNA đích đã nhân bản được thành 230đến 240bản sao, tức là đến hàng tỷ bản sao. Thông thường, một phản ứng PCR không được vượt quá 40 chu kỳ.
3.3. Phương pháp Real-time PCR
Khi sử dụng phương pháp PCR phải giải quyết hai vấn đề: đó là ảnh hưởng của pha bão hòa (plateau phase) trong phản ứng PCR và sự ức chế phản ứng do các chất kiềm hãm (PCR inhibitor). Càng về cuối, khi lượng mồi giảm, nồng độ các sản phẩm PCR quá cao khiến cho mồi khó kết hợp với mạch khuôn. Các thành phần phản ứng như enzyme, nucleotide, MgCl2… cạn kiệt, phản ứng PCR bắt đầu bước vào pha bão hòa, hiệu quả nhân bản giảm không còn mang tính lũy thừa. Lúc đó, nếu căn cứ vào hàm lượng sản phẩm PCR để suy ra hàm lượng nucleic acidban đầu là không chính xác. Vấn đề thứ hai là sự tồn tại của các chất kìm hãm phản ứng PCR, cả sau quá trình tách chiết cũng ảnh hưởng lớn đến hàm lượng sản phẩm PCR sau cùng.
94oC Biến tính 55oC-65oC Bắt cặp 72oC Kéo dài Chu kỳ 1 Chu kỳ 2 Chu kỳ 3 VZV
Người ta đã có nhiều cải tiến nhằm làm cho phương pháp định lượng dựa trên kỹ thuật PCR trở nên chính xác và có độ tin cậy cao hơn. Sự phát triển về kỹ thuật cũng góp phần đáng kể vào việc hình thành một phương pháp định lượng mới, đó là Real-time PCR.
Real-time PCR là kỹ thuật mà kết quả khuếch đại DNA đích hiển thị được ngay sau mỗi chu kỳ nhiệt của phản ứng nên được gọi là Real-time.
So với PCR truyền thống, Real-time PCR có nhiều ưu điểm hơn như:
Độ đặc hiệu của Real-time PCR cao hơn rất nhiều so với PCR truyền thống do sử dụng các mẫu dò đặc hiệu để phát hiện sản phẩm khuếch đại.
Real-time PCR cho phép định lượng sản phẩm khuếch đại nhờ sử dụng các chất phát quang đặc hiệu, lượng sản phẩm khuếch đại có thể định lượng ở từng chu kỳ phản ứng.
Dữ liệu Real-time PCR có thể được đánh giá mà không cần phải điện di trên gel, giúp tiết kiệm thời gian và gia tăng số lượng thí nghiệm thực hiện.
Việc tiến hành phản ứng và đánh giá dữ liệu trong một hệ thống ống đóng kín giúp làm giảm nguy cơ ngoại nhiễm và loại bỏ những thao tác sau phản ứng PCR.
3.3.1. Nguyên tắc hoạt động
Phản ứng Real-time PCR thực chất chính là phản ứng PCR, nhưng phương pháp này có thể định lượng được hàm lượng DNA/RNA có trong mẫu nhờ các chất nhuộm phát huỳnh quang (fluorescent dye). Sau khi nhân bản, các sản phẩm PCR mục tiêu sẽ được theo dõi hàm lượng theo một thời gian thật (realtime) của phản ứng. Sản phẩm DNA khuếch đại được đánh dấu bằng chất hiện màu hay mẫu dò (probe) phát huỳnh quang. Những máy luân nhiệt đặc hiệu có trang bị hệ thống quang học nhằm phát và thu nhận tín hiệu
huỳnh quang (máy real-time PCR). Tín hiệu huỳnh quang được đo lường, phản ánh lượng sản phẩm khuếch đại trong mỗi chu kỳ.
3.3.2. Thiết bị
Các loại thiết bị nhân bản nucleic acid có sử dụng huỳnh quang thông dụng trên thị trường hiện nay như: hệ thống ABI Prism 7700 (Perkin Elmer Applied Biosystems), LightCycler (Roche Diagnostics), iCycler (Bio-Rad), Mx400 (Stratagene), Chimaera Quantitative PCR System (hybaid), DNA Engine Opticon Continuous Flourescent Detection System (MJ Research).
3.3.3. Các kiểu phản ứng Real-time PCR
Hiện nay có bốn kiểu phản ứng được sử dụng trong kỹ thuật Real-time PCR với độ nhạy tương đương nhau. Cả bốn phương pháp đều sử dụng chất nhuộm phát huỳnh quang (florescent dye) có sự kết hợp bước nhân bản và phát hiện sản phẩm PCR mục tiêu nhằm theo dõi hàm lượng sản phẩm PCR mục tiêu theo thời gian thật (real-time) của phản ứng. Phương pháp đơn giản nhất là sử dụng một chất hóa học phát huỳnh quang có khả năng gắn vào phân tử DNA mạch đôi. Ba phương pháp còn lại sử dụng probe có đánh dấu bằng chất phát huỳnh quang để lai đặc hiệu với sản phẩm PCR mục tiêu.
Molecular beacon (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Đây là loại probe có cấu trúc dạng vòng và cuống (stem and loop structure), trong đó cấu trúc dạng vòng bắt cặp bổ sung đặc hiệu với trình tự nucleic acid mục tiêu. Một chất hóa học phát huỳnh quang được gắn vào một đầu của probe và một chất hóa học khác (quencher) được gắn ở đầu bên kia. Quencher là một chất màu không phát huỳnh quang có nhiệm vụ làm tiêu giảm năng lượng mà nó nhận được từ chất phát huỳnh quang dưới dạng nhiệt và vì thế không cho ánh sáng huỳnh quang nào được phát ra. Phần cấu trúc dạng cuống làm cho hai đầu của probe ở gần với nhau trong không gian, lúc đó quencher sẽ phát huy tác dụng và ngăn cản sự phát huỳnh quang của chất phát huỳnh quang. Khi probe bắt cặp bổ sung với một mạch của trình tự DNA mục tiêu ở nhiệt độ lai của phản ứng thì probe mất cấu trúc dạng vòng và
cuống trở thành dạng thẳng. Điều này làm gia tăng khoảng cách không gian giữa chất phát huỳnh quang và quencher. Chất phát huỳnh quang lúc đó sẽ phát ánh sáng mà các thiết bị có thể thu nhận và phân tích. Nếu beacon không bắt cặp bổ sung hoàn toàn với trình tự DNA thì không có sự phát ánh sáng huỳnh quang.
Hình1.10: Nguyên tắc hoạt động của Molecular beacon
Chất nhuộm gắn với DNA mạch đôi
Chất nhuộm này gắn vào mọi phân tử DNA mạch đôi. Khi ở trạng thái tự do, chất nhuộm không phát huỳnh quang nhưng sau khi đã gắn vào DNA mạch đôi thì chất nhuộm phát huỳnh quang và cường độ huỳnh quang phát ra tỉ lệ thuận với hàm lượng DNA có trong phản ứng PCR. Các chất nhuộm phát huỳnh quang thường được sử dụng là SYBR Green I, Ethidium bromide.
Trong phản ứng PCR, các chất nhuộm sẽ gắn vào các DNA mới được tổng hợp trong bước kéo dài mạch và rời ra khi các phân tử DNA bị biến tính trong bước biến tính. Mọi DNA mạch đôi hiện diện trong phản ứng đều có khả năng bắt chất nhuộm và phát huỳnh quang nên nếu có các sản phẩm ký sinh trong phản ứng thì sự định lượng trở nên không chính xác. Để phát hiện các sản phẩm ký sinh trong phản ứng, người ta xây dựng một đường cong “nóng chảy” (mealting curve) bằng cách nâng dần nhiệt độ phản ứng và đo giá trị cường độ ánh sáng huỳnh quang phát ra tại các thời điểm nhiệt độ khác nhau.
Probe đôi (Hybridization probe)
Phương pháp này có độ đặc hiệu rất cao do việc sử dụng cùng lúc hai probe bắt cặp với trình tự DNA mục tiêu. Một probe mang ở đầu 3’ chất cho “flourescein” (flourescein donor) phát ánh sáng màu xanh và một probe thứ hai mang ở đầu 5’ chất nhận “flourescein” ( flourescein acceptor). Probe thứ hai được chặn ở đầu 3’ sao cho Taq polymerase không thể kéo dài mạch từ đầu này. Ánh sáng huỳnh quang chuyển từ chất cho đến chất nhận thông qua hiệu ứng FRET (Flourescent Resonance Energyn Trasfer – sự chuyển năng lượng huỳnh quang kiểu cộng hưởng) và chất nhận sẽ phát ra ánh sáng huỳnh quang có màu đỏ (red flourescent).
Trong dung dịch phản ứng khi chất cho và chất nhận cách xa nhau thì tín hiệu nền là tín hiệu huỳnh quang do chất cho phát ra. Đến bước bắt cặp giữa probe với bản mẫu thì có sự sắp xếp giữa hai probe sao cho phần đầu của probe này tiếp xúc với phần đuôi của probe kia. Khi có hiệu ứng FRET xảy ra, chất nhận huỳnh quang phát ra một ánh sáng huỳnh quang mới có bước sóng lớn hơn ánh sáng mà nó nhận được và sẽ có các thiết bị ghi nhận. Cường độ huỳnh quang do chất nhận phát ra tỉ lệ thuận với hàm lượng PCR trong phản ứng.
Probe thủy giải ( Hydrolysis probe)
Probe sử dụng trong phương pháp này cò gọi là Taqman (Taqman probe). Probe Taqman được gắn một chất phát huỳnh quang (reporter) ở đầu 5’ và một chất “dập tắt” (quencher) ở đầu 3’ sao cho ánh sáng huỳnh quang của chất phát huỳnh quang bị hấp thu bởi quencher. Trong bước bắt cặp và kéo dài mạch của một chu kỳ PCR, probe này sẽ bắt cặp với mạch bổ sung trên trình tự DNA mục tiêu. Khi Taq polymerase kéo dài mạch bổ sung từ đầu 3’ của mồi đến tiếp xúc với probe, nó sẽ thể hiện hoạt tính 5’ – 3’ exonuclease và loại bỏ một số nucleotide ở đầu của probe thay bằng các nucleotide mới. Khi đó, chất huỳnh quang sẽ tách rời probe và quencher mất tác dụng. Cường độ huỳnh quang phát ra tương ứng với hàm lượng sản phẩm PCR có trong phản ứng.
Taqman probe chỉ bắt cặp với mạch khuôn nếu trình tự nucleotide của hai phân tử DNA là bổ sung hoàn toàn với nhau. Nếu không có sự bổ sung hoàn toàn thì Taqman probe sẽ không bắt cặp và sẽ không có tín hiệu huỳnh quang nào được phát ra. Như vậy, các sản phẩm ký sinh nếu có trong phản ứng PCR cũng không thể hiện. Điều này khiến cho phản ứng PCR sử dụng Taqman probe có tính đặc hiệu cao. Thông thường, Taqman probe có nhiệt độ nóng chảy cao hơn cặp primer từ 8-100C nhằm tạo thuận lợi cho việc bắt cặp và thủy giải probe bởi Taqman polymerase.
Bắt cặp:
Kéo dài:
Hình1.13: Nguyên tắc hoạt động của Taqman probe
Một số điều lưu ý khi thực hiện phản ứng Real-time PCR.
- Kích thước sản phẩm PCR trong phản ứng Real-time PCR
Chiều dài tối ưu của sản phẩm PCR trong phản ứng Real-time PCR thường nhỏ hơn 100bp. Đôi khi có thể tăng kích thước nhân bản sản phẩm lên đến 400bp trong một số trường hợp với Taqman probe. Sản phẩm PCR có kích thước ngắn nhân bản hiệu quả hơn và chịu các điều kiện bất lợi của phản ứng tốt hơn so với các sản phẩm có kích thước lớn. Sản phẩm có kích thước nhỏ có thể biến tính ở nhiệt đô 920C và chỉ cần 15 giây để Taq polymerase tổng hợp hoàn toàn một mạch mới bổ sung. Tuy nhiên kích thước tối thiểu của sản phẩm PCR phụ thuộc rất nhiều vào kích thước của mồi và mẫu dò sử dụng trong phản ứng Real-time PCR.
- Khái niệm chu kỳ ngưỡng (threshold cycle-Ct)
Khái niệm chu kỳ ngưỡng (Ct) là khái niệm trung tâm của kỹ thuật Real- time PCR. Nguyên tắc định lượng của kỹ thuật này dựa vào một đường cong
chuẩn (standard curve) được xây dựng từ các chu kỳ ngưỡng của các mẫu có nồng độ nucleic acid biết trước. Chu kỳ ngưỡng được định nghĩa là chu kỳ mà tại đó tín hiệu huỳnh quang của sản phẩm PCR vượt qua tín hiệu huỳnh quang nền của phản ứng PCR và được các thiết bị cảm biến ghi nhận. Cường độ huỳnh quang được ghi nhận trong mỗi chu kỳ hoạt động của Real-time PCR và biểu thị lượng sản phẩm PCR tại thời điểm đó. Tín hiệu huỳnh quang nền được tạo ra trong phản ứng Real-time PCR là do các chất phát huỳnh quang có nồng độ xác định sẳn trong thành phần phản ứng PCR. Trong phản ứng Real-time PCR sử dụng Taqman probe thì chính quencher của Taqman probe sẽ đóng vai trò tạo tín hiệu nền cho phản ứng.
- Tính lặp lại (reproduccibility) của phản ứng Real-time PCR
Kết quả của phản ứng PCR thường biến động, thay đổi từ lần này sang lần khác. Nhưng phản ứng Real-time PCR lại có tính lặp lại rất cao. Nguyên nhân sự khác biệt này do thời điểm phân tích kết quả. Real-time PCR phân tích kết quả theo thời gian thật (real-time); chu kỳ ngưỡng của phản ứng lại luôn rơi vào pha lũy thừa là pha mà phản ứng xảy ra thuận lợi nhất. Trong khi đó, kết quả của phản ứng PCR thông thường chỉ được phân tích khi phản ứng kết thúc, thường là vào pha bão hòa của phản ứng. Như vậy, bất kỳ một biến đổi nhỏ nào ở pha lũy thừa cũng sẽ dẫn đến những khác biệt rất lớn trong pha bão hòa của phản ứng PCR thông thường.
- Phương trình đường chuẩn (standar curve)
Được xây dựng trên chu kỳ ngưỡng (Ct) của các mẫu đã có nồng độ DNA biết trước (các mẫu chuẩn) bằng các thiết bị thực hiện phản ứng Real-time PCR. Sau đó hàm lượng sản phẩm PCR của mẫu xét nghiệm sẽ được xác định bằng cách so sánh với hàm lượng sản phẩm PCR từ các mẫu chuẩn được nhân bản cùng lúc thông qua đường cong chuẩn vừa được xây dựng.
- Đối chứng dương (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Khi thực hiện phản ứng Real-time PCR để chạy mẫu, nên sử dụng đối chứng dương kèm theo mẫu. Đối chứng dương có thể dùng ở mức pha loãng thích hợp mà việc phân tích định lượng mẫu không yêu cầu. Mỗi lần bộ kit
được dùng, có ít nhất một đối chứng dương phải được chạy. Kết quả dương tính chỉ ra mồi, mẫu dò dùng cho việc phát hiện gene bệnh mục tiêu thực hiện phù hợp trong điều kiện thí nghiệm chuyên biệt. Nếu thu được kết quả âm tính thì kết quả kiểm tra không đạt hiệu quả và phải làm lại. Cần đảm bảo rằng đối chứng dương không tạp nhiễm các thành phần khác của kit, nếu nhiễm sẽ dẫn đến kết quả âm tính giả. Và tránh nhiễm chéo các mẫu khác khi thêm đối chứng dương để chạy phản ứng. Điều này có thể tránh được bằng cách đậy kín nắp tất cả các mẫu khác và đối chứng âm trước khi cho đối chứng dương vào giếng đối chứng dương.