II. Phương pháp nghiên cứu
3.1.2.Kết quả khảo sát các đặc tính của hệ mồi –mẫu dò
Sau khi khảo sát các đặc tính của hệ hệ mồi và mẫu dò trên phần mềm trực tuyến Oligo Analyzer 3.0 (IDT, Hoa Kỳ), chúng tôi thu được các kết quả ở bảng
3.2 và phụ lục 3, 4, 5.
Bảng 3.2: Các thông số của hệ mồi và mẫu dò của gene ORF28
Dài (nu) %GC Tm (0C) Hairpin ΔG (kcal/mole) Self-dimer
ΔG(kcal/mole) ΔG(kcal/mole) Hetero-dimer F- VZV 24 45,8 54,7 -1,69 -7,05 Với P:-6,68 Với R:-3,61 P- VZV 25 60 65,2 -3,56 Tm: 53,9 -9,75 Với R:-6,75 R- VZV 19 57,9 56,1 -2,27 Tm: 46 -6,97
Dựa trên kết quả khảo sát đặc tính mồi nhận thấy:
Về mặt kích thước, cả hệ mồi và mẫu dò đạt yêu cầu về chiều dài tốt nhất (18 – 30bp).
Về thành phần %GC, các mồi trên có %GC nằm trong tỉ lệ tốt nhất (40% - 60%).
Nhiệt độ lai của hệ mồi và mẫu dò thoả mãn điều kiện thiết kế [Taqman probe có nhiệt độ nóng chảy cao hơn mồi 5-100
C,( Vì ở giai đọan 600
C là nhiệt độ bắt cặp tối ưu của Taqman probe, probe sẽ bắt cặp vào sợi đích trước, rồi mồi mới bắt cặp)].
Cấu trúc thứ cấp (thể hiện ở phần phụ lục): bao gồm hairpin loop (cấu trúc kẹp tóc), self dimer (oligonucleotide tự bắt cặp với chính nó), hetero dimer (sự bắt cặp giữa hai oligonucleotide khác nhau)]. Trong phản ứng PCR, nếu cấu
trúc bậc hai này càng bền vững bao nhiêu thì hiệu quả nhân bản càng giảm đi bấy nhiêu.
Độ bền vững của các cấu trúc thứ cấp được đo bằng chỉ số năng lượng tự do (∆G, kcal/mole), chỉ số này phải lớn hơn -9kcal (theo Livak,1999) vì ∆G càng lớn bao nhiêu thì cấu trúc càng kém bền bấy nhiêu, do đó sẽ không ảnh hưởng đến hoạt động của PCR.
Kết quả khảo sát trên phần mềm trực tuyến IDT oligo analyzer cho thấy, tất cả cấu trúc thứ cấp của hệ hệ mồi và mẫu dò đều có ∆G > -9kcal, chỉ trừ mẫu dò là có ∆G < -9kcal, nhưng khoảng chênh lệch này không đáng kể và nằm trong khoảng cho phép có thể chấp nhận được.