II. Phương pháp nghiên cứu
2.1. Phương pháp thiết kế mồi –mẫu dò
2.1.1.Nguyên tắc
Mồi (primer) là đoạn nucleotit ngắn bổ trợ cho vùng DNA cần được khuếch đại trong Real-time PCR. Mồi bắt cặp với sợi khuôn DNA biến tính tạo ra vùng khởi động quá trình tổng hợp nên phân tử DNA mới. Mồi là yếu tố quan trọng nhất quyết định sự nhân bản đặc hiệu và hiệu quả của phản ứng PCR. Do đó, thiết kế mồi là công việc đầu tiên và là một trong những khâu quan trọng nhất khi thực hiện quy trình Real-time PCR. Khi thiết kế phải dựa trên các nguyên tắc sau:
- Mồi có chiều dài từ 18-30 base (tốt nhất khoảng 24 base). - Hàm lượng GC 40-60%
- Base kết thúc của primer tốt nhất là G hoặc C
- Tránh cấu trúc thứ cấp (kẹp tóc, self dimer) (Bắt buộc ΔG > -9, nếu ΔG <- 9 thì Tm phải cao khoảng trên 60oC).
- Tránh lặp lại base C hoặc G hơn 3 lần.
- Lựa chọn vùng trình tự khuôn tốt nhất để thiết kế primer là khoảng 300- 1000 base (vùng dài hơn sẽ yêu cầu phản ứng PCR lâu hơn).
- Mồi nên có nhiệt độ bắt cặp từ 55-600C.
- Kiểm tra trình tự của mồi xuôi và mồi ngược để đảm bảo không có sự bắt cặp bổ sung ở đầu 3’(tránh tạo primer-dimer).
- Mồi được thiết kế sao cho nhiệt độ nóng chảy Tm của mồi xuôi và mồi ngược không được cách biệt nhau quá xa.
- Tránh các cặp GC lặp lại nhiều lần, thành phần 5 nucleotide cuối cùng trong đầu 3’ không được lớn hơn hai G hoặc C tránh hiện tượng nhân bản ký sinh, trình tự mồi phải đặc trưng cho DNA cần nhân bản.
Trong đề tài này, chúng tôi sử dụng phương pháp Real-time PCR ngoài mồi còn phải thiết kế mẫu dò cho phản ứng.
Mẫu dò (probe) là một trình tự oligonucleotide ngắn được xác định và đánh dấu bằng nhiều phương pháp khác nhau dùng để nhận diện các đoạn nucleic khác có trình tự bổ sung với nó. Mẫu dò được dùng trong phản ứng Real-time
PCR để định lượng số lượng bản sao được khuếch đại. Việc thiết kế mẫu dò cũng tương tự thiết kế mồi, chỉ khác mẫu dò được gắn thêm một chất có thể phát tín hiệu (thường là đồng vị phóng xạ P32
/P33 hoặc chất phát huỳnh quang).
Thông thường mẫu dò được thiết kế trước khi thiết kế mồi, mồi được thiết kế gần với vị trí của mẫu dò nhưng không được trùng lắp với mẫu dò. Khi thiết kế mẫu dò cần chú ý các vấn đề sau:
- Mẫu dò phải nằm gần mồi (để không ảnh hưởng đến quá trình đọc tín hiệu) - Hầu hết mẫu dò có chiều dài ngắn hơn 30 nu.
- Không nên có G ở đầu 5’ vì G hấp thụ tín hiệu huỳnh quang làm sai lệch kết quả.
- Trình tự mẫu dò có hàm lượng GC khoảng 30-80%. - Mẫu dò phải có nhiều base C hơn G.
- Nhiệt độ nóng chảy của mẫu dò lớn hơn nhiệt độ nóng chảy của primer 8- 100C.