II. Phương pháp nghiên cứu
2.2.Phương pháp xử lý mẫu bệnh phẩm
2.2.1. Lấy mẫu và bảo quản
- Đối với mẫu là dịch não tủy: sử dụng thủ thuật chọc dò tủy sống để thu dịch não tủy. Dùng kim tiêm chọc dò tủy sống ở khe giữa đốt sống thắt lưng số 4 - 5
( L4-5) hoặc 3 -4 (L3-4), hút khoảng 100µl dịch não tủy của bệnh nhân cho vào eppendorf có chứa 600µl dd TE 1X để bảo quản.
- Đối với mẫu là dịch phết: thì dùng tâm bông vô trùng phết vỡ các mụn nước lấy dịch rồi cho vào eppendorf có chứa 600µl dd TE 1X để bảo quản.
- Cho eppendorf có chứa mẫu vào thùng đá gel giữ lạnh và đem về phòng thí nghiệm.
- Bảo quản mẫu ở -200C.
2.2.2. Phương pháp ly trích DNA
Tiến hành tách chiết DNA theo phương pháp Phenol-chloroform (Pictr Chomozynski, 1986).
Phương pháp này được dùng để tách chiết DNA cho rất nhiều mẫu thử, kể cả các mẫu thử có chứa nhiều DNA vật chủ như các mẫu mô sinh thiết. Phương pháp này còn được dùng cho các mẫu bệnh phẩm huyết thanh, mủ, đàm đã thuần nhất và loại tạp nhiễm, mô nghiền và các dịch sinh học.[2]
2.2.2.1. Nguyên tắc
Sự tách chiết dựa trên nguyên tắc hòa tan khác nhau của các phần tử khác nhau (nucleic acid/ protein) trong hai pha không hòa tan nhau (phenol, chloroform/nước). Trong quá trình tách chiết dưới tác động của phenol pH8
và guanidinium thyocyanate là những chất biến tính protein mạnh có trong chế phẩm Trizol, tế bào vi khuẩn sẽ bị phá vỡ giải phóng DNA của bộ gen và các thành phần nội bào khác. Sau li tâm, hỗn hợp phân tách thành hai pha rõ rệt, thu nhận pha nước có chứa DNA ở phần trên, loại bỏ phần dưới. DNA được thu nhận bằng cách tủa trong một thể tích isopropanol với sự hỗ trợ của cccDNA (covalently closed circular – phân tử DNA vòng nén chặt) – một ”mạng lưới” bao và kéo DNA xuống đáy khi li tâm giúp cho quá trình tủa được triệt để hơn. Cuối cùng tủa DNA được rửa trong ethanol 70% và hòa vào dung dịch TE 1X.
2.2.2.2. Cách tiến hành
Các mẫu bệnh phẩm sau thời gian bảo quản lấy ra đem vortex trước khi tiến hành tách chiết. Sau đó, đánh dấu các eppendorf 1.5 ml vô trùng bằng kí hiệu mẫu và tiếp tục thực hiện theo các bước (hình phụ lục 8):
Bước 1: Hút 200µl dịch bệnh phẩm cho vào 900µl Trizol. Vortex 30s, để yên 10 phút.
Bước 2: Thêm 200µl chloroform, trộn đều. Ly tâm 13.000 rpm trong 10 phút.
Bước 3: Thu hồi 600µl dịch nổi vào eppendorf mới có sẳn 600µl isopropanol (có bổ sung thêm chất trợ tủa), đảo nhẹ nhiều lần. Làm lạnh 10 phút, ly tâm 13.000rpm trong 10 phút.
Bước 4: Loại bỏ dịch nổi, rửa tủa bằng 900µl ethanol 70%, ly tâm 13.000rpm trong 5 phút.
Bước 5: Loại dịch nổi, sấy khô ở 600C, hòa cặn DNA trong 50µl dung dịch TE 1X để bảo quản mẫu.
Nếu chưa đặt phản ứng Real-time PCR thì phải bảo quản mẫu tách chiết ở -200C.
2.3. Thực hiện phản ứng Real-time PCR
Cách tiến hành
- Dung dịch đệm cho phản ứng: 50mM KCl, Tris pH8 10mM. - Dung dịch đệm 1X.
- Taq DNA polymerase 0,625 Units. - MgCl2 3,5mM.
- dNTPs (dTP, dTTP, dGTP, dCTP) 0,5mM cho mỗi loại. - Mồi xuôi và mồi ngược: 0,5µl.
- Mẫu dò: 0,5µl. - DNA mẫu: 5µl
- Thêm nước cất 2 lần cho đủ 25µl. - Mẫu chứng (-), mẫu chứng (+)
Cài đặt chương trình và định dạng vị trí các mẫu trong bloc nhiệt của máy (plate set up) chọn màu FAM và cài đặt chương trình Real-time PCR như sau:
Hình 2.2: Chương trình luân nhiệt của phản ứng Real-time PCR
2.4. Phương pháp khảo sát độ nhạy của quy trình
Độ nhạy cho biết lượng bản sao nhỏ nhất mà một phương pháp có thể cho kết quả dương tính. Mục đích của bước này nhằm xác định nồng độ thấp nhất của mẫu mà quy trình có thể phát hiện được.
Mẫu DNA có nồng độ xác định là 108 copies/ml được khảo sát tại công ty Việt Á. Sau đó tiến hành pha loãng mẫu bậc 10 theo gradient nồng độ từ 108
- 101 copies/ml và chạy phản ứng Real-time PCR ở điều kiện tối ưu đã khảo sát ở trên với thành phần phản ứng: nồng độ của mồi – mẫu dò là 0,5 µl, DNA mẫu 5 µl, Master mix 12,5µl, nước cất vô trùng 6,5 µl. Dựa vào kết quả thu được để xác định độ nhạy của quy trình.
2.5. Phương pháp khảo sát độ đặc hiệu của mồi – mẫu dò
Độ đặc hiệu cho biết khả năng bắt cặp và khuếch đại của mồi và mẫu dò vào trình tự đích mong muốn mà không bắt cặp với trình tự DNA của loài khác có trong mẫu, cụ thể trình tự đích ở đây là ORF 28 của VZV.
Cách thực hiện:
Dùng hệ mồi và mẫu dò đã thiết kế chạy phản ứng Real-time PCR với các mẫu DNA của CMV, HSV, HBV, EBV, HPV, MTB (đây là những chủng có khả năng xuất hiện trong mẫu bệnh phẩm cùng với VZV), chứng dương (DNA của VZV) và một chứng âm (nước cất vô trùng). Đồng thời đặt phản ứng với hỗn hợp phản ứng Real-time PCR chuyên biệt phát hiện DNA của từng loài sử dụng mồi –mẫu dò đặc hiệu cho từng DNA của các loài CMV, HSV, HBV, EBV, HPV, MTB nhằm mục đích xác định xem hệ mồi và mẫu dò của VZV có bắt cặp với trình tự của các loài trên hay không.
CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả thiết kế mồi và mẫu dò trên lý thuyết
Sau khi thực hiện các bước được nêu ở phần phương pháp. Kết quả cho thấy có vùng bảo tồn cao ở gene ORF28. Chúng tôi tiến hành download 18 trình tự trình tự ORF28 của VZV từ trang web: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ (phụ lục 1)
3.1.1. Kết quả thiết kế hệ mồi và mẫu dò
Hình 3.1: Kết quả sắp gióng các trình tự của ORF28 trên BioEdit
Sau khi sắp gióng các trình tự, chúng tôi tiến hành thiết kế mới hoàn toàn mồi và mẫu dòcho ORF28 dựa trên các đoạn bảo tồn của chúng. Kết quả như sau:
Bảng 3.1: Trình tự mồi và mẫu dò trên gene ORF28 của VZV
Tên Trình tự 5’-3’ Chiều dài
đoạn khuếch đại
F-VZV GCAGATTATCCGACATGCAGTCAA 164 bp
P-VZV ATTGGCGACTTGCCGGTCGAACTCG
Kết quả chạy clustal hệ mồi và mẫu dò vừa thiết kế:
• Với mồi xuôi:
Hình 3.2: Kết quả của việc tìm độ tương đồng trên gene ORF28- VZV và mồi xuôi bằng chương trình clustal.
Nhận xét: Tỷ lệ tương đồng giữa mồi xuôi và các đoạn ORF28 -VZV là 100%.
• Với mồi ngược:
Hình 3.3: Kết quả của việc tìm độ tương đồng trên gene ORF28 và mồi ngược bằng chương trình clustal.
Nhận xét: Tỷ lệ tương đồng giữa mồi ngược và các đoạn ORF28-VZV cũng là 100%.
• Với mẫu dò:
Hình 3.4 : Kết quả của việc tìm độ tương đồng trên gene ORF28 và mẫu dò bằng chương trình clustal.
Nhận xét: Tỉ lệ tương đồng của mẫu dò với 18 đoạn gene ORF28 là 100%.
Kết quả chạy Annhyb cho hệ mồi – mẫu dò:
Đối với GENE DQ479957.1: trình tự mồi xuôi, mẫu dò, và mồi ngược được thể hiện như sau:
Nhận xét: qua kết quả thu được có thể khằng định trên lý thuyết hệ mồi và mẫu dò của gene VZV có độ đặc hiệu cao với trình tự đích.
3.1.2. Kết quả khảo sát các đặc tính của hệ mồi – mẫu dò
Sau khi khảo sát các đặc tính của hệ hệ mồi và mẫu dò trên phần mềm trực tuyến Oligo Analyzer 3.0 (IDT, Hoa Kỳ), chúng tôi thu được các kết quả ở bảng
3.2 và phụ lục 3, 4, 5.
Bảng 3.2: Các thông số của hệ mồi và mẫu dò của gene ORF28
Dài (nu) %GC Tm (0C) Hairpin ΔG (kcal/mole) Self-dimer
ΔG(kcal/mole) ΔG(kcal/mole) Hetero-dimer F- VZV 24 45,8 54,7 -1,69 -7,05 Với P:-6,68 Với R:-3,61 P- VZV 25 60 65,2 -3,56 Tm: 53,9 -9,75 Với R:-6,75 R- VZV 19 57,9 56,1 -2,27 Tm: 46 -6,97
Dựa trên kết quả khảo sát đặc tính mồi nhận thấy:
Về mặt kích thước, cả hệ mồi và mẫu dò đạt yêu cầu về chiều dài tốt nhất (18 – 30bp).
Về thành phần %GC, các mồi trên có %GC nằm trong tỉ lệ tốt nhất (40% - 60%).
Nhiệt độ lai của hệ mồi và mẫu dò thoả mãn điều kiện thiết kế [Taqman probe có nhiệt độ nóng chảy cao hơn mồi 5-100
C,( Vì ở giai đọan 600
C là nhiệt độ bắt cặp tối ưu của Taqman probe, probe sẽ bắt cặp vào sợi đích trước, rồi mồi mới bắt cặp)].
Cấu trúc thứ cấp (thể hiện ở phần phụ lục): bao gồm hairpin loop (cấu trúc kẹp tóc), self dimer (oligonucleotide tự bắt cặp với chính nó), hetero dimer (sự bắt cặp giữa hai oligonucleotide khác nhau)]. Trong phản ứng PCR, nếu cấu
trúc bậc hai này càng bền vững bao nhiêu thì hiệu quả nhân bản càng giảm đi bấy nhiêu.
Độ bền vững của các cấu trúc thứ cấp được đo bằng chỉ số năng lượng tự do (∆G, kcal/mole), chỉ số này phải lớn hơn -9kcal (theo Livak,1999) vì ∆G càng lớn bao nhiêu thì cấu trúc càng kém bền bấy nhiêu, do đó sẽ không ảnh hưởng đến hoạt động của PCR.
Kết quả khảo sát trên phần mềm trực tuyến IDT oligo analyzer cho thấy, tất cả cấu trúc thứ cấp của hệ hệ mồi và mẫu dò đều có ∆G > -9kcal, chỉ trừ mẫu dò là có ∆G < -9kcal, nhưng khoảng chênh lệch này không đáng kể và nằm trong khoảng cho phép có thể chấp nhận được.
3.1.3. Kết quả khảo sát độ đặc hiệu của hệ mồi – mẫu dò
Song song với việc kiểm tra các đặc tính của mồi – mẫu dò, chúng tôi cũng tiến hành khảo sát độ đặc hiệu của mồi – mẫu dò trên lý thuyết. Để khảo sát, chúng tôi tiến hành BLAST từng trình tự trên NCBI. Chương trình này cho phép tìm kiếm các trình tự tương đồng với oligonucleotide đã có từ toàn bộ ngân hàng gene nổi tiếng trên thế giới như GENBANK, EMBL, DDBJ. Phân tích kết quả nhận được có thể kết luận cặp mồi – mẫu dò có đặc hiệu với VZV hay không. (Kết quả ở bảng phụ lục 2)
Kết quả BLAST hệ mồi – mẫu dò cho thấy mồi xuôi, mẫu dò, mồi ngược có trình tự tương đồng rất cao với duy nhất VZV. Điều này chứng minh rằng hệ mồi – mẫu dò chúng tôi sử dụng chỉ bắt cặp đặc hiệu với bộ gene của VZV.
3.2. Kết quả khảo sát hệ mồi –mẫu dò trên thực nghiệm 3.2.1. Khảo sát khả năng khuếch đại của hệ mồi –mẫu dò 3.2.1. Khảo sát khả năng khuếch đại của hệ mồi –mẫu dò
Để biết được hệ mồi –mẫu dò chúng tôi thiết kế có khả năng khuếch đại phát tín hiệu huỳnh quang với mẫu VZV trong phản ứng real-time PCR hay không. Chúng tôi tiến hành khảo sát như sau: sử dụng một mẫu chứng dương VZV và một mẫu chứng âm (với những thành phần phản ứng không đổi nhưng thay nguồn DNA bằng nước cất vô trùng).
Cho lần lượt 5µl từ mỗi mẫu trên vào mỗi mix riêng biệt (mix có chứa thành phần của hệ mồi –mẫu dò chúng tôi sử dụng). Ly tâm nhẹ và chạy phản ứng Real-time PCR.
Thí nghiệm được lặp lại ba lần với kết quả thu được:
Mẫu thử Chu kỳ ngưỡng (Ct)
Lần 1 Lần 2 Lần 3 TB
Mẫu chứng dương 25,39 25,77 24,41 25,19
Mẫu chứng âm N/A N/A N/A N/A
Kết quả minh họa bằng biểu đồ như sau:
Hình 3.6: Kết quả khảo sát khả năng khuếch đại của hệ mồi –mẫu dò (lần 2)
Nhận xét:
Biểu đồ cho thấy hệ mồi và mẫu dò đã hoạt động, đường biểu diễn của chứng dương bắt đầu ở chu kỳ trung bình là 25,19. Đường biểu diễn chứng âm không vượt qua tín hiệu nền, đường cong PCR lên đều, đẹp và không có hiện tượng nhiễu tín hiệu huỳnh quang. Chứng tỏ thí nghiệm không có hiện tượng ngoại nhiễm xảy ra.
Kết luận: Hệ mồi –mẫu dò được thiết kế có khuếch đại bản mẫu. Vì vậy, chúng ta tiến hành các khảo sát tiếp theo trên thực nghiệm với hệ mồi – mẫu dò này.
Đường nền Chứng dương
Tiếp theo, chúng tôi kiểm tra tính đặc hiệu của sản phẩm PCR nhận được với hệ mồi – mẫu dò bằng kỹ thuật giải trình tự. Mồi sử dụng cho giải trình tự là mồi đặc hiệu cho VZV đã thiết kế. Chúng tôi lấy sản phẩm PCR từ chứng dương để giải trình tự (mẫu mã số 5), gởi đến công ty Macrogenn (Hàn quốc) nhằm để kiểm tra tính đặc hiệu của sản phẩm PCR khuếch đại. Kết quả được trình bày qua bảng 3.3 và phụ lục 6.
Bảng 3.3: Kết quả giải trình tự gene ORF 28
Tên gene Trình tự nucleotid (5’ – 3’) Kích thước giải được (bp) Kích thước thiết kế (bp) ORF 28 TATCCGACATGCAGTCAATTTCAACGTCGC TTAACGTTAATTGGCGACTTGCCGGTCGAA CTCGAACACGTTCCCCATCAACTCCAGGTT TTAGTTGATACCAACCAAAA CT AAC AAA GCCGGG ATT ATCCAT TAGA AAACGA GTGGT AGCG TCT ACC
158 164
Qua kết quả bảng 3.3 cho thấy kích thước giải trình tự thu được của sản phẩm thấp hơn so với kích thước thiết kế là 6bp. Như vậy, sự chênh lệch này có thể do trong kỹ thuật giải trình tự một số nucleotide đầu tiên trong quá trình giải thường bị nhiễu tín hiệu nên không xác định được. Do vậy, sản phẩm giải trình tự sẽ cho kích thước nhỏ hơn so với sản phẩm trong thiết kế.
Kết quả giải trình tự được kiểm tra bằng phần mềm ClustalX 1.81 cho thấy: trình tự nucleotide giải được của gene ORF28 nằm trong vùng thiết kế khuếch đại sản phẩm và thuộc gene ORF28 (vị trí từ nuleotie 2592 tới 2755) của VZV(phụ lục 6).
Ngoài ra, nhằm đánh giá mức độ tương đồng của sản phẩm khuếch đại với các trình tự gene được công bố, đề tài sử dụng phần mềm BLAST để tìm
kiếm các trình tự gene được công bố trên NCBI tương đồng với sản phẩm giải trình tự. Kết quả cho thấy sản phẩm khuếch đại tương đồng với các trình tự gene ORF28 của VZV với mức độ tương đồng là 100% (phụ lục 6).
Kết luận: Như vậy, có thể khẳng định hệ mồi – mẫu dò hoạt động tốt, đặc hiệu và chuyên biệt, có thể ứng dụng được vào quy trình.
3.2.2. Khảo sát nhiệt độ lai của hệ mồi – mẫu dò
Nhiệt độ lai là một chỉ tiêu quan trọng ảnh hưởng lớn đến kết quả của phản ứng Real-time PCR. Nhiệt độ lai quá cao hoặc quá thấp đều ảnh hưởng không tốt đến kết quả phản ứng Real-rime PCR. Nếu nhiệt độ lai quá thấp so với nhiệt độ biến tính của mồi và mẫu dòsử dụng thì dễ tạo ra các sản phẩm kí sinh không mong muốn. Nếu nhiệt độ lai quá cao sẽ cản trở sự bắt cặp của mồi và mẫu dòvào DNA bản mẫu. Do đó, hiệu quả nhân bản sẽ không cao.
Từ nhiệt độ biến tính của các mồi và mẫu dò tiến hành khảo sát nhiệt độ lai cho phản ứng. Thông thường nhiệt độ lai so với nhiệt độ biến tính của mồi sai khác ±5. Do đó, ta dùng mồi và mẫu dò đã khảo sát khả năng hoạt động ở trên để xác định nhiệt độ lai, chạy trên 8 mix chứng dương, một chứng âm với gradient nhiệt độ được xác định bằng cách lấy nhiệt độ trung bình giữa mồi có nhiệt độ thấp nhất và mồi có nhiệt độ cao nhất ±5 (Ta = (Tm1 + Tm2)/2 ±50
C). Từ đó tính được khoảng gradient nhiệt độ từ 550 đến 650
C trong khi các thành phần (DNA mẫu, mồi, mẫu dò,…) và các điều kiện khác (điều kiện về thiết bị, thời gian phản ứng…) đều được giữ nguyên và đồng nhất.
Bảng 3.4: Kết quả khảo sát nhiệt độ lai Giếng phản ứng Nhiệt độ lai (0C) Chu kỳ ngưỡng (Ct) (Ct) TB lần 1 lần 2 lần 3 A08 650C 26,56 24,26 26,19 25,67 B08 64,50C 25,51 25,05 26,65 25,74 C08 63,30C 25,09 25,16 25,19 25,15 D08 61,40C 26,09 24,51 25,50 25,36 E08 58,90C 25,51 24,42 25,58 25,17 F08 57,10C 25,09 23,85 25,37 24,77 G08 55,80C 25,49 23,56 25,18 24,74 H08 55,00C 23,04 23,01 23,13 23,06
(-) (550C) N/A N/A N/A N/A
Hình 3.7: Kết quả khảo sát nhiệt độ lai (lần 1)
550C 55,80C 61,40C 650C Chứng âm 57,10C 63,30C 57,10C 63,30C
Nhận xét:
Từ kết quả bảng 3.4 cho thấy ở tất cả các nhiệt độ điều cho tín hiệu dương tính và nhiệt độ 550
C có giá trị Ct thấp nhất nghĩa là ở nhiệt độ 550
C cho hiệu quả nhân bản sớm nhất so với các nhiệt độ khác.
Kết luận: Mồi hoạt động tốt ở nhiệt độ lai là 550
C.
3.2.3. Khảo sát nồng độ mẫu dò
Nồng độ mẫu dò cũng là một yếu tố quan trọng trong phản ứng Real-time