II. Phương pháp nghiên cứu
3.2.Kết quả khảo sát hệ mồi –mẫu dò trên thực nghiệm
3.2.1. Khảo sát khả năng khuếch đại của hệ mồi –mẫu dò
Để biết được hệ mồi –mẫu dò chúng tôi thiết kế có khả năng khuếch đại phát tín hiệu huỳnh quang với mẫu VZV trong phản ứng real-time PCR hay không. Chúng tôi tiến hành khảo sát như sau: sử dụng một mẫu chứng dương VZV và một mẫu chứng âm (với những thành phần phản ứng không đổi nhưng thay nguồn DNA bằng nước cất vô trùng).
Cho lần lượt 5µl từ mỗi mẫu trên vào mỗi mix riêng biệt (mix có chứa thành phần của hệ mồi –mẫu dò chúng tôi sử dụng). Ly tâm nhẹ và chạy phản ứng Real-time PCR.
Thí nghiệm được lặp lại ba lần với kết quả thu được:
Mẫu thử Chu kỳ ngưỡng (Ct)
Lần 1 Lần 2 Lần 3 TB
Mẫu chứng dương 25,39 25,77 24,41 25,19
Mẫu chứng âm N/A N/A N/A N/A
Kết quả minh họa bằng biểu đồ như sau:
Hình 3.6: Kết quả khảo sát khả năng khuếch đại của hệ mồi –mẫu dò (lần 2)
Nhận xét:
Biểu đồ cho thấy hệ mồi và mẫu dò đã hoạt động, đường biểu diễn của chứng dương bắt đầu ở chu kỳ trung bình là 25,19. Đường biểu diễn chứng âm không vượt qua tín hiệu nền, đường cong PCR lên đều, đẹp và không có hiện tượng nhiễu tín hiệu huỳnh quang. Chứng tỏ thí nghiệm không có hiện tượng ngoại nhiễm xảy ra.
Kết luận: Hệ mồi –mẫu dò được thiết kế có khuếch đại bản mẫu. Vì vậy, chúng ta tiến hành các khảo sát tiếp theo trên thực nghiệm với hệ mồi – mẫu dò này.
Đường nền Chứng dương
Tiếp theo, chúng tôi kiểm tra tính đặc hiệu của sản phẩm PCR nhận được với hệ mồi – mẫu dò bằng kỹ thuật giải trình tự. Mồi sử dụng cho giải trình tự là mồi đặc hiệu cho VZV đã thiết kế. Chúng tôi lấy sản phẩm PCR từ chứng dương để giải trình tự (mẫu mã số 5), gởi đến công ty Macrogenn (Hàn quốc) nhằm để kiểm tra tính đặc hiệu của sản phẩm PCR khuếch đại. Kết quả được trình bày qua bảng 3.3 và phụ lục 6.
Bảng 3.3: Kết quả giải trình tự gene ORF 28
Tên gene Trình tự nucleotid (5’ – 3’) Kích thước giải được (bp) Kích thước thiết kế (bp) ORF 28 TATCCGACATGCAGTCAATTTCAACGTCGC TTAACGTTAATTGGCGACTTGCCGGTCGAA CTCGAACACGTTCCCCATCAACTCCAGGTT TTAGTTGATACCAACCAAAA CT AAC AAA GCCGGG ATT ATCCAT TAGA AAACGA GTGGT AGCG TCT ACC
158 164
Qua kết quả bảng 3.3 cho thấy kích thước giải trình tự thu được của sản phẩm thấp hơn so với kích thước thiết kế là 6bp. Như vậy, sự chênh lệch này có thể do trong kỹ thuật giải trình tự một số nucleotide đầu tiên trong quá trình giải thường bị nhiễu tín hiệu nên không xác định được. Do vậy, sản phẩm giải trình tự sẽ cho kích thước nhỏ hơn so với sản phẩm trong thiết kế.
Kết quả giải trình tự được kiểm tra bằng phần mềm ClustalX 1.81 cho thấy: trình tự nucleotide giải được của gene ORF28 nằm trong vùng thiết kế khuếch đại sản phẩm và thuộc gene ORF28 (vị trí từ nuleotie 2592 tới 2755) của VZV(phụ lục 6).
Ngoài ra, nhằm đánh giá mức độ tương đồng của sản phẩm khuếch đại với các trình tự gene được công bố, đề tài sử dụng phần mềm BLAST để tìm
kiếm các trình tự gene được công bố trên NCBI tương đồng với sản phẩm giải trình tự. Kết quả cho thấy sản phẩm khuếch đại tương đồng với các trình tự gene ORF28 của VZV với mức độ tương đồng là 100% (phụ lục 6).
Kết luận: Như vậy, có thể khẳng định hệ mồi – mẫu dò hoạt động tốt, đặc hiệu và chuyên biệt, có thể ứng dụng được vào quy trình.
3.2.2. Khảo sát nhiệt độ lai của hệ mồi – mẫu dò
Nhiệt độ lai là một chỉ tiêu quan trọng ảnh hưởng lớn đến kết quả của phản ứng Real-time PCR. Nhiệt độ lai quá cao hoặc quá thấp đều ảnh hưởng không tốt đến kết quả phản ứng Real-rime PCR. Nếu nhiệt độ lai quá thấp so với nhiệt độ biến tính của mồi và mẫu dòsử dụng thì dễ tạo ra các sản phẩm kí sinh không mong muốn. Nếu nhiệt độ lai quá cao sẽ cản trở sự bắt cặp của mồi và mẫu dòvào DNA bản mẫu. Do đó, hiệu quả nhân bản sẽ không cao.
Từ nhiệt độ biến tính của các mồi và mẫu dò tiến hành khảo sát nhiệt độ lai cho phản ứng. Thông thường nhiệt độ lai so với nhiệt độ biến tính của mồi sai khác ±5. Do đó, ta dùng mồi và mẫu dò đã khảo sát khả năng hoạt động ở trên để xác định nhiệt độ lai, chạy trên 8 mix chứng dương, một chứng âm với gradient nhiệt độ được xác định bằng cách lấy nhiệt độ trung bình giữa mồi có nhiệt độ thấp nhất và mồi có nhiệt độ cao nhất ±5 (Ta = (Tm1 + Tm2)/2 ±50
C). Từ đó tính được khoảng gradient nhiệt độ từ 550 đến 650
C trong khi các thành phần (DNA mẫu, mồi, mẫu dò,…) và các điều kiện khác (điều kiện về thiết bị, thời gian phản ứng…) đều được giữ nguyên và đồng nhất.
Bảng 3.4: Kết quả khảo sát nhiệt độ lai Giếng phản ứng Nhiệt độ lai (0C) Chu kỳ ngưỡng (Ct) (Ct) TB lần 1 lần 2 lần 3 A08 650C 26,56 24,26 26,19 25,67 B08 64,50C 25,51 25,05 26,65 25,74 C08 63,30C 25,09 25,16 25,19 25,15 D08 61,40C 26,09 24,51 25,50 25,36 E08 58,90C 25,51 24,42 25,58 25,17 F08 57,10C 25,09 23,85 25,37 24,77 G08 55,80C 25,49 23,56 25,18 24,74 H08 55,00C 23,04 23,01 23,13 23,06
(-) (550C) N/A N/A N/A N/A
Hình 3.7: Kết quả khảo sát nhiệt độ lai (lần 1)
550C 55,80C 61,40C 650C Chứng âm 57,10C 63,30C 57,10C 63,30C
Nhận xét:
Từ kết quả bảng 3.4 cho thấy ở tất cả các nhiệt độ điều cho tín hiệu dương tính và nhiệt độ 550
C có giá trị Ct thấp nhất nghĩa là ở nhiệt độ 550
C cho hiệu quả nhân bản sớm nhất so với các nhiệt độ khác.
Kết luận: Mồi hoạt động tốt ở nhiệt độ lai là 550
C.
3.2.3. Khảo sát nồng độ mẫu dò
Nồng độ mẫu dò cũng là một yếu tố quan trọng trong phản ứng Real-time PCR. Do đó, cần có một nồng độ mẫu dò nhất định để sử dụng vừa đủ trong quá trình thực hiện phản ứng, tránh trường hợp thiếu hoặc thừa mẫu dò, như vậy sẽ không đem lại kết quả như mong muốn, đồng thời tốn nhiều chi phí. Vì thế, chúng tôi tiến hành bước khảo sát này nhằm tìm ra nồng độ mẫu dò thích hợp. Theo các nghiên cứu, nồng độ mẫu dò trong phản ứng Real-time PCR dao động trong khoảng 100nM đến 500nM. Chúng tôi chọn phổ nồng độ từ 100-500nM với đơn vị tăng là 100nM nhằm tìm ra nồng độ cho giá trị Ct nhỏ nhất, thí nghiệm được lặp lại ba lần và kết quả được trình bày ở bảng 3.5.
Bảng 3.5: Kết quả khảo sát nồng độ mẫu dò
Nồng độ mẫu dò (nM) Chu kỳ ngưỡng (Ct) Ct TB Lần 1 Lần 2 Lần 3 100 25,79 25,88 25,84 25,84 200 25,06 25,45 25,18 25,23 300 24,72 24,87 24,84 24,81 400 26,42 26,45 26,42 26,43 500 26,58 26,53 26,57 26,56
Hình 3.8: Kết quả khảo sát nồng độ mẫu dò (lần 2)
Nhận xét:
Kết quả bảng 3.5 cho thấy nồng độ mẫu dò 300nM cho giá trị Ct nhỏ nhất (24,81). Nồng độ này được sử dụng cho nghiên cứu tiếp theo.
Kết luận: Mẫu dò hoạt động tốt ở nồng độ 300nM.
3.2.4. Khảo sát nồng độ Mg2+
MgCl2 là đồng yếu tố (co-factor) cần thiết cho hoạt động tổng hợp của hầu hết các DNA polymerase, trong đó có Taq polymerase. Nồng độ MgCl2 ảnh hưởng đến hiệu quả và tính đặc hiệu của phản ứng. Nếu nồng độ MgCl2 quá thấp làm giảm hoặc mất hẳn hiệu quả nhân bản. Ngược lại, nếu nồng độ MgCl2 quá cao sẽ ức chế phản ứng do tăng tính bền vững cấu trúc mạch đôi của DNA, ổn định cấu trúc bắt cặp không đặc hiệu của mồi, làm giảm tính đặc hiệu và tạo sản phẩm kí sinh.
Do đó, chúng tôi khảo sát nồng độ MgCl2 tìm nồng độ MgCl2 của phản ứng có chu kì ngưỡng Ct nhỏ nhất, nghĩa là phản ứng có độ nhạy cao nhất. Nồng độ cần khảo sát từ 1,5 đến 5mM, với độ tăng là 0,5 mM và chứng âm.
Khi tiến hành khảo sát nồng độ MgCl2, chúng tôi tiến hành các phản ứng ở cùng nhiệt độ lai 550C, thành phần các chất tham gia phản ứng là như nhau, chỉ khác biệt về nồng độ MgCl2. Chúng tôi lặp lại thí nghiệm ba lần và kết quả thu được bảng 3.6. 300nM 500nM 200nM 400nM 100nM
Bảng 3.6: Kết quả khảo sát nồng độ MgCl2 Nồng độ MgCl2 (mM) (Ct) lần 1 (Ct) lần 2 (Ct) lần 3 (Ct) TB 1,5 (+) / 25,14 23,57 / 2,0 26,89 26,64 23,96 25,83 2,5 27,47 26,06 27,54 27,02 3,0 26,75 26,31 25,52 26,19 3,5 24,66 24,20 24,89 24,58 4,0 27,51 27,37 27,71 27,53 4,5 26,18 27,27 25,62 26,36 5,0 28,08 28,16 25,52 27,25 1,5 (-) Âm tính Âm tính Âm tính
Hình 3.9: Kết quả khảo sát nồng độ MgCl2 (lần 2)
Nhận xét:
Qua kết quả bảng 3.6 cho thấy nồng độ MgCl2 = 3,5mM ở chu kỳ ngưỡng thấp nhất (Ct = 24,58) đã có tín hiệu huỳnh quang.
Kết luận: Vậy chúng tôi chọn nồng độ MgCl2= 3,5mM là tối ưu cho phản ứng. MgCl2=3,0 MgCl2=5,0 MgCl2=1,5(-) MgCl2=2,0 MgCl2=2,5 MgCl2=4,5 MgCl2=3,5 MgCl2=1,5(+) MgCl2=4,0
3.2.5. Khảo sát sát khả năng nhân bản chọn lọc của hệ mồi và mẫu dò
Trên lý thuyết, bằng phần mềm Annhyb 4,942 và trình tự genome của các tác nhân HSV1, HSV2, CMV, EBV, HBV, HPV, vi khẩn lao từ Genbank để khảo sát khả năng bắt cặp của hệ mồi – mẫu dò. Kết quả khảo sát bảng 3.7.
Bảng 3.7: Kết quả khảo sát độ đặc hiệu của hệ mồi – mẫu dò thiết kế
Tên chủng HSV1 HSV2 CMV EBV HBV MTB HPV Phần trăm bắt cặp MỒI XUÔI 46,6% 25,8% 52,5% 35% 42,9% 55,4% 42,5% MỒI NGƯỢC 53,6% 57,3% 59% 33,6% 45% 74,7% 48,4% MẪU DÒ 56,8% 33,2% 50% 49% 43,7% 69,2% 33,6%
Qua kết quả bảng 3.7, chúng tôi thấy phần trăm bắt cặp giữa hệ mồi – mẫu dò của VZV trên genome của các loài HSV-1, HSV-2, CMV, EBV, HBV, HCV, HPV, MTB đều không cao, đối với mồi xuôi dao động trong khoảng 25,8% đến 55,4%, với mồi ngược trong khoảng 33,6%-74,7%, còn với mẫu dò nằm trong khoảng 33,2%-69,2% khẳng định hệ mồi-mẫu dò được thiết kế là đặc hiệu cho VZV
Trên thực nghiệm, chúng tôi tiến hành song song hai phản ứng Real-time PCR với các chứng dương CMV, HPV, HSV, MTB, HBV,EBV và một mẫu chứng dương với VZV. Và một mẫu chứng âm thực hiện trên phản ứng mồi – mẫu dò của VZV (đồng thời các mẫu chứng dương sẽ thực hiện phản ứng trên hệ mồi – mẫu dò của nó).
Các mẫu chứa DNA của HSV, HBV, HPV, CMV, EBV, MTB được khẳng định dương tính bằng phản ứng Real-time PCR của công ty Việt Á.
Kết quả chạy phản ứng giữa các loài với hệ mồi – mẫu dò đặc hiệu cho từng loài thì dương tính còn đối với hệ mồi – mẫu dò của VZV thì âm tính.
Bảng 3.8: Kết quả khảo sát độ đặc hiệu của hệ mồi – mẫu dò
Mẫu chứa virus Chu kỳ ngưỡng (Ct) Lần 1 Lần 2 Lần 3 HBV 20,52 20,71 20,64 HSV 25,01 25,31 26,83 VZV 22,84 23,35 23,70 EBV 27,16 26,12 26,88 MTB 28,42 29,08 28,30 CMV 27,18 26,91 27,81 HPV 30,18 33,10 32,32 Nhận xét:
Từ kết quả bảng 3.8 cho thấy các mẫu DNA của HBV, HSV, CMV, HPV, MTB, EBV cho kết quả dương tính với từng mix chuyên biệt dùng để phát hiện chúng. Nhưng lại cho kết quả âm tính với mix phát hiện VZV trong khi chứng
HSV dương HBV dương Đường nền Chứng âm VZV, HBV, HSV, HPV, MTB, CMV, EBV HPV dương EPV dương CMV dương MTB dương VZV dương
Hình 3.10: Khảo sát độ đặc hiệu của hệ mồi – mẫu dò (lần 1)
dương của VZV cho tín hiệu trên đường nền. Điều đó cho thấy mồi – mẫu dò có độ đặc hiệu cao.
3.2.6. Khảo sát độ nhạy của phản ứng
Bên cạnh độ đặc hiệu, độ nhạy cũng là một trong những tiêu chuẩn quan trọng
cần phải khảo sát khi thực hiện phản ứng Real-time PCR.
Chúng tôi tiến hành đặt các phản ứng Real-time PCR với những thành phần và chu trình nhiệt như đã trình bày ở trên. Nguồn DNA được lấy từ mẫu chứng dương VZV có nồng độ mẫu chuẩn từ 101 đến 108
copies/ml. Thí nghiệm được lặp lại ba lần.
Bảng 3.9: Kết quả khảo sát độ nhạy của hệ mồi – mẫu dò
Nồng độ mẫu chuẩn (copies/ml)
Chu kỳ ngưỡng (Ct) Chu kỳ ngưỡng trung bình Lần 1 Lần 2 Lần 3 Chứng âm (-) (-) (-) (-) 101 (-) (-) (-) (-) 102 38,21 37,67 37,99 37,96 103 34,62 34,77 34,27 34,55 104 32,14 32,27 32,47 32,29 105 27,80 28,37 27,89 28,02 106 24,32 24,07 24,60 24,33 107 20,73 20,83 20,20 20,59 108 17,30 17,86 17,58 17,58
Hình 3.11: Kết quả khảo sát độ nhạy của hệ mồi- mẫu dò (lần 1)
Nhận xét:
Kết quả cho thấy chứng âm không cho tín hiệu chứng tỏ quy trình hoạt động tốt. Các nồng độ từ 102
- 108 đều cho tín hiệu huỳnh quang và ở nồng độ 101
không thấy tín hiệu. Như vậy, quy trình của chúng tôi có thể phát hiện DNA
Varicella zoster virusở nồng độ 102
copies/ml.
Kết luận:Độ nhạy của quy trình là 102
copies/ml.
Khảo sát hệ số tuyến tính đường chuẩn (standard curve):
Đường chuẩn (standard curve) trong phản ứng Real-time PCR được xây dựng với các mẫu chuẩn có số lượng bản sao VZV đã biết. Với dung dịch DNA VZV có số lượng bản sao đã biết chúng tôi pha loãng bậc 10 thành nhiều dung dịch có số lượng bản sao giảm dần để xây dựng đường cong chuẩn cho phản ứng. Đường chuẩn được thực hiện cho mỗi lần chạy, từ đường chuẩn này có thể xác định được hàm lượng virus trong bệnh phẩm.
108 107 106 105 104 103 102 Chứng âm và 101
Hình 3.12: Hệ số tuyến tính của đường chuẩn của phản ứng Real-time PCR với các nồng độ DNA VZV từ 102 đến 106
copies/phản ứng
Qua ba lần khảo sát hệ số tuyến tính của đường chuẩn thể hiện ở bảng 3.10. Lần 3
Lần 2 Lần 1
Bảng 3.10: Kết quả khảo sát hệ số tuyến tính của đường chuẩn
Lần 1 Lần 2 Lần 3
PCR efficiency (hiệu quả khuếch đại) 96% 100,2% 100,9% Độ dốc (slope) -3,422 -3,318 -3,301 Hệ số tuyến tính của đường chuẩn (R2) 1,0 1,0 1,0
Có hai thông số được máy tính hiển thị trên một đường biểu diễn chuẩn. Thông số đầu tiên là hệ số tuyến tính (correlation coefficient) R2, đánh giá độ chính xác của thao tác pipetting lấy có đúng thể tích mong muốn không. Trị số R2 phải đạt trên 0,98 có nghĩa là đường biểu diễn chuẩn phải đạt tuyến tính cao. Kết quả thực nghiệm hệ số tuyến tính R2 đường chuẩn cả 3 lần đều bằng 1 (R2=1,0).
Thông số thứ hai đó là hiệu quả khuếch đại, được gọi là E% (PCR efficiency). Đối với bất kỳ đường biểu diễn chuẩn nào, đều có thể tính được hiệu quả khuếch đại theo công thức E% = (10-1/slope
-1) x100% với slope chính là độ dốc của đường biểu diễn chuẩn. Độ dốc chính là sự cách biệt nhau về chu kỳ ngưỡng giữa các ống chuẩn có số lượng giảm dần theo hệ số pha loãng 10. Theo kết quả bảng 3.10 độ dốc lần 1 là -3,422, lần 2 là -3,318 và lần 3 là -3,301. Độ dốc tối ưu của đường chuẩn là -3,32. Nhưng do ít khi được tối ưu nên có thể dao động trong khoảng -3,3 đến -3,6. Kết quả thực nghiệm cho thấy hiệu quả khuyếch đại từ 96% - 100,9% (qui định 90%-105%). Trên cơ sở đó cho thấy phản ứng Real- time PCR là hiệu quả và đạt mức độ khá tối ưu.
Trên biểu đồ chuẩn này, trục tung (Y) là Ct còn trục hoành (X) là số lượng DNA bản đích ban đầu có trong mẫu chuẩn. Do các mẫu chuẩn thường được pha cách nhau theo hệ số pha loãng 10. Các trị số 02, 03, 04, 05, 06, trên trục X được
biểu thị bằng cơ số logarit cơ số 10 (log10) tức là tương ứng với các số lượng bản đích là 102, 103, 104, 105, 106 , copies trong ống phản ứng. [2]
3.2.7. Khảo sát tính lặp lại của phản ứng Real-time PCR
Độ tin cậy của thí nghiệm được thể hiện qua nhiều yếu tố trong đó tính lặp lại là một yếu tố quan trọng. Tính lặp lại của phản ứng Real-time PCR được biểu hiện qua hai hệ số biến thiên (variability coefficient) gồm biến thiên liên phản ứng và biến thiên nội phản ứng. Giá trị các hệ số biến thiên càng thấp thì tính lặp