Bước đầu khảo sát quá trình lên men và áp dụng kỹ thuật clea để thu nhận enzyme cellulase

35 4.1.2 Định tính khả năng sinh tổng hợp cellulase của Bacillus subtilis .... Khảo sát ảnh hưởng thời gian đến khả năng sinh tổng hợp cellulase 38 4.2.2.. Khảo sát ảnh hưởng pH đến khả

TP HỒ CHÍ MINH, 1/2011

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA KỸ THUẬT HOÁ HỌC

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

BƯỚC ĐẦU KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH LÊN MEN

VÀ ÁP DỤNG KỸ THUẬT CLEA ĐỂ THU NHẬN

ENZYME CELLULASE

CBHD: TS HUỲNH NGỌC OANH

SVTH: NGUYỄN BÁ HUY

MSSV: 60600883

LỜI CẢM ƠN

Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu trường Đại Học Bách Khoa Tp Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ Hóa học và Dầu khí đã tạo điều kiện thuận lợi cho em trong suốt những năm học vừa qua, đặc biệt trong thời gian làm luận văn tốt nghiệp

Em xin chân thành cảm ơn Thầy Cô trong bộ môn Công nghệ Sinh học và cán

bộ phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học đã tận tình hướng dẫn và truyền đạt cho em những kiến thức quí báu trong suốt thời gian em học tập và thực hiện khóa luận Đặc biệt, em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến cô Huỳnh Ngọc Oanh đã tận tình chỉ bảo và giúp đỡ em hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp

Em xin chân thành cảm ơn giáo viên phản biện đã giành thời gian quí báu của mình để đọc nội dung luận văn

Em xin chân thành cảm ơn ba mẹ và bạn bè đã động viên và giúp đỡ em trong suốt thời gian qua

Em xin gởi đến tất cả quý Thầy, Cô, gia đình và các bạn sự biết ơn chân thành

và sâu sắc nhất

LỜI CẢM ƠN i

MỤC LỤC ii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT v

DANH MỤC HÌNH vi

DANH MỤC BẢNG viii

CHƯƠNG 1 1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích đề tài 1

1.3 Nội dung thực hiện 1

CHƯƠNG 2 2.1 Enzyme cellulase 3

2.1.1 Giới thiệu, phân loại, nguồn gốc 3

2.1.2 Cơ chất cellulose 4

2.1.3 Cơ chế tác dụng của cellulase 5

2.2 Vi khuẩn Bacillus subtilis 7

2.2.1 Đặc điểm chung 7

2.2.2 Cellulase được sinh tổng hợp từ Bacillus subtilis 8

2.3 Sản xuất enzyme nhờ VSV 9

2.3.1 Cơ chế điều hòa sinh tổng hợp enzyme ở vi sinh vật 10

2.3.2 Phương pháp lên men vi sinh vật thu nhận enzyme hòa tan 12

2.3.3 Thiết bị lên men (Fermenter New Brunswick Co Bioflo 110) 13

2.4 Enzyme cố định 16

2.4.1 Định nghĩa 16

2.4.2 Ưu điểm của enzyme cố định 16

2.4.3 Các phương pháp cố định enzyme 17

2.5 Phương pháp tạo liên kết chéo 17

2.5.1 Giới thiệu glutaraldehyde 18

2.6 Một số ví dụ về cố định celluase 20

CHƯƠNG 3 1

3.1 Vật liệu và hóa chất 21

3.2 Một số phương pháp chung 22

3.2.1 Phưong pháp xác định hàm lượng protein 22

3.2.2 Phương pháp xác định hoạt tính cellulase 22

3.2.3 Phương pháp tính toán 23

3.3 Cách tiến hành thí nghiệm 24

3.3.1 Khảo sát đặc điểm sinh học của Bacillus subtilis 25

3.3.2 Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp 26

3.3.3 Khảo sát ảnh hưởng thời gian đến khả năng sinh tổng hợp 30

3.4 Khảo sát quá trình cố định Cellusoft theo phương pháp CLEA 31

3.4.1 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ glutaraldehyde đến hiệu suất 31

3.4.2 Khảo sát ảnh hưởng thời gian cố định đến hiệu suất cố định 32

3.4.3 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ cố định đến hiệu suất cố định 33

CHƯƠNG 4 4.1 Khảo sát đặc điểm sinh học của Bacillus subtilis 35

4.1.1 Quan sát vi sinh vật 35

4.1.2 Định tính khả năng sinh tổng hợp cellulase của Bacillus subtilis 36

4.1.3 Khảo sát đường cong sinh trưởng của Bacillus subtilis 37

4.2 Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp 38

4.2.1 Khảo sát ảnh hưởng thời gian đến khả năng sinh tổng hợp cellulase 38 4.2.2 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ chất cảm ứng CMC đến khả năng 39

4.2.3 Khảo sát ảnh hưởng pH đến khả năng sinh tổng hợp cellulase 40

4.2.4 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ đến khả năng sinh tổng hợp cellulase 41 4.3 Khảo sát ảnh hưởng thời gian đến khả năng sinh tổng hợp cellulase 42

4.4.1 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ glutaraldehyde đến sự cố định 43

4.4.2 Khảo sát ảnh hưởng thời gian cố định đến sự cố định Cellusoft 45

4.4.3 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ đến hiệu suất cố định Cellusoft 46

4.5 Khảo sát khả năng tái sử dụng của Cellusoft cố định dạng CLEA 48

CHƯƠNG 5 5.1 Kết luận 50

5.2 Kiến nghị 50

TÀI LIỆU THAM KHẢO 52

PHỤ LỤC 52

CLEA : Cross-linked enzyme aggregate

Hình 2.1 Cellulase hoạt động trên bề mặt cellulose 3

Hình 2.2 Ảnh 3D hợp chất cao phân tử Cellulose .4

Hình 2.3 Các mắt xích β-D-Glucose trong cellulose .4

Hình 2.4 Cấu trúc vi sợi .5

Hình 2.5 Cơ chế thủy phân cellulose theo Erikson 5

Hình 2.7 Trình tự đoạn gen mã hóa cho enzyme cellulase 8

Hình 2.8 Sơ đồ quy trình công nghệ sản xuất và kỹ thuật tinh sạch enzyme 9

Hình 2.9 Cơ chế điều hòa trấn áp sinh tổng hợp enzyme bởi sản phẩm 10

Hình 2.10 Cơ chế điều hòa cảm ứng sinh tổng hợp enzyme 11

Hình 2.11 Một số thiết bị lên men của New Brunswick Co 13

Hình 2.12 Hệ thống Fermenter Bioflo 110 (New Brunswich Co., Inc., NJ, Mỹ) 15

Hình 2.13 Thiết kế headplate 15

Hình 2.14 Sơ đồ phân loại các phương pháp cố định enzyme 17

Hình 2.15 Cấu tạo hóa học của glutaraldehyde 18

Hình 2.16 Mô hình 3D của phân tử glutaraldehyde 18

Hình 2.17 Phương pháp CLEA 19

Hình 2.19 Phản ứng giữa poly(glutaraldehyde) với amin của protein 19

Hình 2.18 Phản ứng polyme hóa glutaraldehyde 19

Hình 3.1 Sơ đồ các bước nghiên cứu chung 24

Hình 3.3 Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng thời gian lên men đến khả năng tổng hợp 26

Hình 3.4 Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng nồng độ chất cảm ứng đến khả năng 27

Hình 3.5 Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng pH lên men đến khả năng tổng hợp 28

Hình 3.6 Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ lên men đến khả năng tổng hợp 29

Hình 3.7 Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng thời gian đến khả năng tổng hợp cellulase 30

Hình 3.8 Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng nồng độ glutaraldehyde đến hiệu suất 31

Hình 3.9 Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng thời gian đến hiệu suất cố định enzyme 32

Hình 3.11 Sơ đồ khảo sát khả năng tái sử dụng Cellusoft cố định dạng CLEA 34

Hình 4.1 Nhuộm Gram Bacillus subtilis và quan sát dưới kính hiển vi (x100) 35

Hình 4.2 Khuẩn lạc vi khuẩn Bacillus subtilis sau hai ngày cấy trãi 35

Hình 4.3 Vòng thủy phân biểu hiện hoạt tính cellulase 36

Hình 4.4 Kết quả điện di 36

Hình 4.5 Đồ thị biểu diễn sự tăng trưởng vi khuẩn Bacillus subtilis theo 37

Hình 4.6 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng thời gian lên men đến khả năng 38

Hình 4.7 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng nồng độ CMC đến khả năng tổng hợp 39

Hình 4.8 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng pH dịch lên men đến khả năng tổng hợp 40 Hình 4.9 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng nhiệt độ lên men đến khả năng tổng hợp 41 Hình 4.10 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng thời gian lên men đến khả năng 42

Hình 4.11 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng điều kiện lên men đến khả năng tổng …42 Hình 4.12 Khảo sát nồng độ glutaraldehyde đến sự cố định Cellusoft 43

Hinh 4.13 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng nồng độ glutaraldehyde đến sự cố định 44

Hình 4.14 Khảo sát thời gian cố định Celusoft 45

Hình 4.15 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng thời gian cố định đến hiệu suất cố định 45

Hình 4.16 Khảo sát nhiệt độ cố định Cellusoft 46

Hình 4.17 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng nhiệt độ đến hiệu suất cố định Cellusoft 47 Hình 4.18 Đồ thị biểu diễn hiệu năng tái sử dụng Cellusoft cố định dạng 48

Bảng 2.1 Tên và nguồn gốc cellulase từ Bacillus subtilis 8 Bảng 2.2 Thuộc tính enzyme cellulase từ Bacillus subtilis 8

Bảng 4.1 Biểu diễn ảnh hưởng thời gian lên men đến khả năng tổng hợp 38 Bảng 4.2 Biểu diễn ảnh hưởng nồng độ CMC đến khả năng tổng hợp cellulase 40 Bảng 4.3 Biểu diễn ảnh hưởng pH dịch lên men đến khả năng tổng hợp 41 Bảng 4.4 Biểu diễn ảnh hưởng nhiệt độ lên men đến khả năng tổng hợp 41

Bảng 4.5 Biểu diễn ảnh hưởng thời gian lên men đến khả năng tổng hợp 42

Bảng 4.6 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ glutaraldehyde đến hiệu suất cố định 44 Bảng 4.7 Biểu diễn ảnh hưởng thời gian cố định đến hiệu suất cố định 45 Bảng 4.8 Biểu diễn ảnh hưởng nhiệt độ đến hiệu suất cố định 46 Bảng 4.9 Biểu diễn hiệu năng tái sử dụng Cellusoft cố định dạng CLEA 48

CHƯƠNG 1

MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Công nghệ sản xuất enzyme ở Việt Nam còn đang ở giai đoạn nghiên cứu, đa

số phải nhập từ nước ngoài về Trong khi các ứng dụng có liên quan đến enzyme thì ngày càng tăng và hiệu quả ngày càng cao Trong số các enzyme thông dụng có cellulase - hệ enzyme thủy phân cellulose – là một enzyme có nhiều ứng dụng trong các ngành công nghiệp như thực phẩm, môi trường, công nghiệp dệt, tẩy … Việc nghiên cứu các quá trình sản xuất enzyme cellulase ở Việt Nam là cần thiết Đối tượng được sử dụng để sản xuất enzyme với qui mô công nghiệp đều là vi sinh vật Chủng

Bacillus subtilis được phát hiện bởi Ferdinand Cohn vào năm 1872 Hệ enzyme của Bacillus subtilis rất phong phú và đa dạng gồm protease, amylase, glucoamylase, glucanase, cellulase, dextranase, pectinase Cùng với Bacillus subtilis, hệ enzyme

cellulase đã được nghiên cứu

Cross-linked enzyme aggregate, một phương pháp cố định enzyme mới, một phương pháp cố định không sử dụng chất mang, một phương pháp đang được thế giới quan tâm, một phương pháp được xem là góp phần cho cuộc cách mạng công nghệ xanh Phương pháp đã được áp dụng thành công trên rất nhiều loại enzyme và giờ đây

sẽ là những khảo sát ban đầu trên enzyme cellulase

Cơ giới hóa, tự động hóa đi chung với nhiều phát minh và máy móc hiện đại, từ

đó các hệ thống lên men fermenter với khả năng hữu ích lần lượt ra đời Việc áp dụng những thiết bị công nghệ cao cũng là một phần thiết yếu giúp nâng cao hiệu năng và hiệu suất của quá trình sản xuất enzyme

Việc áp dụng những kỹ thuật và thiết bị lên men hiện đại, những phương thức

cố định enzyme tiên tiến để sản xuất chế phẩm enzyme hữu ích, đa dụng là hướng đi của đề tài chúng tôi

1.3 Nội dung thực hiện

 Xác định một số đặc tính sinh học của Bacillus subtilis

 Xác định hoạt tính cellulase của dịch sau nuôi cấy

 Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp cellulase của chủng

Bacillus subtilis ở điều kiện erlen

 Khảo sát ảnh hưởng thời gian lên men đến sinh tổng hợp cellulase của chủng

Bacillus subtilis ở quy mô fermenter

 Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình cố định Cellusoft theo phương pháp cross-linked enzyme aggregate

 Khảo sát khả năng tái sử dụng Cellusoft cố định dạng CLEA

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Enzyme cellulase

2.1.1 Giới thiệu, phân loại, nguồn gốc

Cellulase là một phức hợp gồm nhiều enzyme Các loại enzyme trong phức hợp này sẽ lần lượt phân hủy cellulose thành sản phẩm cuối cùng là glucose Theo Wood

và McCrae (1979), quá trình thủy phân cellulose được thực hiện bởi ba nhóm enzyme: exoglucanase (EC 3.2.1.91), endoglucanase (EC 3.2.1.4) và cellobiase (EC 3.2.1.21) Exoglucanase còn gọi là 1,4 β-glucan cellubiohydrolase, enzyme này thủy phân cellobiose từ đầu không khử của chuỗi glucan và cellodextrin Endoglucanase còn gọi

là 1,4 β-D-glucan 4 glucanohydrolase, enzyme này tham gia phân giải liên kết β-1,4 glucoside trong cellulose trong lignin và β-D glucan tạo ra sản phẩm là cellodextrin, cellobiose và glucose Cellobiase còn gọi là β-D glucoside glucohydrolase hay β-glucosidase, enzyme này tham gia phân hủy cellobiose và cellodextrin đến cellohexose và cuối cùng thành glucose

Các enzyme cellulase đã xuất hiện trên thị trường từ vài thập kỹ và được thu nhận từ các nguồn khác nhau Ở động vật cellulase được tìm thấy trong dịch tiết dạ dày bò, các nhóm thân mềm… Ở thực vật cellulase có trong hạt ngũ cốc nảy mầm như đại mạch, yến mạch, lúa mì mạch đen… Còn ở vi sinh vật cellulase được sản sinh ra bởi các loại xạ khuẩn, vi khuẩn, nấm sợi, nấm men…Trong thực tế người ta thường thu nhận enzyme cellulase chủ yếu từ vi sinh vật Các chủng vi sinh vật thường sử

dụng như nấm mốc: Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus candidus…;

xạ khuẩn: Actinomyces griseus, Streptomyces reticuli…; vi khuẩn: Acetobacter xylinum, Bacillus Subtilis, Bacillus pumilis…

Hình 2.1 Cellulase hoạt động trên bề mặt cellulose [32]

2.1.2 Cơ chất cellulose

Cellulose là hợp chất cao phân tử, chúng là thành phần chủ yếu cấu tạo nên vách

tế bào thực vật, trong gỗ lá kim cellulose chiếm khoảng 41-49%, trong gỗ lá rộng nó chiếm 43-52% thể tích Ngoài ra còn có ở tế bào một số loài vi sinh vật nhưng không

có trong tế bào động vật

Hình 2.2 Ảnh 3D hợp chất cao phân tử Cellulose [31]

thể nằm trong khoảng 5000-14000, chúng do các mắt xích β-D-Glucose liên kết với nhau bằng liên kết α-1,4 glucoside (các liên kết này thường không bền trong các phản ứng thủy phân) Cellulose chứa các glucose không phân nhánh và thường lệch một

Hình 2.3 Các mắt xích β-D-Glucose trong cellulose [31]

Các phân tử cellulose kết hợp với nhau nhờ lực hút Van der war và liên kết hydro Các phân tử cellulose tạo nên sợi sơ cấp có đường kính khoảng 3 nm và các sợi

sơ cấp này kết hợp với nhau tạo thành vi sợi Trong điều kiện tự nhiên, các vi sợi thường không đồng nhất và thường tồn tại hai vùng:

 Vùng kết tinh: cellulose có cấu trúc trật tự rất cao và rất bền vững với tác động của điều kiện bên ngoài Ở vùng này enzyme cellulase chỉ có tác dụng trên bề mặt hệ sợi

 Vùng vô định hình: cellulose có cấu trúc không chặt và dễ bị tác động bởi các yếu tố bên ngoài Khi gặp nước, chúng dễ bị trương phồng lên, enzyme cellulase rất dễ tác động, làm thay đổi toàn bộ cấu trúc của chúng

Chiều dài phân tử cellulose trong vùng vô định hình thường lớn gấp hàng chục lần so với chiều dài của phân tử cellulose kết tinh Các cây gỗ lâu năm thường chứa lượng cellulose kết tinh nhiều, các cây thảo mộc thì ngược lại, chứa nhiều cellulose vô định hình

Hình 2.4 Cấu trúc vi sợi [30]

2.1.3 Cơ chế tác dụng của cellulase

Trong thiên nhiên, thủy phân cellulose có sự tham gia của tất cả ba loại enzyme cellulase như endoglucanase, exoglucanase và β-glucosidase Từ những nghiên cứu riêng rẽ từng loại enzyme đến nghiên cứu tác động tổng hợp của cả ba loại enzyme cellulase, nhiều tác giả đều đưa ra kết luận chung là các loại enzyme cellulase sẽ thay phiên nhau phân hủy cellulose để tạo thành sản phẩm cuối cùng là glucose Có nhiều cách trình bày khác nhau, cách trình bày cơ chế tác động của cellulase do Erikson đưa

ra được nhiều người công nhận hơn cả

Hình 2.5 Cơ chế thủy phân cellulose theo Erikson [2]

2.1.4 Một số ứng dụng phổ biến của cellulase

Cellulase là một trong những enzyme có vai trò rất quan trọng trong quá trình chuyển hóa vật chất hữu cơ có trong thiên nhiên và có ý nghĩa rất lớn trong công nghiệp thực phẩm, bảo vệ môi trường Dù được biết đến chậm hơn rất nhiều so với enzyme amylase và protease, nhưng những nghiên cứu và ứng dụng của cellulase là không ít

Cellulase được ứng dụng để cải thiện gía trị dinh dưỡng của thức ăn gia súc, gia cầm; chế biến thực phẩm; trích ly các chất từ thực vật, từ cây thuốc; đường hóa các phế liệu giàu cellulose để sản xuất ethanol

Trong công nghệ sản xuất bột giấy: trong giai đoạn nghiền cần bổ sung β-1,4-glucanase để làm tăng khả năng nghiền và tiết kiệm 20% năng lượng cho quá trình nghiền cơ học Việc bổ sung endoglucanase và hỗn hợp các hemicellulase, pectinase trước khi nghiền hóa học làm tăng khả năng khuếch tán của hóa chất vào phía trong gỗ và hiệu quả khử lignin

endo-Trong công nghiệp chế biến thực phẩm: trong sản xuất các loại nước quả và nước uống không cồn dựa trên việc trích li dịch quả Bổ sung endoglucanase để tăng hiệu suất trích li dịch quả, giảm bớt độ nhớt, tăng mức cảm quan nước quả Trong sản xuất bia, dưới tác dụng của cellulase hay phức hệ citase trong đó có cellulase, thành tế bào của hạt đại mạch bị phá hủy tạo điều kiện tốt cho tác động của protease và đường hóa

Trong công nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi: nguồn thức ăn cung cấp năng lượng cho gia súc và gia cầm có chứa một phần polysaccharide gồm cellulose, β-glucan là các chất chứa cầu nối β-1,4 glucoside làm tăng độ nhớt trong ruột Vì thế, việc bổ sung cellulase trực tiếp vào thức ăn sẽ làm tăng khả năng đồng hóa thực phẩm trong đường tiêu hóa động vật, tăng khả năng hấp thu và chuyển hóa thức ăn của động vật

Trong công nghiệp sản xuất dung môi hữu cơ: trong giai đoạn đường hóa của quá trình sản xuất ethanol, amylase là thành phần chính trong quá trình thủy phân Tuy nhiên, việc bổ sung một số enzyme như cellulase, hemicelluase sẽ phá hủy tế bào, giúp tăng lượng đường tạo thành và đẩy nhanh tốc độ tiếp xúc của tinh bột với amylase, dẫn tới hiệu suất thu hồi rượu sẽ tăng

Trong lên men tế bào và tái tổ hợp gen: sử dụng cellulase để phá vỡ thành tế bào để tạo tế bào trần, có ý nghĩa rất lớn trong việc tiến hành các kỹ thuật chuyển nạp gen: dung hợp tế bào trần tạo tế bào lai mang đặc điểm của cả tế bào bố mẹ

2.2 Vi khuẩn Bacillus subtilis

Có rất nhiều VSV có khả năng sinh tổng hợp ra enzyme cellulase Trong số đó

có cả vi khuẩn Bacillus subtilis, hệ enzyme của chúng rất phong phú và đa dạng gồm

protease, amylase, glucoamylase, glucanase, cellulase, dextranase, pectinase Vì vậy

Bacillus subtilis đã được ứng dụng khá nhiều trong các ngành công nghiệp đặc biệt là

công nghiệp sản xuất enzyme như protease, amylase, Những nghiên cứu gần đây

cho thấy tiềm năng sản xuất ra enzyme cellulase của Bacillus subtilis là rất lớn [6]

2.2.1 Đặc điểm chung

Vi khuẩn Bacillus subtilis phân bố phổ biến trong đất, đặc biệt trong cỏ khô

nên còn có tên gọi khác là trực khuẩn cỏ khô Là những vi khuẩn gram dương, hình que, ngắn, nhỏ, kích thước (3-5) × 0,6 µm, nhiều khi tế bào nối với nhau thành chuỗi dài ngắn khác nhau hoặc tế bào đứng riêng rẽ Khuẩn lạc khô, không màu hoặc màu xám nhạt, hơi nhăn hoặc tạo ra lớp màng mịn lan trên bề mặt thạch, có mép nhăn bám

chặt vào môi trường thạch Nhiệt độ thích hợp cho Bacillus subtilis sinh trưởng là

lệch tâm, gần tâm nhưng không chính tâm Bào tử có thể sống vài năm đến vài chục

năm Đã có những chứng cứ về việc duy trì sức sống của bào tử Bacillus subtilis trong

200-300 năm

Vi khuẩn Bacillus subtilis có màng nhày giúp vi khuẩn có khả năng chịu đựng

được điều kiện thời tiết khắc nhiệt, vì màng nhày có thể dự trữ thức ăn và bảo vệ vi khuẩn tránh tổn thương khi khô hạn Màng nhày có thể quan sát được khi nhuộm tiêu bản, qua kính hiển vi thấy màng nhày không màu, trong suốt còn tế bào vi khuẩn bắt màu nâu đỏ trên nền tiêu bản xanh hoặc đen

Hình 2.6 Vi khuẩn Bacillus subtilis [29]

2.2.2 Cellulase được sinh tổng hợp từ Bacillus subtilis

Bảng 2.1 Tên và nguồn gốc cellulase từ Bacillus subtilis [24]

Ordered Locus Names: BSU18130

Bacillus

Bảng 2.2 Thuộc tính enzyme cellulase từ Bacillus subtilis [24]

Hình 2.7 Trình tự đoạn gen mã hóa cho enzyme cellulase của Bacillus subtilis [24]

2.3 Sản xuất enzyme nhờ VSV

Mãi đến thế kỷ 18 người ta mới biết về sự tồn tại của VSV trong thế giới sinh vật, tuy nhiên việc ứng dụng các công nghệ có hoạt động của VSV thì có từ rất lâu đời Trong đó công nghệ enzyme từ VSV phát triển rất mạnh, đặc biệt ở thế kỷ 20 đầu thế kỷ 21 Nguồn enzyme này dần thay thế enzyme từ động vật và thực vật do hàng loạt những ưu điểm về sinh lý VSV và về kỹ thuật sản xuất Những ưu điểm đó được tóm tắt như sau: tốc độ sinh sản của vi sinh vật rất mạnh Enzyme thu nhận từ vi sinh vật có hoạt tính rất cao VSV là giới rất thích hợp cho sản xuất theo qui mô công nghiệp Nguồn nguyên liệu dùng cho sản xuất enzyme theo quy mô công nghiệp rẻ tiền và dễ kiếm VSV có thể sinh tổng hợp cùng lúc nhiều loại enzyme khác nhau

Hình 2.8 Sơ đồ quy trình công nghệ sản xuất và kỹ thuật tinh sạch enzyme [2]

Lên men chìm

Sản xuất enzyme không hòa tan

Ứng dụng

Ứng dụng

Sản xuất VSV cố định

Thu nhận chế phẩm enzyme thô

Thu nhận enzyme tinh khiết Tinh sạch enzyme

Ứng dụng

2.3.1 Cơ chế điều hòa sinh tổng hợp enzyme ở vi sinh vật

Hoạt tính của enzyme hay sự tạo thành các enzyme ở vi sinh vật đều tuân theo một qui luật trao đổi chất Qui luật đó là: trong quá trình trao đổi chất, tế bào luôn luôn tìm cho mình một con đường kinh tế nhất và hài hòa nhất Điều này được thực hiện bởi hai cơ chế điều hòa hoạt tính enzyme và điều hòa sự tổng hợp enzyme Cơ chế điều hòa hoạt tính enzyme được thể hiện qua hai cơ chế: điều hòa trấn áp và điều hòa cảm ứng

Điều hòa trấn áp là trong quá trình sinh tổng hợp enzyme xảy ra hiện tượng sản phẩm cuối của phản ứng gây ức chế hay gây trấn áp làm cho tế bào không có khả năng tạo ra enzyme tham gia quá trình tạo ra sản phẩm này nữa

Hình 2.9 Cơ chế điều hòa trấn áp sinh tổng hợp enzyme bởi sản phẩm cuối cùng [2]

Điều hòa cảm ứng là làm tăng khả năng sinh tổng hợp enzyme Trong tế bào vi sinh vật tồn tại hai loại enzyme Một loại luôn luôn được tổng hợp ra, không phụ thuộc vào chất mà chúng tham gia phản ứng Một loại chỉ được tạo ra với số lượng nhỏ nếu không có mặt chất mà chúng tham gia phản ứng Khi ta cho chất tham gia phản ứng (gọi là cơ chất) vào môi trường, sự tạo thành enzyme sẽ tăng rất nhanh Monod và Cohn (1952) gọi loại enzyme này là enzyme cảm ứng

Hình 2.10 Cơ chế điều hòa cảm ứng sinh tổng hợp enzyme [2]

Như vậy khi không có cơ chất, chất kìm hãm có trong tế bào sẽ tương tác với gen điều khiển, toàn bộ quả trình tổng hợp enzyme sẽ bị phong tỏa và không hoạt động Khi ta cho cơ chất vào môi trường lên men, cơ chất sẽ tương tác với chất kìm hãm, gen điều khiển thoát khỏi sự phong tỏa của chất kìm hãm và các gen tương ứng

Enzyme được tổng hợp ra sẽ phân hủy cơ chất

Muốn điều khiển quá trình sinh tổng hợp enzyme bằng cơ chất cảm ứng phải chú ý hai điểm:

 Thứ nhất, muốn thu nhận enzyme cảm ứng nào thì phải cho cơ chất cảm ứng của enzyme đó vào môi trường Ví dụ: muốn thu nhận amylase thì phải cho tinh bột, muốn thu nhận protease thì phải cho protein, muốn thu nhận pectinase thì phải cho pectin, muốn thu nhận cellulase thì phải cho cellulose Tương tự như vậy ta tiến hành thu nhận các enzyme cảm ứng khác cùng theo nguyên tắc trên

đó Vượt quá liều lượng này, khả năng sinh tổng hợp sẽ giảm Do đó không phải càng cho nhiều cơ chất, khả năng sinh tổng hợp càng cao

2.3.2 Phương pháp lên men vi sinh vật thu nhận enzyme hòa tan

Trong công nghiệp sản xuất enzyme trên thế giới đang tiến hành hai phương pháp: phương pháp lên men bề mặt và phương pháp lên men chìm Phương pháp lên men bề mặt đã được nghiên cứu và phát triển mạnh mẽ trong những năm đầu thế kỉ

XX Sau đó, phương pháp lên men chìm được thay thế vào những năm 50-60 của thế

kỉ XX Nhưng phương pháp lên men bề mặt lại được phục hồi rất mạnh mẽ từ những năm 1970 đến nay Mỗi phương pháp đều có những thế mạnh và yếu điểm riêng, tùy

theo từng mục đích mà ta sẽ chọn phương pháp lên men hiệu quả

Phương pháp lên men bề mặt: là phương pháp tạo môi trường cho vi sinh vật

phát triển trên bề mặt môi trường Trong nuôi cấy bề mặt người ta sử dụng môi trường

lỏng hoặc sử dụng môi trường đặc (bán rắn) [2]

Phương pháp lên men chìm: là phương pháp ở đó VSV phát triển hẳn trong

lòng môi trường [2] Phương pháp này được sử dụng trong nghiên cứu của đề tài

Phương pháp lên men chìm có những ưu điểm cơ bản sau:

 Phương pháp lên men chìm thường cần ít diện tích Quá trình lên men thường được thực hiện trong các thiết bị lên men Các thiết bị lên men thường rất gọn

 Phương pháp lên men chìm có thể tự động hóa và cơ giới hóa ở mức độ cao Trong lên men chìm thường phải thiết lập hệ thống cánh khuấy và hệ thống thổi khí Kiểm soát quá trình thổi khí bằng hệ thống tự động hoàn toàn có thể thực hiện được với bất kỳ dung tích nào của thiết bị lên men Ngoài ra, ta còn

có thể kiểm soát được nhiệt độ và điều hòa sự thay đổi nhiệt độ bằng hệ thống điều khiển tự động

 Phương pháp lên men chìm có thể thực hiện liên tục bằng hệ thống nhiều thiết

bị lên men nối tiếp nhau Do đó, việc kiểm soát chất lượng lên men trở nên rất

dễ dàng

Quá trình lên men chìm có thể thực hiện theo ba phương pháp: lên men theo chu kỳ (batch), lên men theo chu kì có bổ sung (fed-batch) hay lên men liên tục Phương pháp lên men theo chu kì đơn giản, dễ thực hiện, tuy nhiên hiệu suất không cao do sự tích lũy cơ chất, độc chất Phương pháp lên men theo chu kì có bổ sung có thể khắc phục được nhược điểm này, tuy nhiên sự tự động hóa không cao Lên men liên tục có ưu điểm ở khả năng tự động hóa cao nhưng đòi hỏi kỹ thuật phức tạp và phải tiệt trùng liên tục

2.3.3 Thiết bị lên men (Fermenter New Brunswick Co Bioflo 110)

Thiết bị lên men đóng vai trò rất quan trọng trong công nghệ vi sinh vật Đây là một lĩnh vực rất phức tạp và nhiều trường hợp thay đổi thiết bị lên men hợp lý sẽ thu được kết quả lên men rất tốt Việc thiết kế chế tạo thiết bị lên men có ảnh hưởng rất lớn đến quá trình sinh lý của vi sinh vật

Một thiết bị lên men hoàn chỉnh sẽ là tổ hợp của nhiều hệ thống có kiểm soát:

Hệ thống cánh khuấy, hệ thống thổi khí,

BioFlo 415 BioFlo 510 (7 đến 19.5 lít) (19.5 đến 40 lít)

BioFlo 610 BioFlo Pro (65 đến 125 lít) (75 đến 3.000 lít)

Hình 2.11 Một số thiết bị lên men của New Brunswick Co [26]

2.3.3.1 Thiết bị có hệ thống thổi khí

Thiết bị có hệ thống thổi khí chỉ sử dụng trong các quá trình lên men hiếu khí

Hệ thống thổi khí được lắp đặt trong các thiết bị lên men có những tác dụng sau:

 Giúp cung cấp oxy trong các trường hợp lên men hiếu khí, đặc biệt là quá trình thu nhận sinh khối (nấm men, nấm sợi hay vi khuẩn)

 Làm tăng khả năng tiếp xúc giữa chất dinh dưỡng và tế bào vi sinh vật

 Làm tăng khả năng hòa tan của oxy với trường hợp lên men trong điều kiện hiếu khí

2.2.4.3 Fermenter New Brunswick Co Bioflo 110

Fermenter Bioflo110 (New Brunswich Co., Inc., NJ, Mỹ) là hệ thống lên men

có tính năng hiện đại, giao diện dễ sử dụng Hệ thống được trang bị đầu dò pH, oxy hòa tan (DO), bộ điều khiển tốc độ khuấy và nhiệt độ pH được đo bằng đầu dò thuỷ tinh (Ingold) và điều khiển nhờ bộ điều khiển; Proportional/ Integral/ Derivative (PID) Đầu dò DO (Ingold) được sử dụng để đo oxy hoà tan Điều khiển PID kiểm soát tốc độ khuấy trộn Nhiệt độ môi trường được đo nhờ đầu dò platinium (Resistance Temperature Detector, RTD) và điều khiển bởi PID

Ngoài ra còn có bơm nhu động được gắn với hệ thống để cung cấp giống và các thành phần cần thiết khác trong quá trình lên men Không khí vô trùng được cung cấp nhờ máy nén khí và điều chỉnh lưu lượng nhờ đồng hồ đo lưu lượng Headplate (mâm nhập liệu) được thiết kế với nhiều cổng dành cho các đầu dò pH, oxy, ống nhập liệu, ống lấy mẫu, khí thải (ngưng tụ) Tất cả được điểu khiển và hiển thị qua bộ điều khiển trung tâm (Primary Control Unit, viết tắt là PCU) PCU là trung tâm điều khiển cho tất cả các vessel được kết nối và các bộ điều khiển khác

Hình 2.12 Hệ thống Fermenter Bioflo 110 (New Brunswich Co., Inc., NJ, Mỹ) [26]

Hình 2.13 Thiết kế headplate [26]

2.4 Enzyme cố định

Theo phương pháp cổ điển: enzyme được sử dụng ở dạng enzyme hòa tan trong dung dịch phản ứng và sự tiếp xúc giữa enzyme (E) và cơ chất (S) cũng xảy ra trong dung dịch:

 Enzyme hòa tan chỉ sử dụng được một lần, mặc dù enzyme được hoàn lại sau phản ứng, do đó hiệu quả kinh tế không cao

 Sau phản ứng, enzyme bị lẫn trong sản phẩm cuối làm hạn chế độ tinh sạch của sản phẩm

Do đó, việc sử dụng lại các enzyme và tách các enzyme ra khỏi sản phẩm sau phản ứng, đặc biệt quan trọng nhất đối với những enzyme đắt tiền và các sản phẩm cần có độ tinh sạch cao (sử dụng trong y dược học) Từ đó, người ta đưa ra phương pháp cố định tạo enzyme không hòa tan

2.4.1 Định nghĩa

Theo Trevan, thuật ngữ enzyme cố định (immobilized enzyme, insoluble enzyme) được hiểu là đưa enzyme vào những pha riêng rẽ Pha này được tách riêng với pha dung dịch tự do Pha enzyme thường không tan trong nước và được gắn với những polymer ưa nước có trọng lượng phân tử lớn

2.4.2 Ưu điểm của enzyme cố định

 Enzyme không tan có thể được sử dụng nhiều lần do chúng có độ bền vững tương đối cao, do đó hiệu quả kinh tế cao, tiết kiệm enzyme, đặc biệt quan trọng đối với những enzyme đắt tiền

 Enzyme không tan dễ tách ra khỏi hỗn hợp phản ứng, do đó sản phẩm thu được

có độ tinh khiết cao, giảm bớt quá trình tinh sạch

 Có thể điều chỉnh vận tốc phản ứng theo ý muốn dễ dàng, có thể ngừng phản ứng ở bất kỳ giai đoạn nào hoặc có thể tạo sản phẩm trung gian theo mong muốn

 Gắn đồng thời nhiều enzyme của một chuỗi phản ứng liên tục lên chất mang nên có thể thực hiện các chuỗi phản ứng trong cùng một thời gian

 Việc gắn enzyme tạo điều kiện dễ dàng cho cơ khí hóa và tự động hóa các quá trình sản xuất

 Độ bền của enzyme không tan cao hơn hẳn enzyme hòa tan, do đó trong nhiều trường hợp có thể cho enzyme không tan hoạt động ở các điều kiện

pH, nhiệt độ không bình thường Điều này rất có lợi trong các quy trình sản xuất công nghiệp

2.4.3 Các phương pháp cố định enzyme

Về cơ bản, có ba phương pháp truyền thống cố định enzyme: tạo liên kết với chất mang, nhốt enzyme và tạo liên kết chéo Các phương pháp cố định enzyme hòa tan và không hòa tan được tóm tắt theo sơ đồ sau:

Hình 2.14 Sơ đồ phân loại các phương pháp cố định enzyme [2]

2.5 Phương pháp tạo liên kết chéo

Phương pháp này tạo ra các phức enzyme liên kết chéo với nhau trong không gian ba chiều và trở nên không tan thông qua một chất hoạt động đa chức liên kết cộng hóa trị với các phân tử enzyme Các chất hoạt động đa chức này thường là glutaraldehyde, 3-aminopropyltriethoxysilane[19]

Đại diện cho cách làm này là hai phương pháp: cross-linked enzyme crystal (CLEC) và cross-linked enzyme aggregate (CLEA), chúng tạo ra enzyme cố định với

độ tập trung enzyme cao, sự ổn định cao và chi phí sản xuất thấp nhờ sự loại trừ chất mang (đắt tiền)

Các phương pháp cố định enzyme

Các phương pháp cho enzyme hòa tan

Các phương pháp cho enzyme không hòa tan

Phương pháp nhốt enzyme

Tạo liên kết chéo

Nhốt enzyme

trong hệ sợi

Tạo màng bọc

Hấp phụ vật lý Liên kết ion Liên kết kim loại Liên kết đồng hóa trị

Cross-linked enzyme aggregate là phương pháp nghiên cứu của đề tài, chất liên kết được sử dụng là glutaraldehyde

2.5.1 Giới thiệu glutaraldehyde

187°C Đó là chất lỏng dạng dầu, không màu, có mùi hăng, có thể hòa tan trong nước, rượu hoặc benzen

Glutaraldehyde có tên quốc tế là Pentane-1,5-dial, ngoài ra nó còn có các tên gọi khác Pentanedial, Glutardialdehyde, Glutaric acid dialdehyde, Glutaric aldehyde, Glutaric dialdehyde, 1,5-Pentanedial

Glutaraldehyde thường được sử dụng để khử trùng thiết bị y tế và nha khoa và cũng được dùng để xử lý nước công nghiệp và như một chất bảo quản hóa học Trong công nghệ enzyme glutaraldehyde còn được dùng để hoạt hóa chất mang

Hình 2.15 Cấu tạo hóa học của glutaraldehyde [28]

Hình 2.16 Mô hình 3D của phân tử glutaraldehyde (màu xám-cacbon, màu đỏ-oxy, màu trắng-hydro) [28]

2.5.2 Phương pháp cross-linked enzyme aggregate (CLEA)

Phương pháp này là sự kết tủa enzyme từ dung môi nước bằng cách bổ sung muối hoặc dung môi hữu cơ, các phân tử protein sẽ kết hợp với nhau theo tương tác vật lý Việc kết hợp theo tương tác vật lý này được thực hiện bởi liên kết hydro mà không làm thay đổi cấu trúc bậc ba, cũng như không làm biến tính protein Những liên kết chéo của khối enzyme này giữ cho khối enzyme ở trạng thái không tan một cách bền vững bằng cách duy trì siêu cấu trúc hình thành trước đó và tăng hoạt tính xúc tác của chúng

Hình 2.17 Phương pháp CLEA

Liên kết giữa glutaraldehyde và protein

Góc –CHO của phân tử glutaraldehyde sẽ liên kết với bất kì phân từ protein

nước Đối với enzyme, phần còn lại của enzyme vẫn giữ được hoạt tính, đồng thời enzyme còn được cố định trên phân tử glutaraldehyde Như vậy nếu có (n+1) phân tử enzyme tham gia phản ứng thì sẽ có (n+1) phân tử nước được tách ra và có (n+1) liên kết chéo được hình thành giữa enzyme và glutaraldehyde (hình 2.19)

Hình 2.18 Phản ứng polyme hóa glutaraldehyde

Hình 2.19 Phản ứng giữa poly(glutaraldehyde) với amin của protein [27]

là 0,48 mg/ml pH tối ưu cho việc cố định là 5,0, gần pI của enzyme Nồng độ glutaraldehyde 3% là tốt nhất Enzyme cố định sẽ chịu được nhiệt tốt hơn enzyme tự

Cố định cellulase từ Aspergillus niger trên Electrospun Nanofibrous Membrane

để thủy phân cơ chất carboxymethyl cellulose [17] Trong nghiên cứu này, màng sợi nano (nanofibrous), được tạo bởi poly(acid anhydride acrylonitrile-pha-maleic) (PAN-

b-MA), chứa nhóm anhydride để cố định cellulase từ Aspergillus niger Đường kính

các sợi nano trung bình là 150 - 300 nm được hình thành bằng FESEM, liên kết cộng hóa trị hình thành giữa các phân tử enzyme và màng nanofibrous bằng cách sử dụng FTIR Hiệu suất cố định của enzyme trên sợi nano đạt 40%, và các hoạt tính cụ thể là

450 U/g vật liệu Enzyme cố định có khả năng chịu nhiệt cao hơn enzyme tự do Hoạt tính enzyme còn 60% sau 6 lần phản ứng theo mẻ lặp lại

Cố định cellulase trên silica (SBA-15) (Anri Takimoto và cộng sự) [27] Enzyme cellulase được chứa trong vật liệu silica (SBA-15: Santa Barbara silic vô định hình-15) có kích thước lỗ khác nhau (đường kình 5,4-11 nm) Số lượng cellulase chứa đựng bên trong tăng với sự gia tăng kích thước lỗ rỗng của SBA - 15 Tuy nhiên, nhốt cellulase trên SBA - 15 với kích thước lỗ là 8,9 nm (cel-SBA - 15/8,9 nm) cho hoạt tính của enzyme cao nhất, mặc dù không phải kích thước lỗ rỗng lớn nhất SBA-15/8.9 nm giữ lại khoảng 70% hoạt tính cellulase tự do Điều này cho thấy sự phù hợp giữa kích thước cellulase phân tử với kích thước lỗ rỗng của SBA-15, một yếu tố quan trọng để đạt được hoạt tính enzyme cellulase cố định cao Hơn nữa, sự ổn định trong bảo quản cel-SBA-15/8,9 nm được cải thiện, nó có hoạt tính cao nhất trong tất cả các Cel-SBA-15

 Công nghệ sản xuất enzyme đã đem lại những lợi nhuận khổng lồ cho nhiều quốc gia Tuy nhiên ngành công nghiệp enzyme ở Việt Nam chưa thực sự phát triển

Đề tài chúng tôi thực hiện khảo sát điều kiện lên men thích hợp để lên men chủng

Bacillus subtilis và áp dụng kỹ thuật cross-linked enzyme aggregate để thu nhận chế

phẩm cellulase đạt hiệu suất cao

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG PHÁP

&

VẬT LIỆU THÍ NGHIỆM

3.1 Vật liệu và hóa chất

Bacillus subtilis

Trong đề tài luận văn này, vi sinh vật sử dụng là Bacillus subtilis được cung

cấp bởi phòng Thí nghiệm Công nghệ Sinh học, Khoa Hóa, trường Đại học Bách Khoa, Tp Hồ Chí Minh

Môi trường lên men

 Môi trường thạch hoạt hóa và lên men khuẩn lạc (MT1)

Enzyme thương mại

 Cellusoft L có nguồn gốc từ Novo Nordisk - Đan mạch, được cung cấp bởi công ty Nam Giang, 133 Hồ Văn Huê, quận Phú Nhuận, được bảo quản ở nhiệt

 3,5-dinitrosalicylic acid (DNS): hãng Merck, Đức

 CMC, NaOH, acid Acetic, Lactose (Trung Quốc)

 Thuốc nhuộm Fuchsin, Lugol, tím kết tinh

 Thuốc thử Bradford

3.2 Một số phương pháp chung

3.2.1 Phưong pháp xác định hàm lượng protein (phương pháp Bradford)

Nguyên tắc: Dựa vào sự thay đổi màu xảy ra khi Coomassie Brilliant Blue

G-250 liên kết với protein trong dung dịch acid Thuốc nhuộm liên kết chặt chẽ với các protein, tương tác với cả nhóm kỵ nước và các nhóm mang điện tích dương trên phân

tử protein

Tính kết quả: Từ đồ thị chuẩn với một protein tinh khiết (albumin) trên cơ sở

các giá trị mật độ quang (OD) đo được của mẫu chứa protein cần xác định, ta suy ra hàm lượng protein C (µg/ml) của mẫu cần đo

Hàm lượng protein tính theo công thức:

(CT1) Trong đó:

C – hàm lượng protein dung dịch đo (µg/ml)

3.2.2 Phương pháp xác định hoạt tính cellulase

a Định tính cellulase tạo thành :

Sử dụng phương pháp đo đường kính vòng thủy phân Cho enzyme tác dụng lên cơ chất CMC trong môi trường thạch, cơ chất bị thủy phân, độ đục của môi trường

bị giảm, môi trường trở nên trong suốt Sau đó nhuộm màu bằng thuốc thử Lugol và

đo đường kính vòng thủy phân

b Định lượng cellulase tạo thành:

Nguyên tắc: Phương pháp này dựa trên sự thủy giải cơ chất CMC (sodium

sẽ tạo ra một lượng đường khử, lượng đường khử này sẽ phản ứng với dinitrosalicylic acid và được xác định mật độ quang (OD) ở bước sóng 540 nm

Định nghĩa đơn vị hoạt độ CMCase: Một đơn vị hoạt độ CMCase được định nghĩa

là số lượng enzyme cần thiết để giải phóng ra đường khử (glucose) ở tốc độ µmol/phút dưới các điều kiện thực nghiệm

 Tính hệ số glucose

Hệ số glucose được tính bằng công thức:

W G

G

A A

ml mg C F



Trong đó:

F - hệ số glucose

 Tổng hoạt độ enzyme

(CT3) Trong đó:

3.2.3 Phương pháp tính toán

∑ HL protein ban đầu = Nồng độ protein trong dd ban đầu x V E ban đầu

∑ HL protein cố định = ∑ HL protein ban đầu - ∑ HL protein còn lại

(CT4)

∑ HĐ enzyme ban đầu = Hoạt độ enzyme ban đầu x lượng enzyme ban đầu

∑ HĐ enzyme cố định = Hoạt độ enzyme cố định x lượng enzyme cố định

(CT5)

3.3 Cách tiến hành thí nghiệm

Hình 3.1 Sơ đồ các bước nghiên cứu chung

Giống đông khô

Cấy ria trên đĩa Petri

Khảo sát đặc điểm giống Tăng sinh

3.3.1 Khảo sát đặc điểm sinh học của Bacillus subtilis - đối tượng vi sinh vật

nghiên cứu của đề tài

Mục đích: Khảo sát một số đặc điểm sinh học chính của Bacillus subtilis

Cấy Bacillus subtilis lên môi trường lên men khuẩn lạc sau đó đem ủ ở nhiệt độ

3.3.1.2 Định tính khả năng tổng hợp cellulase của Bacillus subtilis

Hình 3.2 Sơ đồ định tính khả năng sinh cellulase của Bacillus subtilis

Sau khi thu chế phẩm enzyme:

 Tiến hành định tính khả năng tổng hợp cellulase bằng phương pháp đo đường kính vòng thủy phân

 Tiến hành điện di SDS PAGE chế phẩm enzyme cùng mẫu đối chứng protein Bovine Serum Albumin (BSA)

Môi trường MT2 không có CMC

Nhân giống

Bacillus subtilis Cấy giống

Ly tâm 8000vòng/phút

Lên men

Dịch lên men

Chế phẩm enzyme

Định tính cellulase

3.3.1 3 Khảo sát đường cong sinh trưởng của Bacillus subtilis trong giai

đoạn nhân giống

trong 24 h Nhân giống cấp hai: lấy ống giống cấp 1 cho vào 50 ml môi trường cấp 2

đo OD ở bước sóng 600 nm, từ thời điểm nhân giống là thời điểm t = 0, tiến hành trong 2 ngày

3.3.2 Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp enzyme

cellulase của chủng Bacillus subtilis ở điều kiện erlen

3.3.2.1 Khảo sát ảnh hưởng thời gian đến khả năng tổng hợp cellulase

a Mục đích: xác định thời điểm thích hợp để tổng hợp enzyme hoạt tính cao nhất

b Sơ đồ bố trí thí nghiệm: thí nghiệm một yếu tố: thời gian lên men

Hình 3.3 Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng thời gian lên men đến khả năng tổng hợp cellulase

c Phương pháp thực hiện:

Thí nghiệm được tiến hành theo sơ đồ trên Lên men trong điều kiện lắc 180 vòng/phút, nhiệt độ phòng, pH 7 Môi trường lên men lần lượt là MT2 và MT3 ứng với hai trường hợp không cảm ứng CMC và có cảm ứng CMC Lấy mẫu và khảo sát hoạt tính enzyme ở những thời điểm khác nhau Hoạt tính enzyme được xác định bằng phương pháp CMCase

Môi trường MT2

Nhân giống

Bacillus subtilis Cấy giống

Ly tâm 8000vòng/phút